專利名稱：一種從生物組織或工程菌中分離純化鐵蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從生物組織樣品或工程菌體中分離純化鐵蛋白的技術(shù)，屬蛋白質(zhì)純化 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鐵是生物有機體必需的金屬元素之一，對于維持細胞的正常生長和代謝起著重要 的作用。體內(nèi)大部分鐵離子都與其它蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，在生理PH值下，游離!V+濃度不多 于10_8M，F(xiàn)e3+濃度不高于10_WM。過量的游離態(tài)的鐵會與體內(nèi)過氧化物發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生活性 自由基，這些活性自由基會對細胞脂膜、DNA鏈以及其它生物大分子產(chǎn)生致命的毒性。因此 生物體通過鐵蛋白將體內(nèi)多余的鐵離子暫時儲存起來，以供機體需鐵時再利用；同時也可 以解除游離態(tài)鐵離子的毒性?？梢?，鐵蛋白在生物體鐵代謝平衡中起著關(guān)鍵作用。目前發(fā) 現(xiàn)鐵蛋白存在于幾乎所有的生物體中，包括動物、植物和微生物。鐵蛋白的三維結(jié)構(gòu)在真核 生物和原核生物中都高度保守以維持其相同的功能。鐵蛋白在結(jié)構(gòu)上通常由兩部分組成 外部是由M個蛋白質(zhì)亞基構(gòu)成的具有432點對稱的高度保守籠狀蛋白殼，內(nèi)部空腔為水合 氧化鐵的磁性納米顆粒，最大直徑為7-8nm。機體內(nèi)鐵蛋白通常以單體和少量多聚體形式存 在，且具有耐高溫(> 80°C )和極端PH值0-12)等特性。作為儲存鐵的主要蛋白質(zhì)，鐵蛋白除了可以作為吸收利用率極高的生物補鐵源 外，可用于貧血人群以及鐵代謝疾病的天然補鐵原料。另外近年來還成為生物學(xué)家和材料 學(xué)家的理想仿生合成模板。利用生物礦化原理，以鐵蛋白的籠型蛋白殼作為模板，仿生合成 具有磁學(xué)、電學(xué)和光學(xué)等特殊屬性的重要材料是當(dāng)前的熱點。并且鐵蛋白具有特征的磁性 鐵核、蛋白殼可經(jīng)化學(xué)或生物修飾偶聯(lián)多種配體以及對抗體具有高親和等特點，這正是生 物醫(yī)學(xué)等可應(yīng)用的重要特征。尤其是合成的納米磁學(xué)材料，包括鐵磁性(亞鐵磁性)以及 反鐵磁性兩大類。鐵磁性(亞鐵磁性)顆粒目前在影像學(xué)檢測，藥物靶向，細胞磁分離和磁 熱療等多方面都具有重要的應(yīng)用前景。反鐵磁性顆粒由于具有高矯頑力，成為理想的磁記 憶材料。此外由于單體鐵蛋白具有無相互作用、粒度均一、室溫下具有超順磁等重要特性， 是理論磁學(xué)研究的理想模式材料。針對鐵蛋白在生物醫(yī)學(xué)以及材料學(xué)上的重要應(yīng)用，分離純化高純度、高產(chǎn)量的單 體鐵蛋白和多聚體鐵蛋白已經(jīng)成為各種研究的前提和基礎(chǔ)。鑒于購買商品化鐵蛋白的價格 極高，進一步限制了進行擴大規(guī)模的合成生產(chǎn)。而且目前國內(nèi)基本上沒有自己的鐵蛋白商 品，當(dāng)前僅為Sigma等少數(shù)幾家公司壟斷。尤其重要的是對于磁學(xué)研究來說，當(dāng)前沒有進一 步分離純化的單體鐵蛋白商品，因此利用大量廉價的原料分離純化高產(chǎn)量、高純度的單體 鐵蛋白具有重要的經(jīng)濟價值，也是本發(fā)明的意義所在。