專利名稱：一種布舍瑞林的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物合成領(lǐng)域，具體涉及一種純液相片段法合成布舍瑞林的新方法。
背景技術(shù)：
布舍瑞林(Buserelin)，其化合物化學式為Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (TBU)-
Leu-Arg-Pro-NHET，結(jié)構(gòu)式如下
、 布舍瑞林的合成方法主要包括固相合成和液相合成兩種。 固相合成中需要使用大量的昂貴的多肽樹脂，這給企業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)帶來了成本 的壓力，不僅如此，在最后切肽的工序中，叔丁基很容易在酸性條件下被脫除，將生成其他 雜質(zhì)產(chǎn)物。 從現(xiàn)有的各種資料研究狀況來看，液相合成布舍瑞林是現(xiàn)階段各大公司和學?？?研機構(gòu)的主要方法。例如 專利W097/48726中就報導了類似化合物的液相合成方法，采用了 2+4+3的片段合 成法。三個肽片段分別為二肽片段為Pyr-His-0H，四肽片段為Trp-Ser-Tyr-X-Oet (X為 D-Leu，D-Trp，D-Val)，三肽為Leu-Arg-Pro-NHEt。然后，通過制備二肽片段的HONB活化酯 與四肽片段縮合，得到目標六肽化合物。通過將六肽造化得到游離羧基，之后再次制備六 肽片段的HONB活化酯，然后和三肽縮合，得到目的九肽產(chǎn)品。但是由于在此過程中都采用 HONB活化酯，操作相對比較復雜，從而導致收率下降，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
專利EP1008656報導了另外一種液相合成此類化合物的方法，也是采用了片段縮 合法，但是采用的是3+2+4的片段法。三個多肽片段分別為三肽片段Pyr-His-Trp-OR，二 肽片段Z-Ser-Tyr-0R1，四肽片段為X-Leu-Arg-Pro-NHEt (D-Leu， D-Trp， D-Val)。然后通 過2+4合成Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-NHEt (或者Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro_AZgly-NH2)，最 后，Pyr-His-Trp-OR與六肽片段縮合，在次縮合過程中的創(chuàng)新點在于使用了蛋白酶催化劑， 但是最大的問題也正是在于使用酶催化后產(chǎn)物不易提純。 另外，還有文獻報導了利用迭氮化合物來合成此類化合物的方法。在文獻 biochemical andbiophysical research communications 1978，Vol 81，N02，Page382_390 中提到的4+3+2片段縮合法，就是采用了迭氮化合物法來片段縮合的。步驟如下1、合 成Z-Pro-X (X為Azgly-NH2， -NHEt)，然后合成二月太片段Boc-Arg (N02) -Pro-X ;2、合成Z_Tyr(Bzl)_B_Leu_Ome(B為D-Phe， D-Ser(Tbu)) ;3、合成Pyr_A_Trp_Ser_Ome(A為His, D-Phe)。然后，通過迭氮化合物法先將二肽和三肽縮合成Z-Tyr (Bzol) -B-Leu-Arg (N02) _P ro-X，最后再次通過迭氮化合物法先將五肽和四肽縮合成Pyr-A-Trp-Ser-Tyr (Bzl) -B-Leu -Arg(N02) -Pro-X.雖然，采用迭氮化合物法能夠有效的抑制消旋，但是由于迭氮化合物法在 縮合的時候，反應(yīng)條件比較苛刻，反應(yīng)十分危險，所以不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
在文獻Journal of Medicinal Chemistry 1978， Vol21， N010， Pagel018 1024 中，報導了另外一種采用迭氮化合物來合成此類化合物的方法。采用的是2+2+3+2的合成 策略，具體步驟如下l、合成二肽片段Pyr-His-Ome ;2、合成二肽片段Z-Trp-Ser-Ome ;3、合 成三肽片段Z-Tyr (Bzl) -A-Leu-Ome (其中A為Gly， Ser， D-Phe， D-Tyr (Ome) ， D-Ser (Tbu)); 4、合成Boc-Arg(N02)-Pro-C(其中C為-Azgly_NH2， -NHEt， -Gly);最后，將這些片段通過 迭氮化合物法串聯(lián)縮合起來，形成Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-A-Leu-Arg-Pro-C，但是它也存在 著迭氮化合物合成法的通病，不適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種適合放大生產(chǎn)、收率高、純度好 的布舍瑞林合成方法，采用了 5+4的片段合成法。 —種布舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr -D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH與四肽片段 D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在縮合劑的存在下縮合而成。其合成線路如圖1所示。
