專利名稱：一種抗腫瘤人源單鏈抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人源抗體。具體地說是一種具有抗腫瘤活性的特異性識別CDK4 蛋白的人源單鏈抗體的基因獲得及活性表征。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類生命健康的主要殺手，目前尚缺乏有效治療手段。腫瘤細(xì)胞惡性增殖的主要原因之一是細(xì)胞周期失控。Evan GI等2001年在 Nature,2001,411 :342-348中提出細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的核心是周期蛋白依賴性蛋白激酶 (cyclin-dependent kinases, CDKs)時相性激活。CDKs 是一類 kr/Thr 蛋白激酶，其活性 依賴于與周期蛋白(Cyclin)的結(jié)合。CDKs的異?；罨瘜?dǎo)致細(xì)胞周期失控，從而誘發(fā)腫 瘤的形成。Malumbers M 等 2005 年在 Trends in Biochemical Sciences, 2005, 30 (11) 630-641中總結(jié)提出，目前已發(fā)現(xiàn)11種同源的CDK分子，即CDKl 11。其中Matsushime等 1992年在Cell, 1992，71 (2) :323-334中最早分離得到CDK4基因，CDK4基因定位于染色體 12ql3 14，mRNA序列全長為2. 14kb，其cDNA開放讀碼框架為912bp，編碼303個氨基酸 的蛋白質(zhì)，分子量約為34kD，與⑶K2非常接近。⑶K4主要存在三個功能區(qū)在9 觀個殘 基之間，是ATP的結(jié)合部位和該酶的活性部位；在42 51個殘基之間，是調(diào)節(jié)亞基的結(jié)合 部位；在177 208個殘基之間，是pl3的結(jié)合部位。因為⑶K4分子中缺乏典型的PSTA^ 序列，故CyclinA、Cyclin B和Cyclin E均不能激活CDK4，只有Cyclin D家族成員對CDK4 具有活化功能。Sherr CJ and Roberts M 2004 年在Genes Dev,2004,18 :2699-2711 中指出 CDK4 作為細(xì)胞進(jìn)入增殖周期第一個被激活的周期蛋白依賴性蛋白激酶，通過與CyclinDl結(jié)合 形成有活性的CyclinDl/CDK4激酶復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞GO — S期的轉(zhuǎn)換，是細(xì)胞周期進(jìn)程中 G1/S 期轉(zhuǎn)換的限速因子。Deshpande A 等 2005 年在 Oncogene，2005，24 :2909-2915 中提 出在許多腫瘤細(xì)胞中存在CDK4過度表達(dá)和過度活化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。 Bonin S 等 2006 年在 Virchows Archiv, 2006,448 (5) :539-544 中發(fā)現(xiàn) CDK4 與腫瘤的預(yù)后 密切相關(guān)。美國Reddy等人2005年在Cancer Res, 2005,65 (22) :10174-10178的研究結(jié)果 顯示⑶K4的表達(dá)是導(dǎo)致一些乳腺癌發(fā)生的必要因子，并提出抑制⑶K4活性的治療可能是 治療乳腺癌高度特異性的途徑。哈佛醫(yī)學(xué)院的Yu等2006年在Cancer Cell, 2006,9 (1) 23-32中對CDK4基因敲除鼠模型的最新研究結(jié)果表明，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展需要CDK4激酶 的持續(xù)活化，因此，Malumbres M 和 Barbacid M 2006 年在 Cancer Cell, 2006,9 (1) :2_4 中 也提出抑制CDK4激酶活性將有利于乳腺癌治療。這些結(jié)果都為CDK4作為腫瘤治療的一個 有效靶點提供了實驗依據(jù)。