國際上有關(guān)鐵蛋白分離純化方法有一些文獻報道，但主要都沿用或參考于 Granich(1946)和May and Fish(1977)所建立的方法。這些文獻中所說主要的實驗技術(shù) 路線為組織研磨成勻漿液-高溫?zé)嶙冃?75°C )-硫酸銨沉淀-超速離心-瓊脂糖凝膠層 析。近幾年很多文獻報道在此基礎(chǔ)上稍微改進，例如Kong等和Huang等Q004)改進的實驗技術(shù)路線為組織研磨成勻漿液-高溫?zé)嶙冃?75°C )-硫酸銨沉淀1次-硫酸銨 反向提取2次-DEAE離子交換層析-S印Hacryl S-300凝膠層析。Morisaka等Q009)最新 報道利用高壓液相色譜(HPLC)在硅膠整體柱上快速分離鐵蛋白等多種蛋白。上述分離方法都存在步驟繁瑣或者對儀器要求高的不足。一般來說，分離步驟越 多，目的蛋白質(zhì)的損失量越大，產(chǎn)率越低；而且某些純化步驟對儀器要求高，例如超速離 心需要高速離心機、高壓液相色譜儀等一般實驗室都沒有配備。為解決仿生合成所需的大 量高純度鐵蛋白模板以及貧血人群對天然補鐵產(chǎn)品的需求，需要建立一套高效、低成本的 生物分離純化技術(shù)，利用極易獲得的動物脾臟、肝臟等富含鐵蛋白的組織或者大規(guī)模發(fā)酵 培養(yǎng)的工程菌株為原料，經(jīng)熱變性和層析等關(guān)鍵技術(shù)相結(jié)合而獲得廉價的、高產(chǎn)量和高純 度的單體鐵蛋白以及多聚體鐵蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從生物組織或工程菌中分離純化鐵蛋白的方法，以利 用極易獲得的動物脾臟、肝臟等富含鐵蛋白的組織或者大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的工程菌株為原 料，經(jīng)熱變性和層析等關(guān)鍵技術(shù)相結(jié)合而獲得廉價的、高產(chǎn)量和高純度的單體鐵蛋白以及 多聚體鐵蛋白。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的從生物組織或工程菌中分離純化單體鐵蛋白的方 法，其主要步驟如下1)將生物組織或工程菌按質(zhì)量1 1. 5-2的比例加入去離子水，冰水保護下，研磨 成勻漿，過濾得到勻漿液；2)將勻漿液在70-75°C中攪拌熱變性處理去除非耐熱蛋白，收集上清液；在上清 液中加入硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，沉淀完全后離心收集沉淀；用緩沖液溶解沉淀，獲得粗蛋白 液；3)將粗蛋白液依次進行鎳柱親和層析-分子篩層析，進行分離純化；鎳柱親和層 析獲得的蛋白液中所含的鐵蛋白為電泳純，分子篩層析以分離單體和多體鐵蛋白；4)蛋白質(zhì)濃縮，除鹽；電泳檢測單體和多體蛋白質(zhì)純度。所述的方法中，生物組織為新鮮或_80°C至_40°C冷凍保存動物的組織或器官；工 程菌為表達重組人鐵蛋白的H鏈、重組人鐵蛋白的L鏈、重組人鐵蛋白的H鏈和L鏈的組裝 體、重組人鐵蛋白的H鏈的突變體或融合蛋白和重組人鐵蛋白的L鏈的突變體或融合蛋白 的表達菌株。所述的方法中，步驟1中的研磨包括機械勻漿、液氮勻漿或超聲破碎。所述的方法中，步驟1中機械勻漿和超聲破碎需用冰水降溫，防止局部溫度過高 蛋白質(zhì)降解。所述的方法中，步驟2中的熱變性處理時間為15-20分鐘。所述的方法中，步驟2中的離心條件為0-4°C，離心機轉(zhuǎn)速為10，000g，時間為 20-30分鐘。所述的方法中，步驟2中的緩沖液為pH = 7. 25的Tris-Hcl緩沖液。所述的方法中，步驟3中的層析是在10倍體積的pH = 7. 25的50mMTris-Hcl中 透析M-36小時，溫度為0-4°C。
