專利名稱：巢蛋白部分多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種巢蛋白部分多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
巢蛋白(Nestin)是中間絲蛋白家族成員，它的結(jié)構(gòu)包括一個(gè)極短的N-末端和一 個(gè)很長的C-末端，這種結(jié)構(gòu)上的特殊性決定了 Nestin不能進(jìn)行自組裝，而只能與其它的IF 蛋白構(gòu)成異源二聚體或混合多聚物。Nestin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控同樣具有獨(dú)特性。Nestin基 因內(nèi)有3個(gè)內(nèi)含子，結(jié)構(gòu)具有一般中間絲的特征。轉(zhuǎn)基因研究顯示，Nestin基因的第1、2內(nèi) 含子中有兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞型特異調(diào)節(jié)因子，分別指導(dǎo)發(fā)育中的肌細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞報(bào)告 基因的表達(dá)。調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)Nestin的增強(qiáng)子又有兩個(gè)一 個(gè)位于第2內(nèi)含子，是調(diào)控胚胎絕大部分神經(jīng)管的神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的泛CNS增強(qiáng)子(Pan CNS Hancer)。另一個(gè)則是調(diào)控胚胎中腦神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的區(qū)域特異性增強(qiáng)子(Region Specificen Hancer)。巢蛋白最初在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)前體細(xì)胞中被克隆，并作為神 經(jīng)干/祖細(xì)胞的特異性標(biāo)志物而被廣泛應(yīng)用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物胚胎發(fā)育過 程中，Nestin廣泛表達(dá)于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、肌肉前體細(xì)胞、肝卵圓細(xì)胞、部分中樞 中胚層間質(zhì)組織等。在成體組織中Nestin表達(dá)細(xì)胞主要出現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的側(cè)腦室、嗅 球、齒狀回等部位以及毛囊、胰腺等特定組織；在機(jī)體損傷或某些病理?xiàng)l件下，可觀察到部 分終末分化的細(xì)胞重新表達(dá)Nestin并進(jìn)入增殖、分化和遷移的狀態(tài)，這說明Nestin陽性細(xì) 胞可能直接參與了胚胎階段的大量表達(dá)。目前國內(nèi)外已有針對鼠源，人源等哺乳動物的Nestin單克隆或多克隆抗體，主要 用于哺乳動物Nestin陽性細(xì)胞的篩選及神經(jīng)干/祖細(xì)胞的鑒定。但由于針對禽類的Nestin 單克隆或多克隆抗體尚沒有已公布的專利及商品化產(chǎn)品，這就影響了與之相關(guān)研究的發(fā) 展，因此，開發(fā)并研制禽類特異性的Nestin單克隆或多克隆抗體具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種巢蛋白部分多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的巢蛋白(Nestin)部分多肽，其氨基酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的巢蛋白(Nestin)部分多肽，可用來制備免疫原，該免疫原免疫動物可獲 得與Nestin特異結(jié)合的多克隆抗體。對在動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)而言，大多數(shù)多肽的分子量都太小，將多肽與載體蛋 白如匙孔血藍(lán)蛋白或牛血清白蛋白等交聯(lián)之后，不僅能增加抗原的大小，也能增強(qiáng)免疫性。因此，本發(fā)明還提供了 一種復(fù)合蛋白。本發(fā)明所提供的復(fù)合蛋白是所述多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白。本發(fā)明的復(fù)合蛋白中，所述載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白或牛血清白蛋白。在免疫動物時(shí)，為了增強(qiáng)免疫原性通常將復(fù)合蛋白與免疫佐劑混合。本發(fā)明所提供的免疫原，是所述復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物。
本發(fā)明的與禽源巢蛋白特異結(jié)合的多克隆抗體，是用免疫原免疫動物，采取免疫 后動物的血液，獲得的血清；所述免疫原是復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復(fù)合蛋白 是多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的與禽源巢蛋白特異結(jié)合的多克隆抗體，其中，所述載體蛋白為匙孔血藍(lán) 蛋白或牛血清白蛋白。本發(fā)明的免疫原免疫動物獲得了較高效價(jià)的免疫血清，經(jīng)ELISA檢驗(yàn)效價(jià)高于 1 62500，并且免疫印跡法證明該免疫血清與能與禽源神經(jīng)干/祖細(xì)胞或Nestin陽性細(xì) 胞表面分子特異結(jié)合，免疫血清能在細(xì)胞水平上檢測禽源巢蛋白的表達(dá)。