Dai Y禾口 Grant S 2004 年在 Curr Oncol Rep, 2004,6 (2) 123 中提出抑制 CDK4 催 化活性的小分子化合物能夠阻滯腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制CDKs活性的研究將為 腫瘤治療藥物的設(shè)計提供新思路。桑建利等1999年在科學(xué)通報，1999,44(2) :184中利用反 義RNA抑制乳腺癌細(xì)胞中CDK4基因的表達(dá)，致使細(xì)胞的增殖速率和致瘤性明顯降低，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Grillo M 等 2006 年在 Breast Cancer Res Treat, 2006,95 (2) :185-194 中 證實通過應(yīng)用針對⑶K4的siRNA作用于腫瘤細(xì)胞時，腫瘤細(xì)胞的生長均得到了控制。這些 研究成果表明，抑制CDK4活性均能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，CDK4是腫瘤治療的一個有效靶點。但上述抑制CDK4活性的抗腫瘤治療研究中存在如下問題和缺點首先，小分子抑 制劑的特異性和腫瘤細(xì)胞靶向性問題很難解決，這樣就會產(chǎn)生明顯的毒副作用；其次反義 技術(shù)及RNA干擾技術(shù)存在相對不穩(wěn)定、作用范圍較窄等問題。因而不能實現(xiàn)CDK4的靶向、 高效滅活。單鏈抗體是用基因工程方法制備的小分子抗體，是由彈性連接肽(一般為12-15 個氨基酸)將抗體的重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(VL)連接而成的重組抗體，其分子量 只相當(dāng)于原天然抗體的六分之一，但單鏈抗體含有全部的抗原結(jié)合位點，所以單鏈抗體最 大程度的保留了抗體的抗原結(jié)合活性，是具有親本抗體抗原結(jié)合活性的最小片段。單鏈抗 體出現(xiàn)以后，人們在研究單鏈抗體的過程中，發(fā)現(xiàn)單鏈抗體具有一些無可比擬的優(yōu)越性，所 以人們就利用現(xiàn)有技術(shù)對單鏈抗體進(jìn)行了改造和修飾，以完善單鏈抗體的功能和發(fā)展新的 用途，其中胞內(nèi)抗體(intracellular antibody or intrabody)技術(shù)是近年來，隨著人們對 抗體工程和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的深入研究，派生出一項全新的可阻斷細(xì)胞內(nèi)重要靶蛋白的抗 體技術(shù)。胞內(nèi)抗體技術(shù)可以通過添加細(xì)胞核定位信號或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號等方法對抗體分子 進(jìn)行適當(dāng)修飾，使之定向分布于細(xì)胞核、細(xì)胞漿或某些細(xì)胞器中，從而特異性干擾或阻斷分 布于該部位的某些生物大分子的活性或加工、分泌過程，引起細(xì)胞的一系列生物過程發(fā)生 改變，從而達(dá)到結(jié)合和失活任一胞質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，實現(xiàn)重要靶分子的表型敲除。它是繼反義 RNA、特異性核酶、顯性負(fù)突變、自殺基因等技術(shù)之后又一新型基因治療途徑。并且與新發(fā)展 起來的RNAi技術(shù)相比，胞內(nèi)抗體能夠高特異性、高穩(wěn)定性地作用于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，在抗 腫瘤基因治療中具有巨大潛力和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述抑制⑶K4活性的小分子抑制劑存在的缺乏特異性和腫瘤細(xì)胞靶向性造 成的毒副作用及反義技術(shù)及RNA干擾技術(shù)存在的相對不穩(wěn)定、作用范圍較窄等問題，本發(fā) 明的目的是提供一種低毒、高效、特異、穩(wěn)定的抑制CDK4的活性分子，即抗CDK4人源單鏈抗 體，并實現(xiàn)其在細(xì)胞內(nèi)有效敲除CDK4的表型功能，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。