所述的方法中，步驟3中的親和層析填料采用商品Ni-NTA親和層析介質(zhì)。所述的方法中，步驟3中的分子篩層析填料采用瓊脂糖sepHarose 6B或者 superose 60本發(fā)明具有如下優(yōu)點1)本發(fā)明原料成本低，動物的脾臟、肝臟等免疫器官多不為人們所食用，是極其低 廉的下水產(chǎn)物，但是這些動物組織中富含鐵蛋白，具有極高附加值。另外基因工程菌所表達 的重組人鐵蛋白也可進行大規(guī)模發(fā)酵。2)本發(fā)明利用常規(guī)的鎳柱親和層析就可實現(xiàn)電泳純的鐵蛋白的純化，而且這種親 和層析不需要加入His標簽，因而可以很方便地純化生物組織中的鐵蛋白，因為這些鐵蛋 白沒有天然的His標簽。對于基因工程表達的鐵蛋白也具有明顯的優(yōu)勢，因為不需要His 標簽，所以純化后不需要用酶切除標簽這一繁瑣步驟。而親和層析在蛋白純化工藝中往往 具有損失蛋白少，載量高，純化快速簡單以及對蛋白損傷小等優(yōu)點，因而降低了鐵蛋白純化 所需要的成本和時間。3)本發(fā)明所利用的分子篩層析可以很好地分離鐵蛋白中所存在的單體和多聚體， 因而可以利用單體鐵蛋白制備分散性更高的納米材料。


圖Ia是本發(fā)明實施例1純化的單體豬脾鐵蛋白透射電鏡(TEM)負染照片。圖Ib是本發(fā)明實施例1純化的多聚體豬脾鐵蛋白透射電鏡(TEM)負染照片。圖2是按實施例1所純化的豬脾鐵蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖中的 條帶1是豬脾破碎勻漿液上清；條帶2是豬脾破碎勻漿液沉淀；條帶3是硫酸銨沉淀溶解 后以及透析后的粗蛋白液；M是Marker，從下往上大小分別為14. 4,18. 4,25. 0,35. 0,45. 0、 66. 2,116. OkD ；條帶5是50mM Tris-Hcl洗脫雜蛋白；條帶6、7、8是250mM咪唑洗脫鐵蛋 白；條帶9是通過分子篩sepHarose 6B層析后的鐵蛋白。圖3是按實施例1所純化的單體豬脾鐵蛋白活性聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳圖。圖 中條帶1為Ni-NTA親和層析純化的鐵蛋白的活性電泳圖；條帶2為過分子篩s印Harose 6B 層析后分離得到的單體鐵蛋白。圖4是按實施例2所純化的重組人源鐵蛋白H亞基的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 圖。圖中條帶1是工程菌破碎液上清；條帶2是工程菌破碎液沉淀；條帶3是75°C加熱后 上清；條帶4是硫酸銨沉淀溶解后以及透析后的粗蛋白液；M是Marker，從下往上大小分別 為 14. 4,18. 4,25. 0,35. 0,45. 0,66. 2,116. OkD ；條帶 6、7 是 50mM Tris-Hcl 洗脫雜蛋白；條 帶8、9是250mM咪唑洗脫鐵蛋白；條帶10是通過分子篩s印Harose 6B層析后的鐵蛋白。圖5是按實施例2所純化的單體重組人源H亞基鐵蛋白透射電鏡(TEM)負染照片具體實施方法本發(fā)明是一種從生物組織樣品或工程菌中分離純化單體和多聚體鐵蛋白的技術(shù)。 