專利名稱：復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白clsp的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白(calmodulin-like skin protein) (CLSP)、該蛋白的肽片段或其類似物在評價(jià)上皮(特別是表皮)的老化狀態(tài)的標(biāo)記中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
上皮是細(xì)胞彼此接合連接且位于基膜上的組織。它們或者形成外部覆蓋層(例如 在皮膚的表面，或者表皮)，或者在粘膜的表面形成內(nèi)部覆蓋層。它們也可以形成腺。更具體地，這些上皮是這樣一種結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡是通過執(zhí)行一套細(xì)微調(diào) 節(jié)的作用于細(xì)胞增殖、遷移和分化以及各種細(xì)胞外基質(zhì)成分合成的所有階段的細(xì)胞內(nèi)和細(xì) 胞外信號產(chǎn)生的。這些信號可以特別地由角化細(xì)胞產(chǎn)生的因子的作用形成。特別地，保持上皮的正常生理功能包括上皮細(xì)胞末端分化和/或蛋白聚糖合成。如特別關(guān)注的表皮，為上皮，一般分為由角質(zhì)形成細(xì)胞形成的基底層，所述角質(zhì) 形成細(xì)胞特別含有皮膚干細(xì)胞并構(gòu)成表皮的生發(fā)層；由位于所述基底層上的多層的多角細(xì) 胞構(gòu)成的“棘狀”層；含有一至三層的所謂扁平形細(xì)胞(含有特殊的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物、透明角 質(zhì)顆粒)的“顆?！睂樱蛔詈笫且唤M上層細(xì)胞，稱為角質(zhì)層(或角化層)，由處于分化末期的 角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成，稱作角化細(xì)胞(corneocytes)。在有機(jī)體和環(huán)境之間起屏障作用的皮膚的最外部分的角質(zhì)層，以及構(gòu)成頭發(fā)的頭 部的毛囊的新生部分的毛干都是角質(zhì)形成細(xì)胞分化的結(jié)果。表皮分化是來自基底層分化和 遷移的角質(zhì)形成細(xì)胞的成熟過程從而導(dǎo)致角化細(xì)胞的形成的結(jié)果，角化細(xì)胞是完全角質(zhì)化 的死亡細(xì)胞。這種分化是理想調(diào)整現(xiàn)象的結(jié)果，使表皮的厚度保持不變，從而保證表皮的動
態(tài)穩(wěn)定。許多皮膚失調(diào)或病態(tài)狀況可能是因?yàn)楸砥討B(tài)穩(wěn)定的功能障礙導(dǎo)致的。因此，對于老化的皮膚，這種功能障礙通常表現(xiàn)為出現(xiàn)皺紋(微小的和深的皺 紋)、失去彈性、粗糙感和干燥。從組織學(xué)的角度看，觀察到了真皮-表皮的平坦交界和真皮 厚度和表皮厚度的下降。膠原和糖胺聚糖含量下降。皮膚屏障功能受損。長期受陽光照射 會加重所有這些現(xiàn)象。同樣地，在婦女的絕經(jīng)期這種功能障礙會更加惡化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明特別地以角質(zhì)層中的復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白CLSP為特征，還發(fā)現(xiàn) 該蛋白的表達(dá)在上皮的時序老化(chronological ageing)過程中被差異地調(diào)整。CLSP是結(jié)合鈣的蛋白，屬于鈣調(diào)蛋白族，其前體形式包括146個氨基酸。其分子量 約為16kDa，與鈣調(diào)蛋白的氨基酸序列同源性約為52%。CLSP的結(jié)構(gòu)包括4個潛在的“EF-hand”鈣結(jié)合位點(diǎn)、潛在的N-糖基化位點(diǎn)、多個 潛在的磷酰化位點(diǎn)和十四烷基化位點(diǎn)。
CLSP與鈣的結(jié)合引起了其構(gòu)象的改變，從而使其活化，特別是使其能夠與各種目 標(biāo)蛋白相互作用。已經(jīng)證明在光誘導(dǎo)老化的過程中編碼CLSP的mRNA增加(Urschitz，J. et al.， J. Invest. Dermatol.，2002，119 :3_13)，S卩，光誘導(dǎo)老化是由于皮膚反復(fù)地暴露于陽光下而 引起的，這是與時序老化截然不同的過程，時序老化就是與時間流逝相關(guān)的生理性老化。作為其一部分，文獻(xiàn)US 2004/0142335觀測到通過轉(zhuǎn)錄組序列分析(transcriptome analysis)，與年輕個體相比，老年個體的皮膚中編碼CLSP蛋白的mRNA的 表達(dá)增加。因此，CLSP可能特別參與了角質(zhì)形成細(xì)胞末端分化過程(B.Mehul et al., J.Biol. Chem. , 2000, Apr. 28 ；275 (17) 12841-7)、(EP 1204744)。最近，本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)老年人表皮的角質(zhì)層中特殊形式的CLSP表達(dá) 減少。非常明顯地，發(fā)明人表征的形式對應(yīng)于與迄今為止研究過的CLSP形式(特別是與上 述的不同)不同的蛋白成熟階段。如下面所表現(xiàn)的，發(fā)明人使用特殊的ELISA測定技術(shù)表征了其復(fù)合形式，特別是 下文中實(shí)施例1所描述的復(fù)合形式。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及至少一種復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋 白(或CLSP)的在作為特別是在體外或離體情況下表征上皮(特別是表皮)時序老化的狀 態(tài)的工具中的應(yīng)用，所述復(fù)合形式至少部分來自于具有以下氨基酸序列的多肽，所述氨基 酸序列全部或者部分由SEQ ID NO 1表示的核酸序列或其類似物或片段編碼?！皶r序老化”在本發(fā)明中的含義是將持續(xù)暴露于太陽或U. V.下的一種皮膚現(xiàn)象 (即光導(dǎo)致的皮膚老化)排除本發(fā)明的范圍。就本發(fā)明而言，術(shù)語“復(fù)合形式”包括CLSP蛋白或其衍生物與其它不同于CLSP的 蛋白或其片段，或者其它CLSP蛋白或其片段的任何結(jié)合物。就本發(fā)明而言，術(shù)語“CLSP蛋白的衍生物”表示其片段或下面定義的類似物。特別地，復(fù)合形式可以來自于完整的CLSP蛋白或其片段與其自身或它的一個片 段或與目標(biāo)蛋白，或者甚至與例如角質(zhì)層中蛋白水解的角化層的蛋白結(jié)構(gòu)的結(jié)合。因此，根據(jù)第一種變體，本發(fā)明涉及的復(fù)合形式可以是CLSP蛋白或這種蛋白的兩 種相同或不同的肽片段的結(jié)合的二聚體形式。根據(jù)另一種變體，這種復(fù)合形式可以為由CLSP蛋白或其片段與二級目標(biāo)蛋白的 結(jié)合得到的產(chǎn)物。為了說明這些能夠與CLSP和/或其片段結(jié)合的目標(biāo)蛋白，可以特別提及 的是14. 3. 3β 多肽、14. 3.3 σ、膜聯(lián)蛋白(Annexins) II 和 V、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulins)、 ERp72、核仁素、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3、MAGEDl (黑素瘤抗原基因Dl)、PPP4C (蛋白磷酸酶4)和 USF2(上游轉(zhuǎn)錄因子2)。這些能夠與CLSP和/或其片段結(jié)合的目標(biāo)蛋白還可以為例如 YWHAQ基序(14. 3. 3 τ)的肽基序。出乎意料的是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將角質(zhì)層中的這些復(fù)合形式量化可以作為 確定對應(yīng)的表皮狀態(tài)的有效而可靠的方法。如上所述，在時序老化的過程中觀察到了這些 復(fù)合形式表達(dá)的減少。在這方面，根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合形式的減少顯示出表皮的時序老化的狀態(tài)。因此，這些復(fù)合形式的表征特別用于建立表皮狀態(tài)的診斷。