為 了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種抗腫瘤人源單鏈抗體是特異性抗人CDK4人源單鏈抗體，其核苷酸序列如 Sequence NO. 1 所述。本發(fā)明的一種抗腫瘤人源單鏈抗體還包含核定位信號肽NLS、E_tag標(biāo)簽肽基因 編碼序列，其核苷酸序列如kquence NO. 2所述。 一種抗腫瘤人源單鏈抗體，在制備具有抗腫瘤作用的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的抗腫瘤人源單鏈抗體的應(yīng)用，所述的腫瘤為人乳腺癌和人宮頸癌。以重組人⑶K4蛋白為抗原，通過“吸附-洗脫-擴(kuò)增”淘選過程從人源噬菌體抗 體庫中篩選獲得特異性抗人⑶K4蛋白的單鏈抗體基因ANK4，進(jìn)一步通過原核表達(dá)、ELISA、 Western blot和免疫沉淀等技術(shù)，對ANK4蛋白進(jìn)行活性表征，即獲得特異性的抗人CDK4人 源性單鏈抗體。由于細(xì)胞核是CDK4的主要活化功能區(qū)，為了實現(xiàn)ANK4特異性干擾或阻斷分布于細(xì)胞核的CDK4的活性，實現(xiàn)CDK4的表型敲除，從而發(fā)揮ANK4的抗腫瘤作用，進(jìn)一步 以ANK4為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆入細(xì)胞核定位信號，E-tag檢測信號，添加 相應(yīng)酶切位點，即獲得抗CDK4人源胞內(nèi)單鏈抗體基因NANK4，進(jìn)而將其亞克隆到真核表達(dá) 載體pcDNA3. 1中，從而構(gòu)建了重組細(xì)胞核定位型抗CDK4人源胞內(nèi)單鏈抗體基因的真核表 達(dá)載體pNANK4。將構(gòu)建的真核表達(dá)載體PNANK4轉(zhuǎn)染人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和人類宮頸 癌HeLa細(xì)胞株后，對重組細(xì)胞核定位型抗⑶K4人源胞內(nèi)抗體基因的表達(dá)情況、定位情況以 及體外生物活性進(jìn)行了系列研究，結(jié)果表明，抗CDK4人源單鏈抗體ANK4添加細(xì)胞核定位信 號后獲得的細(xì)胞核定位型抗CDK4人源胞內(nèi)單鏈抗體基因(NANK4)能夠在腫瘤細(xì)胞中有效 表達(dá)并實現(xiàn)ANK4的目標(biāo)定位。該基因的穩(wěn)定表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞生長和增殖，引起細(xì)胞 周期阻滯，并明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明中所獲得的人源抗CDK4單鏈抗體ANK4是一種低毒、 高效、特異的抑制CDK4的活性的分子，由于該抗體為人源性抗體，避免了異源抗體用于人 體的毒副作用，該抗體是小分子的單鏈抗體，具有分子量小、免疫原性低等優(yōu)點，克服了以 往單克隆抗體分子量大、免疫原性高的缺點，另外可以通過引入細(xì)胞核定位信號，進(jìn)一步重 組到真核表達(dá)載體中，使該單鏈抗體在細(xì)胞內(nèi)特定部位高效、穩(wěn)定結(jié)合、滅活CDK4功能，為 腫瘤治療開辟新途徑。另外，還可以通過使用腫瘤特異性真核表達(dá)載體，進(jìn)行該抗體的腫瘤 靶向治療，實現(xiàn)該治療基因的可控性，這樣不僅能充分發(fā)揮抗體的抑瘤作用，而且具有腫瘤 特異性，確保治療的安全有效。