進一步地，所述的縮合劑優(yōu)選為氯甲酸叔丁酯。
上述五肽片段中的OH可以用0Me、 0H、 OET、 OBzl或OTbu替代。
進一步地，所述的五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH由以下步驟合成首先合成 Tyr(R5)-0Me，再與a氮端保護的R12-Ser (R4)反應(yīng)，生成R12_Ser (R4)-Tyr (R5)-OMe，脫 保護，與a氮端保護的R13-Trp (R3)反應(yīng)，生成R13-Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，脫保 護，與a氮端保護的R14-His (R2)反應(yīng)，生成R14-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -0M e，脫保護，與a氮端保護的Rl-Pyr反應(yīng)，生成Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5 )-OMe，最后進行皂化和脫除側(cè)鏈保護基，得到五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH。其合成 線路如圖2所示。 所述的五肽片段Pyr-Hi s-Trp-Ser-Tyr-OH還可以由以下步驟合成首先 合成Rl-Pyr的活化酯，再與羧基端保護His (R2)反應(yīng)，生成Rl-Pyr-His (R2);合成 Rl-Pyr-His(R2)的活化酯，與羧基端保護Trp (R3)反應(yīng)，生成Rl-Pyr-His (R2)-Trp (R3); 合成Rl-Pyr-His (R2)-Trp (R3)的活化酉旨，與羧基端保護Ser(R4)反應(yīng)，生成 Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4);合成Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4)的活化酯，與 羧基端保護Tyr(R5)反應(yīng)，生成Rl-Pyr-His (R2)-Trp (R3)-Ser (R4)-Tyr (R5)-OMe，最后進 行皂化和脫除側(cè)鏈保護基，得到五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH。其合成線路如圖3所 示。 上述五肽片段的合成步驟中，Rl可以為BOC、 Z、 Fmoc或H ;R2可以為B0C、 Z、 Bzl、 Trt、 Tos、 Bom、 Dnp或H ;R3可以為B0C、 For、 H或Z ;R4可以為Bzl、 H、 Tbu、 Z、 Boc或Tos ; R5可以為Bzl、H、Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-C1-Z ;Rll可以為無機鹽或有機物；R12可
4以為B0C、 Z或Fmoc ;R13可以為B0C、 Z或Fmoc ;R14可以為B0C、 Z或Fmoc。
進一步地，所述的四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt由以下步驟合成 首先合成R8-Pro-NHEt ，脫保護，再與a氮端保護、側(cè)鏈R7保護的R9_Arg (R7) -OH反 應(yīng)，生成a氮端保護的R9-Arg(R7)-Pro-NHEt ;脫保護，與a氮端保護的RlO-Leu-OH 反應(yīng)，生成a氮端保護的R 10-Leu-Arg (R7) -Pro-NHEt ;脫保護，與R6-D-Ser (Tbu) -OH 反應(yīng)，生成R6-D-Ser (Tbu)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt ;最后脫保護得到四肽片段 D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt 。其合成線路如圖4所示。 所述的四肽片段D-Ser (Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt由以下步驟合成 首先合成R6-D-Ser(Tbu)的活化酯，然后與羧基端保護R6_Leu反應(yīng)，生成 R6-D-Ser (Tbu) -Leu ;合成R6-D-Ser (Tbu) -Leu的活化酯，與羧基端保護Arg (R7)反應(yīng)， 生成R6-D-Ser (Tbu)-Leu-Arg(R7);合成R6-D-Ser (Tbu)-Leu-Arg(R7)的活化酯，與 Pro-NHEt反應(yīng)，生成R6-D-Ser (Tbu)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt ;最后脫保護得到四肽片段 D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt 。其合成線路如圖5所示。 上述四肽片段的合成步驟中，R6可以為B0C、 Z或Fmoc ;R7可以為B0C、 (B0C)2、 PBF、T0S、N02、H、PMC、HCL、AD0C或Mts ;R8可以為B0C、Z或Fmoc ;R9可以為B0C、Z或Fmoc R10可以為B0C、Z或Fmoc。 本發(fā)明方法適合于Pyr-A-Trp-Ser-Tyr-B-Leu-Arg-Pro-C此類化合物的合成， 其中A可以為His、 D-Phe ;B可以為Gly、 Ser、 D-Phe、 D-Tyr (Ome) 、 D-Ser (Tbu) ;C可以 為-Azgly-NH2，-NHEt，-Gly。