關(guān)于這種診斷，可以方便地為個體提供最特別地適合于所述個體的特點(diǎn)的美容處 理。很顯然，使用者會特別期待和喜歡這種個性化美容處理。本發(fā)明滿足了這種需求。根據(jù)其另一方面，本發(fā)明涉及一種用于表征(特別是在體外或離體)表皮的時序狀態(tài)的非侵害的(特別是美容用的方法)方法，該方法至少包括定性或定量表征所述表皮 的角質(zhì)層中至少一種本發(fā)明的CLSP復(fù)合形式的表達(dá)。根據(jù)一種不同的實(shí)施方式，可以將通過這樣的方法得到的數(shù)據(jù)或值與參考數(shù)據(jù)或 值相比較進(jìn)行評估，例如，該參考數(shù)據(jù)或值可以從與待表征的對象不同的狀態(tài)已知的至少 一種上皮，特別是表皮獲得。根據(jù)一個方面，本發(fā)明涉及一種用于表征上述定義的表皮的時序狀態(tài)的方法，其 中，通過本發(fā)明所述的復(fù)合形式的減少表示時序老化的狀態(tài)。根據(jù)另外的方面，本發(fā)明還涉及一種用于表征(特別是在體外或離體)美容性的 或治療性的處理的有效性的非侵害性(尤其是美容的)方法，所述處理用于防止和/或治 療與個體的時序老化相聯(lián)系的皮膚老化的跡象，例如，皺紋或細(xì)紋，該方法至少包括定性或 定量表征至少一種本發(fā)明的CLSP復(fù)合形式。術(shù)語“皮膚老化的跡象”是指所有由時序老化引起的皮膚外觀的改變，例如，皺紋 和細(xì)紋、皮膚皺縮、缺乏彈性和/或皮膚緊張、真皮變薄和/或膠原纖維退化，從而導(dǎo)致看上 去皮膚松馳和皺縮。本發(fā)明的皮膚老化的跡象是指那些與皮膚時序老化有關(guān)的或由皮膚時序老化導(dǎo) 致的皮膚老化的跡象。尤其是，本發(fā)明的皮膚老化的跡象不同于那些與光導(dǎo)致的皮膚老化有關(guān)的或由光 導(dǎo)致的皮膚老化導(dǎo)致皮膚老化的跡象。本發(fā)明的“光導(dǎo)致的老化”特別是由于上皮暴露在U. V(尤其是暴露在U. V. A.)中 導(dǎo)致的自由基生成、蛋白質(zhì)糖基化或一些細(xì)胞表面受體的過分激活造成的對組織水平、彈 性纖維的厚度的氧化損害。因此，本發(fā)明是針對于預(yù)防和/或處理與皮膚時序老化有關(guān)的皮膚的表現(xiàn)，而不 是針對于預(yù)防和/或處理與U. V暴露有關(guān)的皮膚的表現(xiàn)。本發(fā)明特別是針對于由于細(xì)胞的損失和細(xì)胞衰老導(dǎo)致皮膚時序老化的表現(xiàn)。此外，在上皮細(xì)胞水平的時序老化表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的端粒減少、由于激素(例如， DHEA或生長因子的缺乏)缺乏或者由于細(xì)胞受體數(shù)量的減少導(dǎo)致的細(xì)胞刺激的減少；在組 織水平，表現(xiàn)為彈性纖維的消失。這些現(xiàn)象與U. V暴無關(guān)，因此，與光導(dǎo)致的皮膚老化無關(guān)。隨后于皮膚時序老化的細(xì)胞和組織的缺乏可能導(dǎo)致干燥病、上皮松馳、皺紋和/ 或細(xì)紋、皮膚松馳、脂漏性角化痣(seborrheic keratose)或櫻桃狀(cherry)血管瘤。特別地，上述方法可以至少包括如下步驟i.提供所述個體的至少一份代表性的第一皮膚表面樣品；ii.特別地通過ELISA測定技術(shù)(并且特別是下面的實(shí)施例1所描述的方法)定 量所述樣品中至少一種本發(fā)明的復(fù)合形式；iii.在所述個體的代表性的第二皮膚表面樣品上重復(fù)步驟i和ii ；以及iv.將在結(jié)束步驟ii和iii后得到的結(jié)果對比，特別地，以從中得出關(guān)于處理的至少一種效果的信息，其中，所述第一和第二皮膚表面樣品分別對應(yīng)于不同的處理階段。所述參考值，或步驟ii中得到的數(shù)據(jù)，可以是從上皮獲得的數(shù)據(jù)，特別是從來自這樣的個體的表皮的上皮獲得的數(shù)據(jù)，即在進(jìn)行所述處理之前，或者距離處理開始日期很 短的時間內(nèi)接受處理的受試者。根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述第一樣品代表護(hù)理前狀態(tài)，所述第二樣品代表護(hù) 理過程中的狀態(tài)或護(hù)理后的狀態(tài)。根據(jù)一種不同的實(shí)施方式，本發(fā)明涉及上述方法中的一種，其中，復(fù)合形式的增加 表明對皮膚老化跡象的護(hù)理是有效的。根據(jù)一種不同的實(shí)施方式，上述方法中的一種還可以包括在表征CLSP的復(fù)合形 式的步驟結(jié)束后，進(jìn)行至少一個附加步驟，目的在于對所述個體施用護(hù)理組合物，特別是美 容護(hù)理組合物，根據(jù)由所述復(fù)合形式得到的信息確定和選擇該組合物。所述附加步驟可以 連續(xù)于所述特征步驟。根據(jù)一種實(shí)施方式，這種組合物還可以選自許多組合物，后者中的每種均特別適 于由本發(fā)明的方法得到的信息的類型。因此，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供一種簡單和快速的方法，首先，用于表征上皮的生理狀 態(tài)，特別是皮膚表皮的上皮的生理狀態(tài)；其次，用于相應(yīng)地調(diào)整適用于皮膚的上皮或表皮的處理。本發(fā)明的方法可以在體外、離體或體內(nèi)進(jìn)行。由如下描述可以看出，本發(fā)明的方法特別的優(yōu)勢在于其實(shí)施的過程中不需要侵害 性的步驟。這是由于本發(fā)明的發(fā)明人將用于老化的這些新型生物標(biāo)記定位于角質(zhì)層，從而可 以通過簡單的局部取樣定量或定性地表征所述標(biāo)記的表達(dá)。優(yōu)選地，該方法可以在待研究的個體的角質(zhì)層樣品上通過簡單地剝離進(jìn)行。例如， 取樣的方法可以為包括對待研究的上皮(例如，表皮)施用一部分粘性膠帶的剝離技術(shù)。揭 開該粘性膠帶，則取得部分上皮(例如，表皮部分)的樣品。提取蛋白后，通過本發(fā)明所述 的ELISA測試方法分析所述樣品。根據(jù)另一方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的至少一種復(fù)合形式的應(yīng)用，該應(yīng)用作為篩 選能夠調(diào)節(jié)，特別是促進(jìn)，這些復(fù)合形式的增加和/或穩(wěn)定性和/或生物活性的生物學(xué)化合 物和化學(xué)化合物的工具。特別地，涉及一種篩選抗老化活性劑的方法，該方法至少包括如下步驟a)在適于顯示所述復(fù)合形式表達(dá)的條件下，使至少一種含有至少一種本發(fā)明的復(fù)合形式的細(xì)胞類型與至少一種測試化學(xué)化合物或生物化合物接觸；以 及b)確定至少一種所述復(fù)合形式的含量；c)將由步驟b)確定的所述含量與不存在測試化學(xué)化合物或生物化合物時確定的 所述復(fù)合形式的含量相比較。根據(jù)一種不同的實(shí)施方式，本發(fā)明涉及一種上述方法，其中，本發(fā)明的復(fù)合形式的 增加表示活性劑具有抗老化性質(zhì)。因此，優(yōu)選地，在步驟C)之后，還可以進(jìn)行選擇活性劑的步驟，對于所述活性劑觀測到本發(fā)明的復(fù)合形式的含量增加。根據(jù)最后一個方面，本發(fā)明涉及有效量的本發(fā)明的復(fù)合形式的美容用途，該用途 是作為用于防止和/或應(yīng)對皮膚老化跡象的試劑。