針對以前鐵蛋白的分離方法存在步驟繁瑣或者對儀器要求高的不足，利用研究中發(fā)現(xiàn)在不 需要組氨酸標簽的前體下，鐵蛋白本身對鎳柱就具有特異性的親和性的特點，發(fā)明了鎳柱 親和層析技術(shù)，鎳柱具有結(jié)合量大，洗脫方法簡單省時，且可多次再生利用等優(yōu)點，大大的 縮短了純化時間和實驗成本。這是本發(fā)明區(qū)別于公知技術(shù)的關(guān)鍵步驟。此外，本發(fā)明采用更加適合分離分子量為450KD-505KD的鐵蛋白分子(不同物種由于 鐵蛋白所含的H、L兩種亞基的比例不同，所以分子量有所差異)，能夠很好地分離單體和多 聚體，從而能夠分離得到純度較高的單體鐵蛋白和多聚體鐵蛋白，這也是本發(fā)明的重點改 造之處。本發(fā)明的技術(shù)方案是原料-前處理-提取粗蛋白-鎳柱親和層析-瓊脂糖分子篩層析-蛋白質(zhì)除鹽、 濃縮-成品本發(fā)明的技術(shù)方案，具體按以下順序操作1)原料市場上購買富含鐵蛋白的動物組織或器官，或發(fā)酵收集含有重組鐵蛋白 基因的工程菌作為提取鐵蛋白的原料。2)前處理組織原料先剔除筋膜等結(jié)締組織，然后切碎成盡可能小的塊，或發(fā)酵 培養(yǎng)后離心獲得的菌體，按1 1.5-2比例加入去離子水，在低溫的冰水保護下研磨或超聲 破碎成組織勻漿，用5-10層紗布過濾除掉未勻漿好的組織塊、筋膜等結(jié)締組織，獲得勻漿 液。對于表達鐵蛋白的工程菌采用超聲破碎或者擠壓破碎，獲得勻漿液，離心收集上清液。3)提取粗蛋白將步驟2離心所得的上清液熱變性處理，離心去除沉淀的變性雜 蛋白質(zhì)，收集上清液。按一定比例在上清液中加入硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，在4°C放置6-12小 時。待沉淀完全后離心收集沉淀。用50mMTriS緩沖緩沖液(pH 8.0)溶解沉淀，并進行透 析除去硫酸銨，獲得粗蛋白液。4)分離純化獲得的粗蛋白液依次進行鎳柱(Ni-NTA)親和層析_s印Harose 6B 分子篩層析，進行分離純化。a) His鎳柱親和層析①將獲得粗蛋白液加入到Ni-NTA層析柱中，使蛋白與Ni-NTA充分結(jié)合。②將結(jié)合鐵蛋白的Ni-NTA用50mM Tris緩沖液洗滌，約10_15個柱體積。目的去 除非特異性結(jié)合的雜蛋白。③加入競爭性咪唑緩沖液，洗脫目的鐵蛋白。④用蛋白質(zhì)濃縮管濃縮鐵蛋白粗提液。b)瓊脂糖s印harose 6B分子篩層析分離單體和多體(包括二聚體以及多聚體) 鐵蛋白①首先用0. 025M Tris-Hcl (pH = 7. 25)緩沖液平衡分子篩。②將鎳柱親和層析純化所得的蛋白液加入到層析柱中，然后用0. 25MTris-Hcl (PH 7. 25)緩沖液洗脫，紫外檢測蛋白質(zhì)的洗脫峰。③收集對應(yīng)于不同洗脫峰的蛋白質(zhì)，濃縮除鹽后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考 馬斯亮藍染色以及鐵染檢測純度。5)對產(chǎn)品進行蛋白質(zhì)定量(BCA法)。按照本發(fā)明所純化的鐵蛋白在經(jīng)過一步鎳柱親和層析后就能達到電泳純，在 SDS-PAGE中顯示為單條蛋白帶。然后通過瓊脂糖s印Harose 6B的分子篩純化可以進一步 分離得到單體鐵蛋白和多聚體鐵蛋白。應(yīng)用上述技術(shù)得到的鐵蛋白開辟了廉價動物組織或工程菌蛋白資源的高產(chǎn)值化 開發(fā)途徑。該技術(shù)路線結(jié)合鐵蛋白的耐熱特性以及兩種層析技術(shù)、能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)