在合成過程中，各種氨基酸保護基的變化，也不影響此方法的 應(yīng)用。 采用本發(fā)明方法5+4的片段合成法，可直接將五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH 和四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt 在縮合劑的存在下縮合成Pyr-His-Trp-Ser -Tyr-D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt 。本方法不但縮短了合成周期、避免了傳統(tǒng)方法中苛刻 的反應(yīng)條件，而且收率高、產(chǎn)品純度好、成本低、反應(yīng)條件溫和、適合于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1是本發(fā)明一種實施方式的合成線路示意圖其中R1-Pyr為氨基Rl保護的焦谷氨酸His (R2)為側(cè)鏈R2保護的組氨酸Trp (R3)為側(cè)鏈R3保護的色氨酸Ser (R4)為側(cè)鏈R4保護的絲氨酸Tyr(R5)為側(cè)鏈R5保護的酪氨酸R6-D-Ser (Tbu)為D型-側(cè)鏈(叔丁基)保護--氨基R6保護的絲氨酸Leu為亮氨酸Arg(R7)為側(cè)鏈R7保護的精氨酸Pro為脯氨酸圖2是五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH的一-種合成線路示意圖；其中R1-Pyr為氨基Rl保護的焦谷氨酸；R14-His (R2)為a氮端R14保護、側(cè)鏈R2保護的組氨酸;
R13-Trp (R3)為a氮端R13保護、側(cè)鏈R3保護的色氨酸； R12-Ser (R4)為a氮端R12保護、側(cè)鏈R4保護的絲氨酸； Tyr (R5) -R15為側(cè)鏈R5保護的酪氨酸； X為對硝基酯、0SU、0NB或0BT。 圖3是五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH的另一種合成線路示意圖； 其中R1-Pyr為氨基Rl保護的焦谷氨酸； NH2-His (R2) -R16為羧基端R14保護、側(cè)鏈R2保護的組氨酸； NH2-Trp (R3) -R17為a氮端R13保護、側(cè)鏈R3保護的色氨酸； NH2-Ser (R4)-R18為a氮端R12保護、側(cè)鏈R4保護的絲氨酸； Tyr (R5) -R15為側(cè)鏈R5保護的酪氨酸； X為對硝基酯、0SU、0NB或0BT。 圖4是四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt的一種合成線路示意圖； 其中NH2Et為乙基氨； R8-Pro為a氮端R8保護的脯氨酸； R9-Arg (R5)為a氮端R9保護、側(cè)鏈R5保護的精氨酸； R10-Leu為a氮端R10保護的亮氨酸； R6-D-Ser (Tbu)為a氮端R6保護、D型-側(cè)鏈(叔丁基)保護的絲氨酸； X為對硝基酯、0SU、0NB或0BT。 圖5是四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt的另一種合成線路示意圖； 其中NH2Et為乙基氨； R8-Pro為a氮端R8保護的脯氨酸； R9-Arg (R5)為a氮端R9保護，側(cè)鏈R5保護的精氨酸； R10-Leu為a氮端R10保護的亮氨酸； R6-D-Ser (Tbu)為a氮端R6保護，D型-側(cè)鏈(叔丁基)保護的絲氨酸； X為對硝基酯、0SU、0NB或0BT。 圖6是布舍瑞林粗產(chǎn)品HPLC譜圖； 圖7是純化后布舍瑞林產(chǎn)品的HPLC譜圖。
具體實施例方式
實施例1 :合成五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH 1 、 Fmoc-Ser (Tbu) -Tyr-OMe的合成 在50毫升的圓底燒瓶中加入Fmoc-Ser(Tbu)-0H(20mmo1)， NH2-Tyr-0Me(20mmo1) ， H0SU(22mmo1)，用無水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入 DCC(22mmo1)后，在室溫下攪拌2小時，檢測反應(yīng)完全。抽濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀，減壓濃縮 除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗滌，用稀鹽酸洗滌，飽和食鹽水洗滌，用無 水硫酸鈉干燥，旋干乙酸乙酯，得到淺黃色固體(Fmoc-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。 HPLC純度大于92，收率為90. 5MS = 561 (M+)。 2 、 Fmoc-Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe的合成 稱取Fmoc-Ser (Tbu) -Tyr-OMe (20mmol)置于50毫升的圓底燒瓶中加入哌啶/DMF
6為25 %的溶液30毫升，在室溫下反應(yīng)30分鐘，檢測反應(yīng)完全，加入大量乙醚，析出大量沉