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及有效量的本發(fā)明的復(fù)合形式的美容用途，其中，該用 途是防止和/或處理表皮變薄和/或失去緊致(firmness)、彈性、密度和/或表皮緊張和/ 或起皺紋和細(xì)紋。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及有效量的本發(fā)明的復(fù)合形式或者至少一種調(diào)節(jié)所述復(fù)合形式形成的試劑的用途，該用途是制備和/或改善復(fù)層(pluristratified)細(xì)胞模型， 特別是重建的皮膚模型。根據(jù)又一個方面，本發(fā)明涉及制備分離的重建皮膚的方法，該方法至少包括使本 發(fā)明的至少一種復(fù)合形式與能夠生成分離的重建皮膚的細(xì)胞(特別是角質(zhì)形成細(xì)胞)接 觸。CLSP的“復(fù)合形式”的定義 如上所述，本發(fā)明的復(fù)合形式至少一部分來自于具有以下氨基酸序列的多肽，所 述氨基酸序列全部或部分由SEQ ID NO 1或其類似物或片段表示的核酸序列編碼。復(fù)合形式的CLSP可以尤其是由至少完整的CLSP蛋白或其片段與它本身或者其片 段，或與至少一種靶蛋白、甚至與至少一種例如角質(zhì)層中的蛋白水解角化層的蛋白結(jié)構(gòu)的 結(jié)合導(dǎo)致的多聚體。本發(fā)明的CLSP片段是其長度和活性適合用于本發(fā)明的復(fù)合物形式的片段。更尤其是，復(fù)合形式的CLSP可以二聚體，更尤其是完整的CLSP同型二聚體或其片 段。根據(jù)一個特別的實(shí)施方式，本發(fā)明的二聚體可以包括由完整的CLSP蛋白或其片 段表示的第一單體和不同于完整的CLSP蛋白或其片段的結(jié)構(gòu)所表示的第二單體。適合本發(fā)明的不同于完整的CLSP蛋白或其片段的結(jié)構(gòu)所表示的單體的實(shí)例可以 提及的是上述的能夠與完整的CLSP蛋白或其片段形成二聚體的蛋白和其片段。根據(jù)另一個特別的實(shí)施方式，適合用于本發(fā)明的復(fù)合形式可以包括來自于CLSP 和不同于完整的CLSP (尤其是不同于氨基酸序列由SEQ ID NO 1表示的核酸序列編碼的) 的肽。尤其是，適合于本發(fā)明的來自于CLSP的肽可以是CLSP的片段，更尤其是由SEQ ID NO 1表示的核酸序列編碼的蛋白片段，所述片段具有適當(dāng)長度和活性，適合用于本發(fā)明的 復(fù)合形式。就本發(fā)明而言，表達(dá)“核酸序列的片段”是指部分地編碼本發(fā)明的復(fù)合形式的核酸 序列或其類似物，特別是由SEQ ID NO 1或其類似物表示的核酸序列。表達(dá)“核酸序列的類似物”是指任選地由核酸編碼簡并得到的，并且編碼具有與由 所述核酸序列編碼的多肽相同或類似的序列的復(fù)合形式的至少一部分的任何核酸序列。所述核酸序列可以來自于任何可能的起源，S卩，可以是動物，特別是哺乳動物，更 特別是人類，或者植物，或者來自于微生物(包括病毒、噬菌體、細(xì)菌和其它的事物)或來自 于真菌，不用預(yù)先判斷它們是否天然地存在于所述起源的有機(jī)體內(nèi)。根據(jù)一種不同的實(shí)施方式，本發(fā)明的復(fù)合形式可以是可溶性的。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“可溶性的”是指本發(fā)明研究的復(fù)合的肽不需要離液劑 (chaotropic agent)或離子型洗滌劑的蛋白變性物質(zhì)能夠在水或水性介質(zhì)中溶解的能力， 例如，與天然的CLSP相比，可以僅在這些試劑的存在下提取。根據(jù)另一種實(shí)施方式，本發(fā)明的復(fù)合形式至少一部分來自于其中氨基酸序列完全 或部分地由SEQ ID NO 2或其類似物或其片段編碼的多肽。就本發(fā)明而言，除非有相反的說明，術(shù)語“CLSP”一般是指具有序列(SEQID NO 2) 的蛋白，該蛋白可以是在25和/或43位置的天冬酰胺殘基上經(jīng)過或不經(jīng)過翻譯后的糖基 化型修飾，磷酸化型修飾和/或十四烷基化型修飾， 能夠改變其表觀分子量或其等電點(diǎn)。此外，已知的是，多肽的一級序列(即其氨基酸的序列)決定被蛋白酶特異性識別 的位點(diǎn)，例如胰酶，其中，當(dāng)這些位點(diǎn)的識別生效時，將通過蛋白水解作用引起多肽的分解。 這種蛋白水解導(dǎo)致各種肽，或蛋白水解片段、復(fù)合形式的CLSP的生成。本發(fā)明的發(fā)明人在角質(zhì)層中檢測到了這種肽的存在。因此，本發(fā)明包括至少具有如下肽序列的CLSP蛋白水解片段的復(fù)合形式SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID N07、SEQ IDNO 8、SEQ ID NO 9、 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID N013、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID N018、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、 SEQ ID NO 22、SEQ ID N023、SEQ ID NO 24 禾口 SEQ ID NO 25。因此，根據(jù)本發(fā)明的一種特殊的實(shí)施方式，本發(fā)明的復(fù)合形式至少來自于氨基酸 序列全部或部分地由選自如下的氨基酸序列表示的多肽SEQ ID NO 3,SEQID NO 4,SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID N07.SEQ ID NO 8、SEQ ID N09、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、 SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID N014、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、 SEQ ID NO 18、SEQ ID N019、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、 SEQ ID N024和SEQ IDNO 25，以及它們的混合物。術(shù)語“多肽的類似物”是指表現(xiàn)出尤其是與所述多肽的特征序列中的一種序列具 有同源性，并且具有相同性質(zhì)的生物活性的任何多肽。這種類似物可以是仿肽劑(ρ印tidomimetic agent)。同源性可以至少為85%，例如，至少為90%，例如，至少為95%。可以通過視覺比 較或通過本領(lǐng)域常用的任何計(jì)算機(jī)工具確定同源性，例如，可以在www. ncbi. ηlm. nill. gov 獲得的BLAST程序，并使用系統(tǒng)設(shè)定的參數(shù)。序列同源性可以來自于由本發(fā)明肽的序列的突變或改變引起的修飾，可以是來源 于本發(fā)明的多肽的特征序列中的一個或多個氨基酸的缺失，或是一種或多種氨基酸的插 入，或是一種或多種氨基酸的替換。就本發(fā)明而言，術(shù)語“片段”是指含有至少4個，至少6個，特別是至少8個，更特 別是至少12個CLSP蛋白的連續(xù)氨基酸，并具有基本相似的生物活性的任何肽部分。一般地，該多肽類似物可以包括保守性取代的天然氨基酸序列。這些修飾中的幾種可以結(jié)合。例如，本發(fā)明中可以考慮的突變可以提及但不限于用具有相似水療指數(shù) (hydropathic index)的氨基酸殘基替換一個或多個氨基酸殘基，而基本上不會影響本發(fā) 明的復(fù)合形式的生物學(xué)特性。