6模高產(chǎn)量的純化生產(chǎn)。純化獲得的鐵蛋白均為電泳純級別(經(jīng)Native和SDS-PAGE檢測 均呈現(xiàn)鐵蛋白特征條帶)。而且獲得的單體純度高，可達90-95%，僅含極微量多聚體。整 個分離純化周期短，約3-4天。相對前人的分離純化技術(shù)來說，整個實驗流程費用低，產(chǎn)量 高。目前尚未見到有關(guān)上述技術(shù)路線的相關(guān)報道。僅見國際專利DE3927139(A1)和中國專 利CN101461440(A)涉及鐵蛋白和鐵蛋白酶解多肽的分離純化。其中國際DE3927139使用 酶解法純化鐵蛋白，實驗技術(shù)與本發(fā)明完全不同。中國專利CN101461440(A)發(fā)明內(nèi)容是酶 解獲得鐵蛋白的多肽片斷，而不是完整的鐵蛋白分子，這也與本發(fā)明內(nèi)容不同。目前文獻報 道的鐵蛋白純化流程存在操作步驟繁瑣造成產(chǎn)率低、耗時長以及試驗費用高等缺點。本發(fā) 明利用在實驗過程中發(fā)現(xiàn)鐵蛋白在不需要His標簽的條件下，直接就可以對鎳就有高度的 親和性，從而利用鎳柱親和層析進行高結(jié)合量、快速簡潔地分離。解決了離子交換層析結(jié)合 量有序，需要分段洗脫的不足；并且分子篩層析中改選s印harose 6B填料，非常適合分離 分子量為450KD-505KD的鐵蛋白分子(不同物種由于鐵蛋白所含的H、L兩種亞基的比例不 同，所以分子量有所差異)，分離單體和多聚體的效果極佳。上述本發(fā)明不同于前人文獻報 道或?qū)＠帲彩潜景l(fā)明純化技術(shù)的核心步驟。因此，目前尚未見有關(guān)上述技術(shù)的相關(guān)報 道。以下結(jié)合附圖作進一步說明。實施例11)原料市場上購買新鮮的豬脾臟1-2條，顏色為深紅色，富含鐵蛋白。2)前處理使用干凈的手術(shù)剪刀將脾臟腹面的白色筋膜等結(jié)締組織剔除，然后切 碎成小塊。按質(zhì)量1 1.5-2的比例加入去離子水。在低溫的冰水的保護下，用組織搗碎 機高速研磨脾臟組織成勻漿，約20-30分鐘。用10層紗布過濾除掉未勻漿好的組織塊、筋 膜等結(jié)締組織和脂肪組織，獲得勻漿液。3)提取粗蛋白將勻漿液在70-75°C恒溫水浴鍋中，攪拌熱變性處理20min，可看 見大部分非耐熱蛋白變性沉淀。迅速將勻漿液置于4°C冰浴至室溫，在4°C，10，OOOg下離心 20-30min，收集上清液備用。然后按52g/100ml的比例在上清液中加入事先研磨成粉末的 硫酸銨，加入時要求極其緩慢且邊攪拌邊加入，放置在4°C冰箱6-12小時，具體時間視蛋白 質(zhì)濃度而定。待沉淀完全后，于4°C，10, OOOg下離心30min，收集沉淀。用50mM Tris-Hcl (pH 7. 25)緩沖液溶解沉淀，獲得粗蛋白液。置于透析袋中充分透析G°C，24-36h)，于4°C， 10，OOOg下離心20min，取上清液，去除雜蛋白和硫酸銨。4)分離純化獲得的粗蛋白液首先進行鎳柱親和層析。將獲得粗蛋白液加入到M-NTA層析柱 中，使蛋白與Ni-NTA充分結(jié)合。將結(jié)合鐵蛋白的Ni-NTA用50mM 1Tr i s緩沖液洗滌，約10-15 個柱體積。目的去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。然后加入競爭性250mM咪唑緩沖液，洗脫目的 鐵蛋白，收集洗脫液并濃縮純化的鐵蛋白。再進行瓊脂糖wpharose 6B分子篩層析分離單 體和多體(包括二聚體以及多聚體)鐵蛋白首先用0. 25M Tris-HcKpH為7. 25)緩沖液平 衡分子篩。