淀，過濾，沉淀用乙醚洗滌數(shù)次，干燥，得到白色產(chǎn)品(NH2-Ser (Tbu) -Tyr-OMe)。在50毫升的圓底燒瓶中加入Fmoc-Trp(Boc)-0H(20mmo1)，
NH2-Ser (Tbu) -Tyr-OMe (20mmol) ， H0SU (22mmol)，用無水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入
DCC(22mmo1)后，在室溫下攪拌2小時，檢測反應(yīng)完全。抽濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀，減壓濃縮
除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗滌，用稀鹽酸洗滌，飽和食鹽水洗滌，用無
水硫酸鈉干燥，旋干乙酸乙酯，得到淺黃色固體(Fmoc-Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe)。 HPLC純度大于93，收率為87MS = 847 (M+)。 3、 Fmoc-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe的合成 稱取Fmoc-Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe (20mmol)置于50毫升的圓底燒瓶中加入 哌啶/DMF為25%的溶液30毫升，在室溫下反應(yīng)30分鐘，檢測反應(yīng)完全，加入大量乙醚，析 出大量沉淀，過濾，沉淀用乙醚洗滌數(shù)次，干燥，得到白色產(chǎn)品(NH2-Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Ty r-0Me)。 在50毫升的圓底燒瓶中加入Fmoc-His (Boc) -0H(20mmol) ， NH2-Trp (Boc) -S er (Tbu) -Tyr-OMe (20mmol) ， H0SU (22mmol)，用無水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入 DCC(22mmo1)后，在室溫下攪拌2小時，檢測反應(yīng)完全。抽濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀，減壓濃縮 除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗滌，用稀鹽酸洗滌，飽和食鹽水洗滌，用無 水硫酸鈉干燥，旋干乙酸乙酯，得到淺黃色固體(Fmoc-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-0Me)。 HPLC純度大于93，收率為83MS = 1084 (M+)。 4、 Pyr-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe的合成 稱取Fmoc-His (Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-0Me(20mmo1)置于50毫升的圓底 燒瓶中加入哌啶/DMF為25%的溶液30毫升，在室溫下反應(yīng)30分鐘，檢測反應(yīng)完全，加入大 量乙醚，析出大量沉淀，過濾，沉淀用乙醚洗滌數(shù)次，干燥，得到白色固體產(chǎn)品(NH2-His (Boc )-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。 在50毫升的圓底燒瓶中加入Pyr-0H(20mmo1) ， NH2-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu )-Tyr-OMe (20mmo1) ， H0SU (22mmo1)，用無水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC (22mmo1) 后，在室溫下攪拌2小時，檢測反應(yīng)完全。抽濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀，減壓濃縮除去DMF，之 后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗滌，用稀鹽酸洗滌，飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干 燥，旋干乙酸乙酯，得到淺黃色固體(Pyr-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe)。
HPLC純度大于91，收率為80MS = 975 (M+)。
5 、 Pyr-Hi s-Trp-Ser-Tyr-OH的合成 稱取Pyr-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe (20mmol)置于50毫升的圓底燒 瓶中加入2N的氫氧化鈉溶液20ml和甲醇20ml，在室溫下攪拌1小時，檢測反應(yīng)完全。加入 稀酸調(diào)節(jié)HI值為2 6之間，出現(xiàn)大量的白色沉淀，過濾，干燥，得到白色產(chǎn)品(Pyr-His (B oc)_Trp(Boc)_Ser(Tbu)-Tyr-0H)。 將Pyr-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OH溶于6N/L的HC1/THF溶液30毫 升，在室溫下反應(yīng)30分鐘，檢測反應(yīng)完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，過濾，沉淀用乙醚 洗滌數(shù)次，干燥，得到白色產(chǎn)品(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-0H)。