所述水療指數(shù)是根據(jù)其疏水性和電荷賦予氨基酸的指數(shù)(Kyte et al. (1982), J. Mol. Biol.，157 :105)。本發(fā)明包括的復(fù)合形式還可以來自于經(jīng)過一種或多種翻譯后修飾的上面定義的多肽。術(shù)語“翻譯后修飾”包括在肽或蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成后能夠經(jīng)歷的所有修飾，例如， 一次或多次磷酸化、一次或多次硫醇化、一次或多次乙?；⒁淮位蚨啻翁腔?、一次或多 次脂質(zhì)化，例如，十四烷基化；結(jié)構(gòu)重排，例如，形成二硫橋和/或肽序列內(nèi)的分解。此外，所述類似物與天然的多肽具有基本上相同的生物活性。根據(jù)一種實(shí)施方式，適于實(shí)施本發(fā)明的復(fù)合形式還可以來自于天然的或合成的多 肽，能夠通過天然形式的CLSP的酶的或化學(xué)的分解適當(dāng)?shù)氐玫剑蛘咄ㄟ^化學(xué)的或生物的 合成適當(dāng)?shù)氐玫?，或通過從天然地表達(dá)這些復(fù)合形式的生物組織(例如，皮膚)中提取適當(dāng) 地得到；適于實(shí)施本發(fā)明的復(fù)合形式還包括它們的各種翻譯后形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過基于重組DNA的方法獲得本發(fā)明的復(fù)合形式，例如， 在“分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular Cloning-Α Laboratory Manual) ”(Sambrook et al.,1989, Vol. 1-111, Coldspring Harbor Laboratory, Coldspring HarborPress, NY, (Sambrook)第二版)的手冊中描述的方法。根據(jù)另一種實(shí)施方式，適于實(shí)施本發(fā)明的復(fù)合形式還可以和與上述多肽不同的其 它多肽、親水性或疏水性目標(biāo)試劑、生物轉(zhuǎn)化前體或發(fā)光放射性試劑或比色標(biāo)記性試劑溶
I=I O在一種非限定性的方式中，可以提及的作為可以與本發(fā)明的復(fù)合形式結(jié)合的化合 物的實(shí)例是螢光蛋白，例如，綠色螢光蛋白(Green Fluorescent Protein)；螢光化學(xué)化合
物，例如，羅丹明、熒光素或得克薩斯紅 (Texas Red )、磷光化合物；放射性元素，例 如，3H、14C、35S、121I或125I ；或者比色標(biāo)記性試劑，例如，對半乳糖苷酶、對過氧化物、對氯霉素 乙酰基轉(zhuǎn)移酶、對螢光酶或者對堿性磷酸酶敏感的生色物質(zhì)。根據(jù)可以與本發(fā)明的復(fù)合形式結(jié)合的化合物的性質(zhì)，所述結(jié)合可以通過化學(xué)方法 進(jìn)行，特別是通過化學(xué)反應(yīng)性功能團(tuán)(reactive chemical function)或者通過本領(lǐng)域技術(shù) 人員公知的分子生物學(xué)方法進(jìn)行。用于檢測多肽的方法可以提及的是蛋白質(zhì)印跡法、窄縫式點(diǎn)雜交法 (slotblotting)、斑點(diǎn)印跡法、一元或多元型ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定法)、蛋白質(zhì)組法或 糖組學(xué)法、在聚丙烯酰胺凝膠中用銀染色劑、考馬斯藍(lán)或用SYPRO為多肽染色、熒光免疫檢 測法、紫外吸收法、常規(guī)的免疫組織化學(xué)法、電子或共焦顯微鏡法、FRET (熒光共振能量轉(zhuǎn)換 法)、TR-FRET(時間分辨FRET)法、FLIM(熒光壽命成像顯微術(shù))法、FSPIM(熒光光譜成像顯 微術(shù)(fluorescence spectral imaging microscopy))法、FRAP (光脫色焚光恢復(fù)技術(shù))法、 報(bào)道基因法、AFM(原子力顯微術(shù))法、表面等離子體共振法、微量熱法、流式細(xì)胞測量法、生 物傳感器法、放射免疫測定(RIA)法、等電聚焦法和酶法測定，使用肽芯片、糖芯片、抗體芯 片的方法，質(zhì)量光譜測定法、和SELDI-T0F光譜測定法(Ciphergen)。由下面的描述可以看出，本發(fā)明的復(fù)合形式的檢測特別適于使用ELISA法。本發(fā)明的復(fù)合形式的用途，用于判斷表皮的狀態(tài)和/或篩選抗老化活性劑。如上所述，根據(jù)其另一個方面，本發(fā)明涉及用于，特別是離體或在體外的方式，表征非病理性的表皮的狀態(tài)，或者表征美容或治療處理的有效性的非侵害性方法，其目的在于定性或定量地表征至少一部分為CLSP或其衍生物或片段的復(fù)合形式的表達(dá)。這些方法的優(yōu)勢特別在于其實(shí)施不需要受外科技術(shù)的約束以進(jìn)行這樣的表征。下面描述的本發(fā)明的方法可以在例如來自個體的上皮(特別是表皮)的分離樣品 上進(jìn)行。本發(fā)明的方法還可以在上皮樣品上進(jìn)行，特別是來自上皮細(xì)胞模型(特別是表皮 細(xì)胞模型)的表皮的上皮，或者來自重建的分離的皮膚，以確定其狀態(tài)。因而可以通過簡單的剝離得到表皮的提取物，直接通過下面的實(shí)施例1所描述的 ELISA法進(jìn)行分析。所述剝離技術(shù)可以為將粘性表面施加在表皮的表面，例如，來自3M公司的
Blenderm 、D' squam(從CuDERM商購的膠粘劑)或氰基丙烯酸酯膠水。通過這種剝離，
可以對被粘附的角化細(xì)胞及其細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行取樣，然后進(jìn)行提取，從而能夠得到蛋白 成分。取得適合于該方法的樣品的方法還可以更加直接地通過“清洗”皮膚表面進(jìn)行，例 如，通過將專利FR 2667778中描述的葉式水輪機(jī)型或螺旋細(xì)胞型配件與循環(huán)流體結(jié)合，或 者簡單地通過在皮膚表面滴加/去除緩沖劑。為了說明能夠用于實(shí)施本發(fā)明的其它取樣方式，可以提及的是通過雙刀方式或 刮取活組織的方式刮取角質(zhì)層的表層部分。這種方法可以收集鱗屑，然后直接通過各種方 法對其進(jìn)行分析，從而確定其無機(jī)物、氨基酸或脂質(zhì)含量。取樣之后，通過ELISA法對該樣品進(jìn)行表征。這種方法特別地基于使用適于檢測本發(fā)明的復(fù)合形式的抗體。可以通過本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的任何方法獲得能夠用作評價(jià)表皮的狀態(tài)的工具的抗體，如“抗體實(shí)驗(yàn)室手 冊(Antibodies :A Labohtory Manual) ”(美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，紐約冷泉港)中描述的方法。如下面的實(shí)施例1的描述，檢測復(fù)合形式的CLSP的方法特別地需要使用兩種單克 隆抗體，由covalAb公司開發(fā)，即捕獲抗體(克隆DB15C9)和用“sulpho-tag”標(biāo)記的選擇 抗體(CLSP 克隆 DB7gl2)。判斷表皮的狀態(tài)的方法根據(jù)一種實(shí)施方式，用于表征上皮(例如，表皮)的狀態(tài)的方法至少包括如下步 驟a)測定所述上皮的表皮樣品中本發(fā)明的至少一種復(fù)合形式的含量；以及b)將步驟a)測得的含量與參考值比較。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法是非侵害性的。參考值可以例如在取自上皮的表皮樣品上測定的復(fù)合形式的含量，特別是來自正 常皮膚的，即從生理學(xué)角度上看是理想的，例如，年輕人的皮膚。測定參考值可以與測定所述復(fù)合形式的所述含量同時進(jìn)行，也可以隨后進(jìn)行。將測定的含量與參考值比較可以計(jì)算與該值的偏差。對該偏差(負(fù)或正)的大小和/或性質(zhì)的分析可以作為關(guān)于表皮狀態(tài)的信息。表皮狀態(tài)的表征可以表明皮膚障礙的可能性，可以通過使用能夠調(diào)節(jié)本發(fā)明的復(fù)合形式的表達(dá)的化合物而克服該障礙。因此，本發(fā)明的復(fù)合形式的減少表明時序老化的狀態(tài)。