圖1.噬菌體抗體與⑶K4抗原結(jié)合能力測定。圖2. ELISA法檢測可溶性單鏈抗體與⑶K4蛋白的結(jié)合活性。圖3. SDS-PAGE分析ANK4的可溶性表達(dá)及純化。1.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為 ANK4/HB2151載體對照菌；3和4分別為ANK4/HB215IIPTG誘導(dǎo)前、后菌體沉淀；5. ANK4/ HB215IIPTG誘導(dǎo)上清；6.樣本5經(jīng)鎳柱流出液；7. 40mM咪唑洗滌流出液；8. 500mM咪唑洗 脫液。圖 4. Western blot 鑒定 ANK4。1. ANK4/HB2151 未經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)上清；2. ANK4/ HB2151IPTG誘導(dǎo)上清；3.純化的ANK4蛋白。圖5. Westernblot檢測純化的ANK4與重組人CDK4結(jié)合活性。1. pET28a-CDK4/ BL21IPTG誘導(dǎo)前菌體沉淀；2.純化的重組人CDK4蛋白。V5Ab 抗V5抗體。圖6· ANK4的親和力測定。圖7.抗⑶K4多克隆抗體對ANK4的競爭性抑制。A.只加入抗⑶K4多克隆抗體； B.同時加入抗CDK4多克隆抗體和ANK4 ;C.只加入ANK4。*p < 0. 01 vs A or C。圖8. Western blot檢測純化的ANK4與MCF-7細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的⑶K4結(jié)合活性。 A.陰性對照組，NC膜不與ANK4蛋白孵育，直接與抗V5抗體作用。B.實驗組，NC膜首先與 ANK4蛋白孵育，然后與抗V5抗體反應(yīng)。以β-actin作為細(xì)胞裂解液Wfestern blot蛋白加 樣的內(nèi)參對照。V5Ab 抗V5抗體。圖9.免疫共沉淀分析ANK4與細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的⑶K4結(jié)合活性。V5Ab 抗V5抗 體；CDK4Ab 抗 CDK4 抗體。
圖10. NANK4的PCR擴(kuò)增及重組表達(dá)載體pNANK4構(gòu)建。其中A. PCR擴(kuò)增結(jié)果。 1. DL-2000Marker ；2. PCR產(chǎn)物；3.純化的PCR產(chǎn)物；B.重組表達(dá)載體pNANK4的鑒定。1. Ikb DNA ladder marker ；2.pcDNA3. 1 ；3.ρ ΝΑΝΚ4 ；4.pcDNA3. 1/Hind III+EcoRI ；5. pNANK4/ Hind III+EcoR I ；6. NANK4/Hind III+EcoR I ；7. DL_2000Marker。圖11. RT-PCR分析NANK4在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。圖12.免疫熒光檢測NANK4在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)及定位。A.MCF-7細(xì)胞； B. HeLa細(xì)胞。Hoechst 33342與細(xì)胞核區(qū)域結(jié)合，發(fā)出藍(lán)色熒光?？功?Tag抗體和FITC標(biāo) 記的二抗檢測細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的NANK4，發(fā)出綠色熒光，Merge是將同一區(qū)域的藍(lán)色熒光和綠色 熒光疊加。圖 13. Western-blot 分析 NANK4 在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。1. MCF-7 ；2. MCF-7/ pcDNA3. 1 ；3.MCF-7/pNANK4 ；4. HeLa ；5. HeLa/pcDNA3. 1 ；6.HeLa/pNANK4。圖14.免疫共沉淀實驗檢測NANK4與⑶K4在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合。1. MCF-7 ；2. MCF-7/ pcDNA3. 1 ；3.MCF-7/pNANK4 ；4. HeLa ；5.HeLa/pcDNA3. 1 ；6. HeLa/pNANK4。圖15A. MTT法測定NANK4對MCF-7細(xì)胞的體外增殖活性影響。圖15B. MTT法測定NANK4對HeLa細(xì)胞的體外增殖活性影響。圖16.流式細(xì)胞儀檢測NANK4對細(xì)胞周期影響。1. MCF-7 ；2. MCF-7/ pcDNA3. 