HPLC純度大于90，收率為9IMS = 705 (M+l)。 實施例2合成四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt l、Fmoc_Pro_NHEt的合成稱取Fmoc-Pro-0H(20mmol)置于100毫升的圓底燒瓶中，用55毫升DMF溶解，之
后加入HOSU (22mmol)，冰水浴下加入DCC (22mmol)的DMF溶液20毫升，室溫下反應(yīng)4小時，
濾除沉淀，將溶液濃縮至40毫升，加入濃乙胺水溶液20毫升，室溫下反應(yīng)過夜，點板反應(yīng)完
成，濾除沉淀，將溶液除去，用大量乙酸乙酯溶解，用稀堿洗滌，食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干
燥，旋干溶劑，得到淺黃色固體(Fmoc-Pro-NHEt)。 HPLC純度大于92，收率為81 % MS = 365 (M+)。 2 、 Boc-Arg (N02) -Pro-NHEt的合成 稱取Fmoc-Pro-NHEt (20mmol)置于100毫升的圓底燒瓶中加入哌啶/DMF為25% 的溶液30毫升，在室溫下反應(yīng)30分鐘，檢測反應(yīng)完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，過濾， 沉淀用乙醚洗滌數(shù)次，干燥，得到白色固體產(chǎn)品(NH2-Pro-NHEt)。 在50毫升的圓底燒瓶中加入Boc-Arg (N02)-OH (20mmol)， NH2-Pro-NHEt (20mmol) ， H0SU(22mmo1)，用無水匿F40毫升溶解，在冰水浴下加入 DCC(22mmo1)后，在室溫下攪拌2小時，檢測反應(yīng)完全。抽濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀，減壓濃縮 除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗滌，用稀鹽酸洗滌，飽和食鹽水洗滌，用無 水硫酸鈉干燥，旋干乙酸乙酯，得到淺黃色固體(Boc-Arg(N02)-Pro-NHEt)。
HPLC純度大于93，收率為85% MS = 476 (M+Na)。
3、 Z-Leu-Arg (N02) -Pro-NHEt的合成 稱取Boc-Arg(N02)-Pro-NHEt(20mmo1)置于100毫升的圓底燒瓶中加入6N/L的 HC1/THF溶液20毫升，在室溫下反應(yīng)30分鐘，檢測反應(yīng)完全，減壓濃縮除去HC1/THF溶液， 殘留物中加入乙酸乙酯溶解，再減壓濃縮除去乙酸乙酯，如此重復數(shù)次，直到除盡HC1，得 NH2-Arg(N02)-Pro-NHEt 。 在50毫升的圓底燒瓶中加入Z-Leu-0H(20mmo1)， NH2-Arg (N02) -Pro-NHEt (20mmo1) ， H0SU (22mmo1)，用無水匿F40毫升溶解，在冰水浴下加 入DCC(22mmo1)后，在室溫下攪拌2小時，檢測反應(yīng)完全。抽濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀，減壓 濃縮除去匿F，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗滌，用稀鹽酸洗滌，飽和食鹽水洗滌， 用無水硫酸鈉干燥，旋干乙酸乙酯，得到固體(Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NHEt)。
HPLC純度大于90，收率為88% MS = 546 (M+)
4、 Z-Ser (Tbu) -Leu-Arg (N02) -Pro-NHEt的合成 稱取Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NHEt (20mmol)置于100毫升的圓底燒瓶中加入38. 5% 的HBr/AC0H溶液20毫升，在室溫下反應(yīng)15分鐘，檢測反應(yīng)完全，加入大量乙醚，析出大量沉 淀，過濾，沉淀用乙醚洗滌數(shù)次，干燥，得到白色固體產(chǎn)品(NH2-Leu-Arg (N02) -Pro-NHEt)。
在50毫升的圓底燒瓶中加入Z-Ser(Tbu)-0H(20mmol) ，NH2-Leu-Arg(N02)-Pro-N HEt(20mmo1) ， HOSU(22mmol)，用無水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmo1)后，在 室溫下攪拌2小時，檢測反應(yīng)完全。抽濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀，減壓濃縮除去DMF，之后用大 量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗滌，用稀鹽酸洗滌，飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，旋干 乙酸乙酯，得到固體(Z-Ser (Tbu)-Leu-Arg (N02)-Pro-NHEt)。