根據(jù)一種實(shí)施方式，本發(fā)明的方法可以在體內(nèi)、在體外或離體判斷上皮(特別是表皮)的生理學(xué)狀態(tài)，特別是評價(jià)時序老化的狀態(tài)，例如，它有關(guān)的個體中該復(fù)合形式的缺 乏和/或改變。篩選生物化合物或化學(xué)化合物本發(fā)明涉及本發(fā)明的復(fù)合形式在作為篩選用于調(diào)節(jié)這些復(fù)合形式的增加和/或 穩(wěn)定性和/或生物活性的生物化合物或化學(xué)化合物的工具中的應(yīng)用，。本發(fā)明還涉及篩選能夠調(diào)節(jié)本發(fā)明的復(fù)合形式的量的生物化合物或化學(xué)化合物， 或者甚至是抗老化活性劑或物理化學(xué)要素的方法，該方法至少包括如下步驟a)在適于所述復(fù)合形式釋放的條件下，使含有至少一種本發(fā)明的復(fù)合形式的細(xì)胞 類型與至少一種化學(xué)化合物或生物化合物接觸；b)測定所述復(fù)合形式的含量；以及c)將由步驟b)確定的所述含量與不存在測試化學(xué)化合物或生物化合物時確定的 所述復(fù)合形式的含量相比較。步驟c)中進(jìn)行的比較可以得到關(guān)于所述測試化合物調(diào)節(jié)本發(fā)明的復(fù)合形式的表 達(dá)的性質(zhì)的信息。如上所述，該方法還可以包括目的在于保留下述活性劑的步驟，對于活性劑觀察 復(fù)合形式的含量增加。特別地，該方法用于表征防止和/或處理個體的皮膚老化跡象的處理的有效性， 該方法至少包括如下步驟i.提供所述個體的代表性的至少一份第一皮膚表面樣品；ii.特別地通過ELISA測定技術(shù)定量化所述樣品中至少一種本發(fā)明的復(fù)合形式；iii.在所述個體的代表性的第二皮膚表面樣品上重復(fù)步驟i和ii ；以及iv.將在步驟ii和iii結(jié)束后得到的結(jié)果對比，特別地，以從中得出關(guān)于處理的至 少一種效果的信息，其中，所述第一和第二皮膚表面樣品分別對應(yīng)于不同的處理階段。如果在使用所述測試的生物化合物或化學(xué)化合物，或者使用測試物理化學(xué)因素之 前進(jìn)行參考值的測定，本發(fā)明的方法還可以在適當(dāng)時估計(jì)所述化合物的潛在有效性。該量可以不受所述化合物的存在的影響，或者另一方面，可以被抑制或激活。如果觀測到增加，被測試的化合物則能夠用作，例如，抗老化活性劑。根據(jù)一種不同的實(shí)施方式，上述方法還可以包括至少一步對個體施用美容護(hù)理組 合物的步驟，根據(jù)步驟iv得到的信息確定或選擇該組合物。通過ELISA法測定本發(fā)明的復(fù)合形式的含量，特別是下面的實(shí)施例1所特別描述 的方法。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述復(fù)合形式的CLSP可以用在美容組合物或治療組 合物中?？梢岳斫獾氖牵景l(fā)明的所有美容組合物或治療組合物均使用生理學(xué)上可接受的 介質(zhì)。就本發(fā)明而言，術(shù)語“生理學(xué)上可接受的介質(zhì)”是指適用于用在上皮或角蛋白材料上的組合物的介質(zhì)，例如，在皮膚上，在頭皮上，在嘴唇上，在粘膜上和角蛋白纖維上，例如， 頭發(fā)、指甲和體毛，或者適當(dāng)?shù)臅r候用于口服或腸胃外給予。就本發(fā)明而言，術(shù)語“美容的”是指其用途主要是提供美感和/或舒適感。就本發(fā)明而言，術(shù)語“治療的”是指可以用于預(yù)防性的和/或治療性的處理的組合 物，或者用于評價(jià)上皮(特別是表皮)的狀態(tài)的方法。就本發(fā)明而言，術(shù)語“預(yù)防性的”或“防止”是指降低出現(xiàn)例如病理狀況的現(xiàn)象的
危險(xiǎn)。根據(jù)另一種實(shí)施方式，本發(fā)明的美容組合物或治療組合物還可以含有至少一種美 容和/或治療的活性劑。作為可以用于本發(fā)明的活性劑的例子，可以提及的是化妝油，例如，硅油、甘油三 酸酯型植物油、烴類基質(zhì)油，例如，parleam oil和脂肪酸的酯和脂肪醇的酯。還可以使用能夠改善皮膚狀態(tài)的其它活性劑，例如，保濕活性劑或者能夠增強(qiáng)天 然脂質(zhì)屏障的活性劑，例如，神經(jīng)酰胺、膽固醇硫酸酯和/或脂肪酸以及它們的混合物。還可以使用對皮膚具有活性的酶，例如，蛋白酶、脂肪酶、葡萄糖苷酶、酰胺酶、腦 苷脂和/或黑素酶(melanases)，以及它們的混合物。一般地，本發(fā)明的任何組合物均可以用于皮膚(身體的任何皮膚區(qū)域)或者用于 粘膜(口腔的、面頰的、齒齦的、生物器的、結(jié)膜的，等等)。在一種已知的方式中，美容組合物還可以含有化妝品領(lǐng)域常規(guī)的輔料，例如，親水 性的或親油性的膠凝劑、親水性的或親油性的添加劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香料、填料、 掩蔽劑(screening agent)、吸味劑和染料。本發(fā)明的組合物的各種成分的含量可以是本領(lǐng)域中常規(guī)的值。本發(fā)明的組合物中，本發(fā)明的復(fù)合形式的含量，也可以稱作“有效量”自然取決于 該化合物的性質(zhì)和需要達(dá)到的效果，因而可以在很大范圍內(nèi)變化。為了提供其數(shù)量級，組合物可以含有占所述組合物總重量的0.00001% -50重 量％的本發(fā)明的復(fù)合形式，特別地占所述組合物總重量的0.001% -10%，更特別地占所述 組合物總重量的0. -1%。本發(fā)明的組合物還可以特別地用于減輕和/或處理上皮(特別是表皮)劣化的狀 況的情況。這種狀態(tài)可以是由于時序原因(即，隨著時間的流逝，例如，皮膚老化)引起的和 /或表現(xiàn)為皮膚障礙，例如與光老化有關(guān)的。因此，本發(fā)明的組合物，特別是美容組合物，可以特別地用于防止和/或處理表皮 變薄和/或失去緊致、彈性、密度和/或表皮緊張和/或形成皺紋和細(xì)紋。根據(jù)另一種實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物，特別是美容組合物，可以，特別地用于防 止和/或處理皮膚干燥現(xiàn)象，特別是防止和/或處理表皮脫水。根據(jù)另一種實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物，特別是美容組合物，可以用于防止和/或 處理表皮老化的跡象。根據(jù)另一方面，本發(fā)明還涉及一種對皮膚老化跡象美容處理的方法，該方法至少 包括在皮膚的至少一部分、粘膜和/或角蛋白纖維上施用至少一種本發(fā)明的美容組合物的步驟。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的CLSP蛋白、該蛋白的肽片段或其類似物， 或調(diào)節(jié)這種多肽的活性、表達(dá)和/或穩(wěn)定性的試劑的復(fù)合形式的用途，特別是美容和/或治 療用途，特別是用于防止和/或處理皮膚老化跡象，特別是用于預(yù)防和/或處理皮膚老化。 本發(fā)明還涉及有效量的本發(fā)明的復(fù)合形式在制備和/或改善復(fù)層 (pluristratified)細(xì)胞模型，特別是表皮型或粘膜型，特別是重建的皮膚模型中的用途。就本發(fā)明而言，術(shù)語“重建的皮膚模型”是指存在各種細(xì)胞類型的模型，例如，特別 是皮膚的天然組成，例如，角化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞(Langerhan cells)和黑色 素細(xì)胞。所述成纖維細(xì)胞可以是被輻射的或未被輻射的。這樣的模型及其制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。因此，本發(fā)明還涉及一種制備分離的重建皮膚的方法，該方法至少包括將至本發(fā) 明的少一種復(fù)合形式與能夠生成分離的重建皮膚的細(xì)胞接觸，特別是角質(zhì)形成細(xì)胞。下面實(shí)施例和附圖用于非限定性描述本發(fā)明。