圖1為免疫印跡法檢測免疫血清的特異性。圖2為空白對照組激光共聚焦顯微鏡下顯示結(jié)果的圖片；A為FITC熒光圖片，B為PI熒光染色圖片，C為相差圖片，標(biāo)尺為50 μ m。圖3為對照血清組激光共聚焦顯微鏡下顯示結(jié)果的圖片；A為FITC熒光圖片，B為PI熒光染色圖片，C為相差圖片，標(biāo)尺為50 μ m。。圖4為免疫血清組激光共聚焦顯微鏡下顯示結(jié)果的圖片；A為FITC熒光圖片，B為PI熒光染色圖片，C為相差圖片，標(biāo)尺為50 μ m。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、與禽類的巢蛋白特異結(jié)合的多克隆抗體(一 )合成免疫原人工合成免疫多肽，其氨基酸序列為CGEEDVQD⑶NPPATETS。人工合成對照多肽，其氨基酸序列為LDQELASFSQSLEGFRC。對人工合成的多肽進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，人工合成的免疫多肽分子量為1865. OlDa，高效液相色譜O20nm，C18， 線性梯度)檢測其純度達(dá)95%對照多肽分子量為1930. 12Da, HPLC檢測純度為94%。( 二 )與禽類的巢蛋白特異結(jié)合的多克隆抗體免疫多肽與載體蛋白按照質(zhì)量比1 1偶聯(lián)，形成多肽-載體復(fù)合蛋白，載體蛋白 可以為匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，本實(shí)施例為免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白。對照多肽與KLH按照質(zhì)量比1 1偶聯(lián)，形成對照多肽-KLH復(fù)合蛋白。免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白與費(fèi)氏完全佐劑(Sigma)混合，制成免疫原。對照多肽-KLH復(fù)合蛋白與費(fèi)氏完全佐劑(Sigma)混合，制成對照免疫原。用上述制備的免疫原和對照免疫原分別免疫SPF新西蘭大耳兔。20周齡以內(nèi)，2. 5-3Kg的SPF新西蘭大耳兔，隨機(jī)分成兩組，免疫多肽組和對照多 肽組，每組2只。免疫多肽組注射免疫原，對照多肽組注射對照免疫原。免疫的具體過程如下第1周，每天多點(diǎn)背部皮下注射免疫SPF新西蘭大耳兔一次，每只SPF新西蘭大耳 兔注射免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白或?qū)φ斩嚯?KLH復(fù)合蛋白的總量為0. Img ；
4
第2周，對SPF新西蘭大耳兔不做任何處理；第3周-第7周，每天多點(diǎn)背部皮下注射免疫SPF新西蘭大耳兔一次，每只SPF新 西蘭大耳兔注射免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白或?qū)φ斩嚯?KLH復(fù)合蛋白的總量為0. Img ； 第7周免疫結(jié)束，處死SPF新西蘭大耳兔，從耳部及心臟采取150ml血液，用促凝 劑促凝，3000轉(zhuǎn)離心20分鐘。免疫多肽組獲得免疫血清01和02。對照多肽組獲得對照血清01和02。ELISA檢測免疫血清和對照血清的效價(jià)，具體方法如下1)雞巢蛋白用PBS配成100μ g/ml的溶液，按100 μ 1/每孔加入96孔酶標(biāo)板，4°C 過夜吸附；2)次日將過夜包被的酶標(biāo)板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3% (質(zhì)量百分比)BSA (用PBS配制不含Tween20,)封閉，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5小時(shí)；3)用PBS徹底洗2)中的沉淀4次后加入免疫血清或?qū)φ昭?用PBS按體積比 為 1 100、1 500、1 2500、1 12500 或 1 62500 稀釋)，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5 小 時(shí)；4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加二抗(羊抗兔IgG用PBS按體積比為1 10000 稀釋)，100 μ 1/每孔，37°C，lhr ；5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加AP顯色液P-NPP (2mg/ml)，80 μ 1/每孔，避光反 應(yīng)，加等體積0. 2Μ NaOH終止反應(yīng)。6)取100 μ 1 5)中終止反應(yīng)后的溶液100 μ 1，用酶標(biāo)儀測定405nm下的OD值。
實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以三次的平均值表示。血清效價(jià)檢測結(jié)果如表1和圖1所示；表1.血清效價(jià)檢測結(jié)果
稀釋倍數(shù)100500~ 2500 12500 62500
對照血清 010. 572 0. 581 0.211 0.031 0.008 0.006~
免疫血清 011.429 1.429 1. 194 0.677 0. 192 0.005~
對照血清 020. 520 0. 514 0. 197 0. 023 0. 006 0. 006~
免疫血清 021. 394 1.337 1.076 0.488 0. 152 0.005~免疫血清效價(jià)檢測結(jié)果表明，免疫血清能和雞巢蛋白特異結(jié)合，其效價(jià)可達(dá)到為 1 62500;對照血清與巢蛋白特異結(jié)合能力弱。(三)免疫血清的特異性從雞腹股溝處脂肪組織中提取脂肪干細(xì)胞，常規(guī)方法培養(yǎng)，傳代，取第3代細(xì)胞采 用化學(xué)誘導(dǎo)法誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞，提取由體外培養(yǎng)的雞的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成的神經(jīng)細(xì)胞的總 蛋白，免疫印跡法檢測免疫血清與雞的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成的神經(jīng)細(xì)胞中的巢蛋白結(jié)合能力 的特異性(免疫血清1 1000稀釋)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，可見明顯的條帶，其大小為250KD左右，在小于250KD的位 置有十分不明顯的條帶，說明免疫血清與雞的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成的神經(jīng)細(xì)胞中的巢蛋白特 異性結(jié)合，與其他蛋白的結(jié)合力很弱。(四)細(xì)胞水平上檢測巢蛋白的表達(dá)使用免疫組化法檢測雞的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成的神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)。
