專利名稱：一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒
素的組合分離純化方法。
背景技術(shù)：
眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇的毒腺分泌的一種天然毒蛋白，其化學(xué)成分非常復(fù)雜，含有 多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其他小分子物質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性，其中主要的有神經(jīng)毒 素、細(xì)胞毒素、神經(jīng)生長因子和眼鏡蛇毒因子(CVF)等。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，眼鏡蛇 毒的許多組分已得到分離純化和序列測定，各種成分廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、毒 理學(xué)和藥物學(xué)理論研究和臨床應(yīng)用。 自1933年Monaelesser和Taguet首次報道眼鏡蛇毒對癌組織壓迫神經(jīng)引起疼痛 的病例的顯著療效以來，眼鏡蛇毒的鎮(zhèn)痛作用得到了深入的研究，其中眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素 (neurotoxin, NTX)顯示了獨特的鎮(zhèn)痛作用，NTX的鎮(zhèn)痛機(jī)理與嗎啡類似，鎮(zhèn)痛效果大于嗎 啡，持續(xù)時間長，無麻醉作用，無成癮性和耐藥性，但起效較嗎啡慢；同時NTX還能戒除嗎啡 毒癮，所以在癌痛或戒毒等方面具有獨特的治療作用。 目前蛇毒神經(jīng)毒素的提取方法主要是采用離子交換法結(jié)合凝膠層析法，現(xiàn)有技術(shù) 的提取方法存在步驟多、分離周期長、提取成本高，蛇毒一次提取之后不能重復(fù)利用等問 題。例如李泛珠等所公開的《浙江眼鏡蛇蛇毒中神經(jīng)毒素的分離純化及其鎮(zhèn)痛作用研究》 (中國藥師，2004， 7， 9， 659-661)中，采用三次柱層析，步驟多、耗時長、提取成本高，不易作 為工業(yè)化大規(guī)模分離純化工藝；龔潮梁等所公開的《一種分離提純眼鏡蛇神經(jīng)毒素的簡便 方法》(1981 ， 2， 4， 83 87)中，采用CM-纖維素柱吸附并線性洗脫，CM—纖維素樹脂允許的 線性流速很低，并且極易被壓縮，造成工藝耗時長，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，屬于應(yīng)淘汰的舊工藝。
眼鏡蛇毒因子(Cobra venom factor, CVF)，又稱為眼鏡蛇抗補(bǔ)體蛋白 (Cobraanticomplementary protein)，是來源于眼鏡蛇科蛇毒的一種旁路補(bǔ)體激活物。由 于CVF既能激活補(bǔ)體又能最終耗竭補(bǔ)體，且性質(zhì)穩(wěn)定，特異性高，因此被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī) 學(xué)的研究.具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，可能用于以下幾個方面研究抗補(bǔ)體作用的工具藥； 用于抗炎癥及抗自身免疫性疾??；抗移植排斥反應(yīng)；抗腫瘤導(dǎo)向藥物等。
由于CVF在眼鏡蛇毒中含量甚般，提取較困難，所以很少有公開報道的CVF分離提 純方法，葉春玲等曾公開《一種從蛇毒中分離提純抗補(bǔ)體因子的簡便方法》(中國藥理學(xué)通 報，1997Feb ;13(1) :85 87)，采用先凝膠層析再離子交換層析兩步層析法分離，凝膠層析 采用Bio-gel P200柱，離子交換層析采用DEAE cellulose DE 52柱，該方法可以少量制備 樣品，但以上兩種填料剛性較差，層析柱易壓縮，耗時長，不適合做規(guī)?；a(chǎn)工藝，并且大 部分蛇毒蛋白未能有效利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改進(jìn)已有技術(shù)的不足而提供一種同時分離眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素
和眼鏡蛇毒因子、分步得到重點產(chǎn)品、減少產(chǎn)品間的相互干擾、避免了脫鹽引起CVF的溶解
度降低而帶來的溶液渾濁且容易蛋白變性的問題、綜合利用率和提取效率高、產(chǎn)品純度高、
適合工業(yè)化生產(chǎn)的眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇神經(jīng)毒素的組合分離純化方法。 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離
純化方法，其特點在于該方法包含以下步驟 1)、取蛇毒溶解于純化水或pH5-8的Tris緩沖液中，l(TC以下低溫離心，取上清液，過微孔濾膜； 2)、將步驟1)所得到的上清液進(jìn)行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為3kDa-5kDa的超濾膜進(jìn)行； 3)、將步驟2)所得到的蛇毒液分別進(jìn)行離子交換層析和凝膠層析，取相應(yīng)組分進(jìn)行除鹽濃縮、冷凍干燥，分別得到純化的眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素成分。