圖1表示前臂和面部皮膚中存在的本發(fā)明的復(fù)合形式的量與年齡之間的關(guān)系；圖2表示與使用含有10% bifidiobiotic(CLR復(fù)合物)和0.002%植物鞘胺 醇-SLC(處理“G”)的美容組合物對前臂和面部皮膚中本發(fā)明的復(fù)合形式的含量的影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 高靈敏ELISA測試分析本發(fā)明的復(fù)合形式的CLSP的進(jìn)展在本測試中使用通過MesoScale Discovery (MSD)技術(shù)定做的CLSP板。針對與GST 溶合的重組的“全長” CLSP蛋白的單克隆抗體由CovalAb (Lyon, Prance) (Mehul et al.， 2006)公司開發(fā)。在“小點(diǎn)”型(MesoScale)標(biāo)準(zhǔn)96孔板上以200 μ g/ml的濃度使捕獲抗 體(Clone DB15C9)沉淀。使用所述重組的CLSP蛋白確定參照曲線(5-0. 078 μ g/ml)。在室溫下用封閉液(MesoScale)將每個板封閉1小時。將每份25 μ 1樣品和25 μ 1 標(biāo)準(zhǔn)樣品一式三份放置，在室溫下攪拌孵育1小時。然后用三羥甲基氨基甲烷(tris)緩 沖液(MesoScale)將該板清洗4次。然后在室溫下使該板與25 μ 1濃度為1 μ g/ml的被 “sulpho-tag” (CLSP clone DB7gl2)標(biāo)記的檢測抗體(Mesoscale)在攪拌下孵育1小時。 用三羥甲基氨基甲烷緩沖液(MesoScale)將該板清洗4次，之后加入150μ 1的IX讀出緩 沖液(read buffer) T (MesoScale)。在“Sectorlmager6000”儀器上讀取該板。按照每 Pg 總蛋白中ngCLSP將該數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)施例2 通過剝離取得的各種樣品中的CLSP復(fù)合形式的含量的表征該表征通過實(shí)施例1中描述的ELISA分析進(jìn)行。進(jìn)行兩項(xiàng)臨床研究用取自前臂和面部的樣品進(jìn)行知識研究(2組20位具有白種 人皮膚的女性個體30-35歲以及60-65歲)，在56天(即兩個月)后只對來自前臂的樣品進(jìn)行產(chǎn)品研究(1組24位具有白種人皮膚的女性個體，年齡為40-45歲)。產(chǎn)品是含有10% bifidiobiotic (CLR復(fù)合物)和0. 002%植物鞘胺醇-SLC (處理 “G”)的血清。該CLR 復(fù)合物關(guān)于一種以 INCI 名 Bifidat ferment Lysate, EINECS 名 Bifidobacterium longurn,EINECS 編號為 306-168-4 和 CAS 編號為 96507-89-0 登記的溶 菌產(chǎn)物。這樣的溶菌產(chǎn)物特別地由K. Richter GmbH公司以R印air Complex GLR 的商品
名出售。名稱植物鞘胺醇-SLC為由Evonik Goldschmidt公司出售的植物鞘胺醇水楊酸酯 衍生物。對于所有研究，D-鱗屑樣品取自面部(臉頰)和前臂(面部后部 (posteriorface))。來自前臂的D-鱗屑角質(zhì)(comeodiscs)樣品用于評價(jià)產(chǎn)品的效果。a)從D-鱗屑角質(zhì)中提取蛋白將角質(zhì)置于2ml的艾本德管(Eppendorftube)中，粘性表面向內(nèi)，向每個管中加入 550μ1 “自制(native)+”的提取緩沖液(TBS，1%三硝基甲苯(triton)X-100，IM NaCI)，和 1個不銹鋼包。然后將該管置于MM400振動式研磨機(jī)(Retsch)的支架上。通過以30Hz振動 研磨2分鐘的一個周期進(jìn)行提取。然后將該介質(zhì)回收，用0.45 μ m的Millipore Ultrafree 柱濾過，然后在4°C下以5000g離心分離5分鐘。將上清液貯存在-20°C下以待分析。b)統(tǒng)計(jì)分析通過將年齡、區(qū)域和年齡*區(qū)域相互作用系數(shù)作為固定效果、以及受試者因素作 為隨機(jī)效果的偏差分析的混合模型進(jìn)行年齡(年輕的對年老的)和區(qū)域(手臂對面部)效 果的生物標(biāo)記的分析。通過對照方法實(shí)現(xiàn)對于一種年齡類型的區(qū)域效果和對于一種區(qū)域的 年齡效果。通過將時間因素作為固定效果，受試者因素作為隨機(jī)效果，在成對的活性劑-安 慰劑差別的方差分析的混合模型進(jìn)行處理效果的生物標(biāo)記的分析。通過對照測定DO和D56的處理效果。在需要時，事先將該變量進(jìn)行l(wèi)og-變型從而使其分布更加高斯化(Gaussian)。使用第14版的SPSS軟件進(jìn)行描述性分析(平均的曲線圖(graph ofthe means) 和柱狀圖(box plot))，使用SAS Enterprise Guide軟件進(jìn)行干涉部分。將第一品種α -風(fēng)險(xiǎn)固定為兩邊接近的5%。圖1和2表示了這兩項(xiàng)研究的結(jié)果。如圖1所示，數(shù)據(jù)顯示CLSP的復(fù)合形式隨著年齡增加而減少。開發(fā)的高靈敏ELISA試劑盒確實(shí)能夠證明復(fù)合形式的CLSP的表達(dá)隨著年齡增加 而減少。圖2部分表示了測試產(chǎn)品對復(fù)合形式的量的影響?？梢郧宄赜^察到復(fù)合形式的 量顯著增加，從而表明這種產(chǎn)品的活性效果。因此，后者提供了真正的抗老化效果。序列表<110> 歐萊雅<120>復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白CLSP的應(yīng)用
<130>BR87468/96081/KLP/PLC/se<160>25<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>858<212>DNA<213>( A )Homo Sapiens<400>1aattcccgga tccctgcggc tgcctgcact ctggaccacg agctctgaga gcagcaggtt 60gagggccggt gggcagcagc tcggaggctc cgcgaggtgc aggagacgca ggcatggccg 120gtgagctgac tcctgaggag gaggcccagt acaaaaaggc tttctccgcg gttgacacgg 180atggaaacgg caccatcaat gcccaggagc tgggcgcggc gctgaaggcc acgggcaaga 240acctctcgga ggcccagcta aggaaactca tctccgaggt tgacagcgac ggcgacggcg 300aaatcagctt ccaggagttc ctgacggcgg caaggaaggc cagggccggc ctggaggacc 360tgcaggtcgc cttccgcgcc ttcgaccagg atggcgacgg ccacatcacc gtggacgagc 420tcaggcgggc catggcgggg ctggggcagc cgctgccgca ggaggagctg gacgccatga 480tccgcgaggc cgacgtggac caggacgggc gggtgaacta cgaggagttc gcgaggatgc 540tcgcccagga gtgaggctcc ccgcctgtgt ccccctggct gcgctctgag ccttcagggc 600caccgcccgc tgctgctttt gtgctgggac tctccgggga aacctggtcg gtggatggga 660aactgcctcc ccctgggagg aaggctttgc gctccggggc ctggatgcgg cgccctcggg 720ccgcctgcga gcccctctct gccttcagac cttgggcaga aggaggcctc cttgggcctg 780gtcccccttt gccctgcagt ggaatgaggg ccccttaacc ccgcattgat ctaaataaag 840gactgccgag ttccaaaa858<210>2<211>146<212>PRT<213> 人<400>2Met Ala Gly Glu Leu Thr Pro Glu Glu Glu Ala Gln Tyr Lys Lys Ala151015Phe Ser Ala Val Asp Thr Asp Gly Asn Gly Thr lie Asn Ala Gln Glu202530Leu Gly Ala Ala Leu Lys Ala Thr Gly Lys Asn Leu Ser Glu Ala Gln354045Leu Arg Lys Leu lie Ser Glu Val Asp Ser Asp Gly Asp Gly Glu lie505560Ser Phe Gln Glu Phe Leu Thr Ala Ala Arg Lys Ala Arg Ala Gly Leu65707580Glu Asp Leu Gln Val Ala Phe Arg Ala Phe Asp Gln Asp Gly Asp Gly