設(shè)置空白對照組、對照血清組和免疫血清組。空白對照組采用PBS作為一抗，羊抗兔IgG(中杉金橋Zf-0311)作為二抗；對照血清組采用對照血清01作為一抗(1 500稀釋)，羊抗兔IgG(中杉金橋 Zf-0311)作為二抗；免疫血清組采用免疫血清01作為一抗(1 500稀釋)，羊抗兔IgG(中杉金橋 Zf-0311)作為二抗；免疫組化具體方法如下1、標(biāo)本制備將細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被的蓋玻片，待細(xì)胞在蓋玻片上貼壁，PBS清洗三次， 4%的多聚甲醛固定。2、染色1)固定后的蓋玻片在0. 25% Tritonx-IOO通透15分鐘；2)用 PBS 洗 2min/ 次 X 3 次；3)加一滴封閉用山羊血清于蓋玻片上封閉30分鐘；4)倒掉或吸干液體；5)每張蓋玻片加IOOul —抗，濕盒內(nèi)孵育30 60分鐘；6)用 PBS 洗 2min/ 次 X 3 次；7)每張蓋玻片加一滴二抗，孵育60分鐘；8)用 PBS 洗 2min/ 次 X 3 次；9)鏡檢。激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫組化結(jié)果，空白對照組的結(jié)果如圖2所示，對照血 清組的結(jié)果如圖3所示，在顯微鏡下空白對照組和對照血清組均沒有熒光，表明PBS和對照 血清均不能和雞的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成的神經(jīng)細(xì)胞中的巢蛋白特異結(jié)合；免疫血清組的結(jié)果 如圖4所示，在顯微鏡下95%的細(xì)胞有熒光，表明免疫血清能與雞的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成的 神經(jīng)細(xì)胞中的巢蛋白特異結(jié)合。綜合上述結(jié)果表明，免疫多肽與載體蛋白偶聯(lián)后的復(fù)合蛋白為主要成分的免疫原 可以刺激動物產(chǎn)生免疫血清，該免疫血清可與雞的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成的神經(jīng)細(xì)胞中的巢蛋 白特異性結(jié)合，能在細(xì)胞水平上檢測雞的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成的神經(jīng)細(xì)胞中的巢蛋白的表 達(dá)。以上的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn) 行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方 案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
<120>巢蛋白部分多肽及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><230><400>1Cys Gly Glu Glu Asp Val Gln Asp Gly Asp Asn Pro Pro Ala Thr Glu151015Thr Ser<210>2<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><230>
<400>2Leu Asp Gln Glu Leu Ala Ser Phe Ser Gln Ser Leu Glu Gly Phe Arg151015Cys
權(quán)利要求
1.一種多肽，其氨基酸序列為序列表中的序列1。
2.一種復(fù)合蛋白，是多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為 序列表中的序列1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合蛋白，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白或牛 血清白蛋白。
4.一種免疫原，是復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復(fù)合蛋白是多肽與載體蛋白偶 聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白或牛血 清白蛋白。
6.權(quán)利要求4或5所述的免疫原在制備多克隆抗體中的應(yīng)用。
7.與禽源巢蛋白特異結(jié)合的多克隆抗體，是用免疫原免疫動物，采取免疫后動物的血 液，獲得的血清；所述免疫原是復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復(fù)合蛋白是多肽與載 體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多克隆抗體，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白或 牛血清白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種巢蛋白部分多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明的巢蛋白部分多肽，其氨基酸序列為序列表中的序列1。所述多肽與載體蛋白偶聯(lián)可形成復(fù)合蛋白。所述載體蛋白可以為匙孔血藍(lán)蛋白或牛血清白蛋白。所述復(fù)合蛋白和免疫佐劑混合的混合物可作為免疫原。本發(fā)明的免疫原免疫動物獲得了較高效價(jià)的免疫血清，經(jīng)ELISA檢驗(yàn)效價(jià)高于1∶62500，免疫血清能在細(xì)胞水平上檢測禽源巢蛋白的表達(dá)。
文檔編號C07K14/795GK102127150SQ20101003442
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者侯玲玲, 關(guān)偉軍, 馮寶剛, 宮雪蓮, 浦亞斌, 王磊, 趙倩君, 馬月輝 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所