平衡好分子篩后，使用一次性注射器外連接0. 22 μ m濾膜將蛋白液過濾后直接 上柱。然后用0.025M Tris-HcKpH為7. 25)緩沖液洗脫，紫外檢測蛋白質(zhì)的洗脫峰。收集 對應(yīng)于不同洗脫峰的蛋白質(zhì)。分布收集單體和多聚體進行濃縮除鹽，然后進行聚丙烯酰胺 凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色檢測純度。圖Ia是純化的單體豬脾鐵蛋白的負染透射電鏡照片，由圖可知所純化得到的豬脾鐵蛋白具有完整的蛋白殼和鐵核，具有很好的單分散性，無 聚集現(xiàn)象。圖Ib是純化的多聚體豬脾鐵蛋白的負染透射電鏡照片，由圖可知多聚體顯示為 單個鐵蛋白聚集在一起。圖2是豬脾鐵蛋白經(jīng)過鎳柱親和層析后的SDS聚丙烯酰胺凝膠電 泳圖，由圖可知所純化的豬脾鐵蛋白已經(jīng)基本達到電泳純。圖3是經(jīng)過分子篩kpHar0Se6B 分離前后的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，由圖可知經(jīng)過分子篩后很好地分離得到高純度的單體 鐵蛋白。實施例2在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)含有重組人源鐵蛋白H亞基質(zhì)粒的大腸桿菌BL21菌株， 離心收集菌體。將菌體用去離子水混勻，使用超聲破碎，將細胞破碎液在4°C下10，OOOg 離心30min，收集上清。將上清在70-75°C恒溫水浴鍋中，攪拌熱變性處理20min，可看見 大部分非耐熱蛋白變性沉淀。迅速將勻漿液置于4°C冷卻至室溫，在4°C，10，OOOg下離心 20-30min，收集上清液備用。然后按52g/100ml的比例在上清液中加入硫酸銨沉淀蛋白，放 置在4°C冰箱中6-12小時。待沉淀完全后，于4°C，10，000g下離心30min，收集沉淀。用 50mM Tris-Hcl (pH為7. 25)緩沖液溶解沉淀，獲得粗蛋白液，再經(jīng)過透析去除硫酸銨。獲得 的粗蛋白液首先進行His鎳柱親和層析。將獲得粗蛋白液加入到M-NTA層析柱中，使蛋白 與Ni-NTA充分結(jié)合。將結(jié)合鐵蛋白的Ni-NTA用50mM Tris緩沖液洗滌，約10-15個柱體 積。目的去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。然后加入競爭性250mM咪唑緩沖液，洗脫目的鐵蛋 白，收集洗脫液并濃縮純化的鐵蛋白。再進行瓊脂糖sepHarose 6B分子篩層析分離單體和 多體(包括二聚體以及多聚體)鐵蛋白首先用0. 25M Tris-Hcl (pH為7. 25)緩沖液平衡 分子篩。平衡好分子篩后，使用一次性注射器外連接0. 22 μ m濾膜將蛋白液過濾后直接上 柱。然后用0.025M Tris-HcKpH為7. 25)緩沖液洗脫，紫外檢測蛋白質(zhì)的洗脫峰。收集對 應(yīng)于不同洗脫峰的蛋白質(zhì)。分布收集單體和多聚體進行濃縮除鹽，然后進行聚丙烯酰胺凝 膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色檢測純度。圖4是重組人源鐵蛋白H亞基的純化圖，由圖可知所 純化的重組人源鐵蛋白為電泳純。圖5是重組人源H亞基鐵蛋白的單體電鏡照片，由圖可 知所純化的單體重組人源鐵蛋白的蛋白殼完整，無內(nèi)部鐵核。單體鐵蛋白分散性極好，沒有 聚集行為。
權(quán)利要求