859095His lie Thr Val Asp Glu Leu Arg Arg Ala Met Ala Gly Leu Gly Gln100105110Pro Leu Pro Gln Glu Glu Leu Asp Ala Met lie Arg Glu Ala Asp Val
115120125Asp Gln Asp Gly Arg Val Asn Tyr Glu Glu Phe Ala Arg Met Leu Ala130135140Gln Glu145<210>3<211>16<212>PRT<213> 人<400>3Ala Phe Asp Gln Asp Gly Asp Gly His lie Thr Val Asp Glu Leu Arg151015<210>4<211>17<212>PRT<213> 人<400>4Ala Phe Asp Gln Asp Gly Asp Gly His lie Thr Val Asp Glu Leu Arg151015Arg<210>5<211>16<212>PRT<213> 人<400>5Ala Phe Ser Ala Val Asp Thr Asp Gly Asn Gly Thr lie Asn Ala Gln151015<210>6<211>23<212>PRT<213> 人<400>6Ala Phe Ser Ala Val Asp Thr Asp Gly Asn Gly Thr lie Asn Ala Gln151015Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys
20<210>7<211>13<212>PRT<213> 人<400>7Ala Gly Glu Leu Thr Pro Glu Glu Glu Ala Gln Tyr Lys1510<210>8<211>14<212>PRT<213> 人<400>8Ala Gly Glu Leu Thr Pro Glu Glu Glu Ala Gln Tyr Lys Lys1510<210>9<211>11<212>PRT<213> 人<400>9Ala Gly Leu Glu Asp Leu Gln Val Ala Phe Arg1510<210>10<211>19<212>PRT<213> 人<400>10Ala Met Ala Gly Leu Gly Gln Pro Leu Pro Gln Glu Glu Leu Asp Ala151015Met lie Arg<210>11<211 >9<212>PRT<213> 人<400>11Glu Ala Asp Val Asp Gln Asp Gly Arg1 5<210>12<211>24
<212>PRT<213> 人<400>12Lys Ala Phe Ser Ala Val Asp Thr Asp Gly Asn Gly Thr lie Asn Ala151015Gln Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys20<210>13<211>24<212>PRT<213> 人<400>13Lys Leu lie Ser Glu Val Asp Gly Asp Gly Asp Gly Glu lie Ser Phe151015Gln Glu Phe Leu Thr Ala Ala Arg20<210〉14<211>15<212>PRT<213> 人<400>14Lys Leu lie Ser Glu Val Asp Ser Asp Gly Asp Gly Glu lie Ser151015<210>15<211>24<212>PRT<213> 人<400>15Lys Leu lie Ser Glu Val Asp Ser Asp Gly Asp Gly Glu lie Ser Phe151015Gln Glu Phe Leu Thr Ala Ala Lys20<210>16<211>24<212>PRT<213> 人<400>16Lys Leu lie Ser Glu Val Asp Ser Asp Gly Asp Gly Glu lie Ser Phe151015
Gln Glu Phe Leu Thr Ala Ala Arg20<210>17<211>23<212>PRT<213> 人<400>17Leu lie Ser Glu Val Asp Gly Asp Gly Asp Gly Glu lie Ser Phe Gln151015Glu Phe Leu Thr Ala Ala Arg20<210>18<211>12<212>PRT<213> 人<400>18Leu lie Ser Glu Val Asp Ser Asp Gly Asp Gly Glu1510<210>19<211>23<212>PRT<213> 人<400>19Leu lie Ser Glu Val Asp Ser Asp Gly Asp Gly Glu lie Ser Phe Gln151015Glu Phe Leu Thr Ala Ala Lys20<210>20<211>23<212>PRT<213> 人<400>20Leu lie Ser Glu Val Asp Ser Asp Gly Asp Gly Glu lie Ser Phe Gln151015Glu Phe Leu Thr Ala Ala Arg20<210>21<211>8
<212>PRT
<213> 人<400>21Asn Leu Ser Glu Ala Gln Leu Arg15<210>22<211>8<212>PRT<213> 人<400>22Asn Leu Ser Glu Ala Gln Leu Arg15<210>23<211>12<212>PRT<213> 人<400>23Ser Ala Val Asp Thr Asp Gly Asn Gly Thr lie Asn1510<210>24<211>21<212>PRT<213> 人<400>24Ser Ala Val Asp Thr Asp Gly Asn Gly Thr lie Asn Ala Gln Glu Leu151015Gly Ala Ala Leu Lys20<210>25<211 >8<212>PRT<213> 人<400>25Val Asn Tyr Glu Glu Phe Ala Arg1權(quán)利要求