1 ；3. MCF-7/pNANK4 ；4. HeLa ；5. HeLa/pcDNA3. 1 ；6.HeLa/pNANK4。*p < 0. 01 vs MCF-7orMCF-7/pcDNA3. Iat the same phase, η = 3 ；**ρ < 0. 01 vs HeLa or HeLa/ pcDNA3. 1 atthe same phase,η = 3。圖17. Armexin-V檢測NANK4對細(xì)胞凋亡的影響。其中A為各組代表性圖片；B為統(tǒng) 計學(xué)分析結(jié)果。1. MCF-7 ；2. MCF-7/pcDNA3. 1 ；3. MCF_7/pNANK4 ；4. HeLa ；5. HeLa/pcDNA3. 1 ； 6. HeLa/pNANK4。*ρ < 0. 01 vs MCF-7 or MCF_7/pcDNA3. 1，η = 3 ;**p < 0. 01 vs HeLa or HeLa/pcDNA3. 1，η = 3。
具體實施例方式實施例1特異性抗人CDK4人源單鏈抗體的制備，為了便于閱讀，本專利“特異性抗 人CDK4人源單鏈抗體”以下簡稱“ANK4”一、實驗材料1.質(zhì)粒和菌株大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 α、HB2151和XLl-Blue購自北京鼎國生物技 術(shù)有限責(zé)任公司。PUC119質(zhì)粒購自大連寶生物工程有限公司。輔助噬菌體VCSM13購自 Stratagene 公司。2.分子克隆主要相關(guān)試劑細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(tryptone)，酵母提取物(yeast extract)，購自O(shè)xid公 司。原核表達(dá)并用Ni-NTA Agarose純化的重組人⑶K4蛋白參照曹玉華等2008年在吉林 大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)，2008，46 (5) =992-996中的方法制備；HRP/Anti_M13單克隆抗體購自 Pharmacia公司，抗V5單克隆抗體為Invitrogen公司產(chǎn)品；anti_CDK4antibody購自Santa Cruz Biotechnology公司。鐵蛋白(Fer)和卵清蛋白(OA)、0PD、考馬斯亮藍(lán)R-250、G_250、 PMSF、Tris、BSA、抗生素(Amp、Tet)購自 Sigma 公司。His TrapHP Kit、PD-10 脫鹽柱購自Amersham Bioscience。脫脂奶粉購自Bio-Rad公司。硝酸纖維素(NC)膜購自Amersham Bioscience。ECL發(fā)光試劑盒購自iTransgen生物技術(shù)公司。蛋白Marker、HRP標(biāo)記羊抗小 鼠IgG、Eppendorf管、移液器槍尖等塑料耗材購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。其他 試劑均為分析純的國產(chǎn)生化試劑。質(zhì)粒提取、純化試劑盒，購自Promega公司。3.相關(guān)溶液的配制參照《分子克隆實驗指南》。二、實驗方法 1.抗⑶K4人源單鏈抗體基因ANK4的篩選噬菌體人源單鏈抗體庫的獲得具體參照文獻(xiàn)Sblattero D等Nat Biotechnol, 2000，18 74-80 及 Sblattero D 等 1998 年在 Immunotechnology, 1998，3 :271-278 的方法 進(jìn)行，通過滴度測定表明，最終獲得庫容為IXlO11的噬菌體人源單鏈抗體庫?？贵w庫的篩選采用固相化抗原免疫吸附篩選法，將人CDK4蛋白用0. 05mol/L碳酸 鹽緩沖液稀釋至ΙΟΟμ g/ml，以Iml包被免疫管(NUNC公司)，參照李春英等在中國皮膚性 病學(xué)雜志，2005，19 =388-390中所述方法對抗體庫進(jìn)行4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”篩選。每 一輪篩選均測定次級庫滴度，并計算噬菌體投入/產(chǎn)出比(回收率)，作為特異性噬菌體抗 體富集的指標(biāo)。