1.一種從生物組織或工程菌中分離純化單體鐵蛋白的方法，其主要步驟如下1)將生物組織或工程菌按質(zhì)量1 1.5-2的比例加入去離子水，冰水保護下，研磨成勻 漿，過濾得到勻漿液；2)將勻漿液在70-75°C中攪拌熱變性處理去除非耐熱蛋白，收集上清液；在上清液中 加入硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，沉淀完全后離心收集沉淀；用緩沖液溶解沉淀，獲得粗蛋白液；3)將粗蛋白液依次進行鎳柱親和層析-分子篩層析，進行分離純化；鎳柱親和層析獲 得的蛋白液中所含的鐵蛋白為電泳純，分子篩層析以分離單體和多體鐵蛋白；分子篩為瓊 月旨糖 sepharose 6B 或者 superose 6 ；4)蛋白質(zhì)濃縮，除鹽；電泳檢測單體和多體蛋白質(zhì)純度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的生物組織為新鮮或_80°C至_40°C冷凍保存 動物的組織或器官；工程菌為表達重組人鐵蛋白的H鏈、重組人鐵蛋白的L鏈、重組人鐵蛋 白的H鏈和L鏈的組裝體、重組人鐵蛋白的H鏈的突變體或融合蛋白和重組人鐵蛋白的L 鏈的突變體或融合蛋白的表達菌株。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟1中的研磨包括機械勻漿、液氮勻漿或超聲破碎。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟1中機械勻漿和超聲破碎需用冰水降溫，防止 局部溫度過高蛋白質(zhì)降解。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟2中的熱變性處理時間為15-20分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟2中的離心條件為0-4°C，離心機轉(zhuǎn)速為 10，OOOg,時間為20-30分鐘。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟2中的緩沖液為pH= 7. 25的Tris-Hcl緩沖液。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟3中的層析是在10倍體積的pH= 7. 25的 50mM Tris-Hcl中透析24-36小時，溫度為0-4"C。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟3中的親和層析填料采用商品Ni-NTA親和層 析介質(zhì)。
全文摘要
一種從生物組織或工程菌中分離純化鐵蛋白的方法，以富含鐵蛋白的動物組織或器官或發(fā)酵收集含有重組鐵蛋白基因的工程菌作為提取鐵蛋白的原料，機械研磨或超聲破碎成勻漿液，過濾好的勻漿液經(jīng)過70-75℃水中熱變性處理20min，離心取上清液，獲得粗蛋白液。將得到的粗蛋白液透析平衡后，進行鎳柱親和層析，用競爭性250mM咪唑緩沖液，洗脫獲得電泳純的鐵蛋白。再將鐵蛋白進一步進行sepHarose 6B分子篩排阻層析，獲得分離的單體鐵蛋白和多聚體鐵蛋白。本發(fā)明所純化的鐵蛋白在不需要任何標簽的條件下，直接進行鎳柱親和層析即可得到電泳純的鐵蛋白，因而極大地省略了鐵蛋白的純化步驟。
文檔編號C07K1/22GK102127166SQ201010034208
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日
發(fā)明者曹長乾, 潘永信, 田蘭香 申請人:中國科學(xué)院地質(zhì)與地球物理研究所