HPLC純度大于92，收率為79% MS = 735 (M+)。
5 、 Ser (Tbu) _Leu_Arg_Pro_NHEt的合成稱取Z-Ser(Tbu)-Leu-Arg(N02)-Pro-NHEt(20mmol)置于250毫升的圓底燒瓶中
加入10% Pd/C (lg)，甲醇100毫升，在室溫下0. 3MP情況下，反應(yīng)4天，檢測反應(yīng)完全，濾除
Pd/C，旋干得到白色固體(Ser (Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt)。HPLC純度:大于95，收率為97% MS = 554(M+1)。 實施例3Pyr-Hi s-Trp-Ser-Tyr-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt的合成在50毫升的圓底燒瓶中加入Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-0H(20mmo1)，用無水DMF40毫
升溶解，在冰鹽浴下加入氯甲酸叔丁酯(8ml)，反應(yīng)5-20分鐘，加入NH2-Ser (Tbu) -Leu-Arg
-Pro-NHEt (20mmol)的DMF溶液20毫升，在冰鹽浴下反應(yīng)60分鐘，在室溫下攪拌12小時，
檢測反應(yīng)完全。抽濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀，減壓濃縮除去DMF，得到淺黃色粗產(chǎn)品(Pyr-His
_Trp_Ser_Tyr_Ser(Tbu)_Leu_Arg_Pro_NHEt)。 HPLC純度大于85，收率為72% MS = 1240 (M+l)。布舍瑞林粗產(chǎn)品HPLC譜圖如 圖6所示。 實施例4產(chǎn)品純化
此過程共分為4個步驟樣品前處理、純化、凍干、包裝
1、 樣品前處理
PH調(diào)整使用稀TFA水溶液調(diào)整ra在1. 0-3. 5之間 過濾使用直徑=300咖、孔徑=0. 45um微孔濾膜過濾
2、 純化條件
2. 1制備柱15cm X 30cm柱Kromasil 10um C18反相色譜±真料顆粒 2. 2流動相A :0. 1 % TFA水溶液B :ACN
時間(分鐘)流動相BX 流速(ml/min)

















05%250
1027%400
10052%400
2. 3上樣
平衡用約2個柱體積5% B流動相，平衡柱子10分鐘
上樣量5g目的肽
上樣流速250ml/min 檢測波長230nm 同時監(jiān)測壓強 2.4收樣
執(zhí)行梯度洗脫，當主峰流出時開始收集餾分，直到檢測器吸光度小于0. 1AU時或 者主峰流出后達到主要拐點時停止。同時用反向HPLC監(jiān)測各餾分純度。本方法得到的產(chǎn) 品純度達到98. 0%以上純度。
2. 5濃縮
通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮餾分
3、凍干
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凍干盤使用大鐵盤(厚度< lcm) 預凍時間在冷阱中預凍7h以上 冷凍干燥機凍千 4、包裝 凍干成干粉后，分裝于潔凈容器內(nèi)。 純化后布舍瑞林產(chǎn)品的HPLC譜圖如圖7所示。
權(quán)利要求
一種布舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH與四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在縮合劑的存在下縮合而成。
2. 如權(quán)利要求1所述布舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的縮合劑為氯甲酸叔丁酯。
3. 如權(quán)利要求1所述布舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的五肽片段 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH由以下步驟合成首先合成Tyr(R5)-0Me，再與a氮端保護的 R12-Ser(R4)反應(yīng)，生成R12-Ser (R4)-Tyr (R5)-OMe，脫保護，與a氮端保護的R13_Trp (R3) 反應(yīng)，生成R13-Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，脫保護，與a氮端保護的R14-His (R2)反 應(yīng)，生成R14-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，脫保護，與a氮端保護的Rl-Pyr反 應(yīng)，生成Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，最后進行皂化和脫除側(cè)鏈保護 基，得到五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH。