至少一種復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP在作為在離體或體外表征上皮的時序老化狀態(tài)的工具中的應(yīng)用，其中，所述復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP至少一部分來自于下述的多肽，該多肽的氨基酸序列全部或部分由SEQID NO 1或其類似物或其片段所表示的核酸序列所編碼。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述復(fù)合形式的減少表明時序老化的狀態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述多肽的氨基酸序列全部或部分由SEQID NO 2或其類似物表示的序列所表示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述多肽的氨基酸序列全部或部分由選自如下 序列的序列所表示SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQID NO 6、SEQ ID NO 7、 SEQ ID NO 8,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10,SEQ ID NOlUSEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID N016、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID N02USEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24 禾口 SEQ ID NO 25。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述復(fù)合形式來自于CLSP或其片段與其自身或 它的一個片段或與目標(biāo)蛋白的結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中，所述目標(biāo)蛋白選自14.3.3β多肽、14. 3. 3 σ、膜 聯(lián)蛋白II和V、鈣網(wǎng)蛋白、ERp72、核仁素、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3、黑素瘤抗原基因D1、蛋白磷酸酶 4、上游轉(zhuǎn)錄因子2和14. 3. 3 τ。
7.用于表征上皮狀態(tài)的方法，該方法至少包括如下步驟a)測定所述上皮的表面上皮樣品中至少一種復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP的 含量，其至少一部分來自于下述的多肽，該多肽的氨基酸序列全部或部分由SEQ ID NO 1或 其類似物或其片段所表示的核酸序列所編碼；以及b)將步驟a)測得的所述含量與參考值比較。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其中，該方法為非侵害性的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP的減少表 明時序老化的狀態(tài)，所述復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP至少一部分來自于下述的 多肽，該多肽的氨基酸序列全部或部分由SEQ ID NO 1或其類似物或其片段所表示的核酸 序列所編碼。
10.篩選抗老化活性劑的方法，該方法至少包括如下步驟a)使至少一種含有至少一種復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP與至少一種測試抗 老化活性劑在適于所述復(fù)合形式表達(dá)的條件下接觸，所述復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或 CLSP至少一部分來自于下述的多肽，該多肽的氨基酸序列全部或部分由SEQ ID NO 1或其 類似物或其片段所表示的核酸序列所編碼；b)測定所述復(fù)合形式的含量；以及c)將由步驟b)確定的所述含量與不存在測試化學(xué)化合物或生物化合物時確定的所述 復(fù)合形式的含量相比較。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP的 的增加表明活性劑具有抗老化性質(zhì)，所述復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP至少一部 分來自于下述的多肽，該多肽的氨基酸序列全部或部分由SEQ ID NO 1或其類似物或其片 段所表示的核酸序列所編碼。
12.用于表征美容或治療性處理的有效性的美容方法，所述處理用于防止和/或處理 與個體的時序老化相聯(lián)系的皮膚老化的跡象，所述方法至少包括定性或定量表征至少一種 復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP，其至少一部分來自于下述的多肽，該多肽的氨基酸 序列全部或部分由SEQ ID NO 1或其類似物或其片段所表示的核酸序列所編碼。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP的增加 表明對皮膚老化跡象的所述處理是有效的，所述復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP至 少一部分來自于下述的多肽，該多肽的氨基酸序列全部或部分由SEQ ID NO 1或其類似物 或其片段所表示的核酸序列所編碼。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，該方法還包括至少一步對所述個體施用美容護(hù)理組 合物的步驟，所述組合物是根據(jù)在表征步驟結(jié)束時得到的信息確定或選擇的。
15.用于表征能夠防止和/或處理個體中皮膚老化跡象的處理有效性的非侵害性方 法，該方法至少包括如下步驟i.提供所述個體的至少一份代表性的第一皮膚表面樣品； .特別地通過ELISA測定技術(shù)定量所述樣品中至少一種復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋 白或CLSP，該復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP至少一部分來自于下述的多肽，該多肽 的氨基酸序列全部或部分由SEQ ID NO 1或其類似物或其片段所表示的核酸序列所編碼；iii.在所述個體的代表性的第二皮膚表面樣品上重復(fù)步驟i和ii；以及iv.將在結(jié)束步驟ii和iii后得到的結(jié)果對比，特別地，以從中得出關(guān)于處理的至少一 種效果的信息，其中，所述第一和第二皮膚表面樣品分別對應(yīng)于不同的處理階段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述第一樣品代表處理前的狀態(tài)，所述第二樣 品代表處理過程中的狀態(tài)或處理后的狀態(tài)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述復(fù)合形式的增加表明所述對皮膚老化跡 象的處理是有效的。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，該方法還包括至少一步對所述個體施用美容護(hù)理組 合物的步驟，所述組合物是根據(jù)步驟iv得到的信息確定或選擇的。
19.至少一種復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP在作為篩選能夠調(diào)節(jié)所述復(fù)合形 式的增加和/或穩(wěn)定性和/或生物活性的生物化合物或化學(xué)化合物的工具中的應(yīng)用，所述 復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白或CLSP至少一部分來自于下述的多肽，該多肽的氨基酸序 列全部或部分由SEQ ID NO 1或其類似物或其片段所表示的核酸序列所編碼。
全文摘要
本發(fā)明涉及復(fù)合形式的鈣調(diào)素樣皮膚蛋白(CLSP)、來自該蛋白的多肽或其類似物作為評價(jià)上皮的狀態(tài)的標(biāo)記的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及這些復(fù)合形式在篩選能夠調(diào)節(jié)所述復(fù)合形式的生物活性和/或制備和/或改善復(fù)層細(xì)胞模型中的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/47GK101806803SQ201010002380
公開日2010年8月18日 申請日期2010年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者多米尼克·貝爾納, 馬克·多諾萬 申請人:歐萊雅