為了進(jìn)一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以是所用蛇毒為眼鏡蛇毒干粉或凍干粉。
為了進(jìn)一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以是所述步驟l)中，采用O-l(TC低溫離心，上清液過0. 22 ii m或0. 44 ii m微孔濾膜。 為了進(jìn)一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以是所述步驟2)中，交換的緩沖液為pH5-8之間的Tris-HCl緩沖液或醋酸鹽緩沖液或PBS緩沖液中的一種，超濾采用截留分子量為3-5kDa之間的超濾膜系統(tǒng)。 為了進(jìn)一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以是所述步驟3)中包括下述步驟 a、將步驟2)最終得到的上清液進(jìn)行截留分子量為3 5kDa的超濾； b、用pH值為5-8的緩沖液平衡陽離子交換柱，將步驟a得到的蛇毒液上樣后，
0-0. 5M含緩沖液的鈉鹽階段梯度或線性梯度洗脫； c、收集步驟b中具有眼鏡蛇神經(jīng)毒素活性成分峰，按照步驟a方式進(jìn)行除鹽濃縮，
真空冷凍干燥，得到眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素； d、收集步驟b中流穿峰組分，按照步驟a濃縮； e、用lO-lOOmM的氯化鈉溶液平衡的凝膠層析柱，層析介質(zhì)包括Superdex 200、S印hacryl 200或分離分子量在100kDa以上的凝膠層析介質(zhì)，取步驟d的濃縮液上柱；
f 、收集步驟e中的眼鏡蛇毒因子成分，按照步驟a方式部分除鹽后真空冷凍干燥或者不除鹽直接真空冷凍干燥，得到眼鏡蛇毒因子。
本發(fā)明方法具有以下優(yōu)點 1.本發(fā)明可以同時分離眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和眼鏡蛇毒因子，提高了眼鏡蛇毒這一珍稀資源的利用效率； 2.本發(fā)明取陽離子交換柱法分離眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的流穿峰中分離眼鏡蛇毒因子成分，兩步法中每步驟中得到重點產(chǎn)品，減少產(chǎn)品間的相互干擾； 3.采用直接帶鹽凍干CVF，避免了脫鹽引起CVF的溶解度降低而帶來的溶液渾濁且容易蛋白變性的問題； 本發(fā)明同時提取眼鏡蛇神經(jīng)毒素和眼鏡蛇毒因子，綜合利用率和提取效率高，產(chǎn)品純度高，得到的眼鏡蛇神經(jīng)毒素純度95%以上，眼鏡蛇毒因子純度90%以上。采用本發(fā)明方法得到的眼鏡蛇毒因子成分，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢驗，非還原法為一條帶，還原法為三條帶。適合工業(yè)化生產(chǎn)，并且該兩種產(chǎn)品的應(yīng)用前景廣泛。 本發(fā)明方法得到的眼鏡蛇神經(jīng)毒素，是由68個氨基酸殘基組成的堿基多肽，分子量7000Da左右。由于其堿基多肽的特殊結(jié)構(gòu)所致，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測的表觀分子量約12kDa，與科博肽國家標(biāo)準(zhǔn)品一致。 本發(fā)明方法得到的眼鏡蛇毒因子(CVF)，分子量為130-230kDa，等電點4. 4_6. 0，
三條肽鏈組成通過二硫鍵和非共價鍵鏈接，經(jīng)加入DDT ( 二硫蘇糖醇)還原后SDS-PAGE檢驗為三條帶，分子量依次為30kDa、50kDa、66kDa左右。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。 圖1為本發(fā)明方法的到的眼鏡蛇神經(jīng)毒素與購自中檢所的科博肽標(biāo)準(zhǔn)品眼鏡蛇神經(jīng)毒素的SDS-PAGE電泳檢驗對照圖。 圖2為本發(fā)明方法的到的眼鏡蛇毒因子加入二硫蘇糖醇還原經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗圖。
具體實施例方式
實施例， 一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方法，是采用以下步驟 1.樣品粗毒的處理稱取蛇毒20g溶解于200ml純化水或pH5_8的Tris緩沖液中，10°C以下lOOOOrpm低溫離心10min，取上清液，過0. 22 ii m微孔濾膜，過膜后溶液用截留分子量為3kDa_5kDa的超濾膜交換為分離緩沖液；
2. CM-S印harose FF層析將交換緩沖液后的蛇毒溶液用蠕動泵以10ml/min的流速上樣到pH 7. 5， 20mmol/L的Tris緩沖液平衡的CM S印harose FF層析柱(5. 0 X 30cm)，并用平衡緩沖液洗脫完流穿峰并收集之，之后的洗脫緩沖液中加入NaCL分別洗脫，加入的NaCL濃度為0. IM，O. 2M，0. 4M，所有步驟流速均為10ml/min，收集眼鏡蛇神經(jīng)毒素；