4. 如權(quán)利要求1所述布舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的五肽片段 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH由以下步驟合成首先合成Rl_Pyr的活化酯，再與羧基端保 護His(R2)反應(yīng)，生成Rl-Pyr-His (R2);合成Rl-Pyr-His (R2)的活化酯，與羧基端保 護Trp(R3)反應(yīng)，生成Rl-Pyr-His (R2)-Trp (R3);合成Rl-Pyr-His (R2)-Trp (R3)的 活化酯，與羧基端保護Ser (R4)反應(yīng)，生成Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4);合成 Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4)的活化酯，與羧基端保護Tyr (R5)反應(yīng)，生成Rl-Pyr-H is (R2) -Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，最后進行皂化和脫除側(cè)鏈保護基，得到五肽片段 Pyr_His_Trp_Ser_Tyr_OH。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的布舍瑞林的合成方法，其特征在于Rl為B0C、Z、Fmoc或H ; R2為BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H ;R3為B0C、For、H或Z ;R4為Bzl、 H、 Tbu、 Z、 Boc 或Tos ;R5為Bzl、H、Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-Cl-Z ;Rll為無機鹽或有機物;R12為 B0C、 Z或Fmoc ;R13為B0C、 Z或Fmoc ;R14為B0C、 Z或Fmoc。
6. 如權(quán)利要求1所述布舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的四肽片段 D-Ser (Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt由以下步驟合成首先合成R8-Pro-NHEt，脫保 護，再與a氮端保護、側(cè)鏈R7保護的R9-Arg(R7)-0H反應(yīng)，生成a氮端保護的 R9-Arg(R7)-Pro-NHEt ;脫保護，與a氮端保護的R10-Leu-0H反應(yīng)，生成a氮端保護的 R10-Leu-Arg (R7) -Pro-NHEt ;脫保護，與R6-D-Ser (Tbu) -0H反應(yīng)，生成R6-D-Ser (Tbu) -Leu -Arg (R7) -Pro-NHEt ;最后脫保護得到四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt 。
7. 如權(quán)利要求1所述布舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的四肽片段 D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt由以下步驟合成首先合成R6_D_Ser (Tbu)的活化酯， 然后與羧基端保護R6-Leu反應(yīng)，生成R6-D-Ser (Tbu) -Leu ;合成R6-D-Ser (Tbu) -Leu 的活化酯，與羧基端保護Arg(R7)反應(yīng)，生成R6-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg(R7);合成 R6-D-Ser (Tbu) -Leu-Arg (R7)的活化酯，與Pro-NHEt反應(yīng)，生成R6-D-Ser (Tbu) -Leu-Arg (R 7) -Pro-NHEt ;最后脫保護得到四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-NHEt 。
8. 如權(quán)利要求6或7所述布舍瑞林的合成方法，其特征在于R6為B0C、 Z或Fmoc ;R7 為B0C、 (B0C) 2、 PBF、 T0S、 N02、 H、 PMC、 HCL、 AD0C或Mts ;R8為B0C、 Z或Fmoc ;R9為B0C、 Z 或Fmoc ;RIO為B0C、 Z或Fmoc。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物合成領(lǐng)域，具體涉及一種純液相片段法合成布舍瑞林的新方法。一種布舍瑞林的合成方法，所述的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH與四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在縮合劑的存在下縮合而成。本發(fā)明采用5+4的片段合成法，可直接將五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在縮合劑的存在下縮合成布舍瑞林。本方法不但縮短了合成周期、避免了傳統(tǒng)方法中苛刻的反應(yīng)條件，而且收率高、產(chǎn)品純度好、成本低、反應(yīng)條件溫和、適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07K7/06GK101735308SQ201010039548
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者徐峰, 朱夏明, 楊東暉, 穆斌, 路楊 申請人:杭州諾泰制藥技術(shù)有限公司