從第4輪篩選的菌落培養(yǎng)盤中隨機(jī)挑取100個克隆，接種在2 X YT中培養(yǎng)，用輔助 病毒VCSM13超感染誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜后，收集上清為噬菌體抗體。以10 μ g/ml的人⑶K4為 抗原包被ELISA板，經(jīng)1 % BSA封閉后加入待測噬菌體抗體上清，以HRP/Anti-M13單克隆 抗體為二抗，孵育、洗滌后OPD底物顯色；顯色陽性的克隆再以人鐵蛋白(Fer)和卵清蛋白 (OA)與目的抗原⑶K4同時包被ELISA板，鑒定其抗原抗體反應(yīng)的特異性，所用二抗為HRP/ Anti-M13單克隆抗體，加入OPD顯色后，讀取A49tl值。將A49tl值陽性的特異性結(jié)合目的抗原的噬菌體抗體上清感染對數(shù)生長期的 冊2151菌株，371孵育301^11后涂布2\￥11平板(5(^8/1111 Amp)。次日挑取單個菌落于 2XYT培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜后以1 100稀釋轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)到對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度 為lmmol/L，30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜，離心收集上清即為可溶性單鏈抗體。以2 μ g/ml人⑶K4包 被ELISA板，封閉后加入待檢測表達(dá)上清，37°C孵育lh，洗滌后加入適當(dāng)稀釋的Anti-V5單 克隆抗體，37°C孵育1小時，洗滌后加入適當(dāng)稀釋的HRP-羊抗小鼠IgGj^AOPD顯色后， 讀取A49tl值。選擇結(jié)合活性最高的克隆的噬菌抗體上清感染對數(shù)生長期的XLl-Blue菌株， 37°C孵育30min后涂布2 X YT平板(20 μ g/ml Amp, 10 μ g/ml Tet)。次日挑取單個菌落于 2 X YT培養(yǎng)液(20 μ g/ml Amp, 10 μ g/ml Tet)中培養(yǎng)過夜后，保存菌種并按Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System試劑盒操作說明提取質(zhì)粒，由上海生工生物工程 有限公司進(jìn)行測序。2.抗⑶K4單鏈抗體ANK4的可溶性表達(dá)與純化將ANK4克隆接種于400ml含Amp+抗性的2 X YT培養(yǎng)基中，ImM的IPTG誘導(dǎo)過夜 后離心收集上清。上清中加入40% -60%的硫酸銨進(jìn)行低溫沉淀，12000rpm離心20min收 集沉淀的蛋白，沉淀的蛋白經(jīng)PH7. 4的0. OlM PBS溶解，透析、除鹽；由于表達(dá)的抗⑶K4單 鏈抗體的C末端含有His-Tag，所以沉淀的蛋白經(jīng)除鹽后可以用His Trap HPKit進(jìn)行純化。 純化時，His Trap HP Kit柱先用含10mmol/L咪唑的Binding Buffer平衡，將經(jīng)過過濾的 蛋白溶液上柱，然后依次用Binding Buffer和含有咪唑的洗滌Buffer分別上柱清滌雜蛋白，以500mmol/L咪唑作為洗脫液，收集各個流出組份并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定最佳洗滌 濃度。純化的蛋白用Bradford比色法測定蛋白含量。3. Western blot 分析鑒定 ANK4 抗體將純化的蛋白經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳后；半干式轉(zhuǎn)移槽IOOmA轉(zhuǎn)移池，將蛋白轉(zhuǎn) 移到硝酸纖維素(NC)膜上；取出NC膜，PBST洗滌之后放入5%脫脂奶粉-PBST中室溫封 閉Ih ；將NC膜取出放入抗V5單克隆抗體(1 5000稀釋于5%脫脂奶粉-PBST中)中室 溫孵育；取出，PBST振蕩洗滌3次，每次IOmin ；再將NC膜放入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 中(1 5000稀釋于5%脫脂奶粉-PBST中)室溫孵育Ih ；PBST中洗滌3次，每次IOmin ； ECL發(fā)光試劑盒檢測目的條帶的出現(xiàn)。