3.眼鏡蛇神經(jīng)毒素超濾除鹽，凍干 用3Ka分子量的超濾膜膜包將眼鏡蛇神經(jīng)毒素溶液脫除緩沖鹽，成為無鹽蛋白溶液，將除鹽后的蛋白溶液過O. 22ym濾膜，無菌分裝，冷凍干燥后既得眼鏡蛇神經(jīng)毒素原料藥1206mg ; 4.眼鏡蛇毒因子濃縮 將步驟2收集的流穿峰用lOKDa分子量的膜包超濾濃縮至60ml ;
5. Superdex 200層析 將60ml眼鏡蛇毒因子濃縮液上樣到50mM NaCl平衡的Superdex200層析柱5. 0X80cm， 10ml/min上樣，洗脫，收集眼鏡蛇毒因子產(chǎn)品峰；
6.除鹽、冷凍真空干燥 將步驟5得到的眼鏡蛇毒因子產(chǎn)品峰用lOKDa分子量超濾膜超濾到5mM NaCl，過0. 22 m濾膜，無菌分裝，冷凍干燥后既得眼鏡蛇毒因子原料藥162mg。取本實施例得到的眼鏡蛇神經(jīng)毒素與購自中檢所的科博肽標(biāo)準(zhǔn)品(眼鏡蛇神經(jīng)毒素)進(jìn)行實驗對照，SDS-PAGE電泳檢驗圖見圖l，圖中左側(cè)為本發(fā)明產(chǎn)品，右側(cè)為中檢所的科博肽標(biāo)準(zhǔn)品。
取本實施例得到的眼鏡蛇毒因子，加入二硫蘇糖醇還原經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗，見圖2，由圖中可以看出，CVF由分子量為32000Da、49000Da、66000Da的三個亞基組成，符合CVF的特征要求。
權(quán)利要求
一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方法，其特征在于該方法包含以下步驟1)、取蛇毒溶解于純化水或pH5-8的Tris緩沖液中，10℃以下低溫離心，取上清液，過微孔濾膜；2)、將步驟1)所得到的上清液進(jìn)行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為3kDa-5kDa的超濾膜進(jìn)行；3)、將步驟2)所得到的蛇毒液先后進(jìn)行離子交換層析和凝膠層析，取相應(yīng)組分除鹽、冷凍干燥，分別得到純化的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和眼鏡蛇毒因子成分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方 法，其特征在于所用蛇毒為眼鏡蛇毒干粉或凍干粉。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方 法，其特征在于所述步驟1)中，采用O-l(TC低溫離心，上清液過O. 22ii m或O. 44y m微孔濾 膜。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方 法，其特征在于所述步驟2)中，交換的緩沖液為pH5-8之間的Tris-HCl緩沖液或醋酸鹽緩 沖液或PBS緩沖液中的一種，超濾采用截留分子量為3-5kDa之間的超濾膜系統(tǒng)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方 法，其特征在于所述步驟3)中包括下述步驟a、 將步驟2)最終得到的上清液進(jìn)行截留分子量為3k-5k的超濾；b、 用pH值為5-8的緩沖液平衡陽離子交換柱，將步驟a得到的蛇毒液上樣后，O-O. 5M 含緩沖液的鈉鹽階段梯度或線性梯度洗脫；c、 收集步驟b中具有眼鏡蛇神經(jīng)毒素活性成分峰，按照步驟a方式進(jìn)行除鹽濃縮，真空 冷凍干燥，得到眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素；d、 收集步驟b中流穿峰組分，按照步驟a進(jìn)行濃縮后上樣到Superdex 200層析柱；e、 用10 100mM的氯化鈉溶液平衡的凝膠層析柱，層析介質(zhì)包括Superdex 200、 S印hacryl 200或分離分子量在100kDa以上的凝膠層析填料，取步驟d的濃縮液上柱；f、 收集步驟e中的眼鏡蛇毒因子成分，按照步驟a方式部分除鹽后真空冷凍干燥或者 不除鹽直接真空冷凍干燥，得到眼鏡蛇毒因子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方法，是首先低溫高速離心處理蛇毒原液，再使用3KDa超濾膜除去蛇毒中小分子物質(zhì)和低分子多肽等，兩步層析分別是CM-Sephrose FF層析柱和Superdex 200凝膠層析柱，在一次生產(chǎn)中分別得到眼鏡蛇神經(jīng)毒素和眼鏡蛇毒因子兩種有效成分，本發(fā)明具有可以同時分離眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇神經(jīng)毒素、有效提高了眼鏡蛇毒的利用效率、產(chǎn)品純度高、適合工業(yè)化生產(chǎn)的特點。
文檔編號C07K14/435GK101747409SQ20101001146
公開日2010年6月23日 申請日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者劉志強(qiáng), 呂憲峰, 張坤, 曹恒, 林峰, 王東 申請人:中鑫東泰(萊陽)納米基因生物技術(shù)有限公司