三、結(jié)果與分析1.抗⑶K4人源噬菌體抗體的篩選經(jīng)過4輪篩選，噬菌體抗體回收率得到約70倍富集，從最后1輪挑取的100個克隆 制備噬菌體抗體，用ELISA方法進(jìn)行初篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有15個可與人CDK4抗原結(jié)合的克隆， 再用鐵蛋白O^er)和卵清蛋白(OA)作為對照抗原進(jìn)行噬菌體ELISA鑒定，僅9個克隆的噬 菌體抗體能與人CDK4特異性結(jié)合，與無關(guān)抗原不具備結(jié)合特性(附圖1)。2.可溶性單鏈抗體的表達(dá)及結(jié)合活性為了檢測獲得的噬菌體抗體與人CDK4的結(jié)合活性，將9個陽性克隆的噬菌體抗體 上清感染無琥珀抑制的菌株HB2151，IPTG誘導(dǎo)可溶性單鏈抗體表達(dá)，以人⑶K4包被ELISA 板，以可溶性表達(dá)上清、Anti-V5單克隆抗體和HRP-羊抗小鼠IgG為抗體，進(jìn)行ELISA檢測， 結(jié)果顯示只有4個克隆具有特異性結(jié)合活性(附圖2)。經(jīng)測序和后續(xù)分析結(jié)果顯示，結(jié)合 活性最高的7號克隆的基因全長744bp (序列見kquence No. 1)，編碼248個氨基酸。該抗 體的輕鏈為λ鏈，能夠與CDK4特異性結(jié)合，因此我們將其確定為抗CDK4人源單鏈抗體，命 名為ΑΝΚ4，并進(jìn)行了 一系列研究。3.抗⑶Κ4人源單鏈抗體ΑΝΚ4的可溶性表達(dá)、純化及鑒定將ΑΝΚ4/ΗΒ2151的IPTG誘導(dǎo)上清進(jìn)行硫酸銨沉淀，沉淀經(jīng)過溶解和透析后進(jìn)行親 和純化。由于細(xì)菌蛋白可能含多聚組氨酸，且存在非特異性結(jié)合，為了得到純度較高的蛋 白，曾進(jìn)行過多次純化條件摸索。當(dāng)以含IOmM咪唑的結(jié)合緩沖液、含40mM咪唑的洗滌緩沖 液、含500mM咪唑的洗脫緩沖液純化效果較好。結(jié)果如附圖3所示，經(jīng)SDS-PAGE分析，500mM 咪唑洗脫下來的溶液在約30kD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶。經(jīng)過BandScan掃描分析，蛋 白純度約為96%。將純化的抗⑶K4單鏈抗體經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，以抗V5Tag單克隆抗 體為一抗對其進(jìn)行Astern blot分析。結(jié)果如附圖4所示，IPTG誘導(dǎo)的ANK4/HB2151上 清和純化后的抗CDK4單鏈抗體樣品泳道在30kDa處有特異性目的條帶出現(xiàn)，而在未經(jīng)誘導(dǎo) 的ANK4/HB2151上清中未檢測到目的條帶。這些結(jié)果表明已成功實現(xiàn)了抗⑶K4單鏈抗體 的可溶性表達(dá)和純化。純化得到的ANK4蛋白保存于_80°C，用于活性表征。實施例2抗⑶K4人源單鏈抗體ANK4的活性表征一、實驗材料pEI^8a-CDK4/BL21 (DE3)菌株參照曹玉華等2008年在吉林大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)， 2008,46(5) :992-996中的方法制備。人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株為吉林大學(xué)免疫教研室提供。 細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM、小牛血清購自Gibco公司。DTT、胰蛋白酶、Protein G on Sepharose 4Bfast flow購自Sigma公司，抗β -actin鼠單克隆抗體購自Sigma公司，兔抗⑶K4多克隆 抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京鼎國生物技術(shù) 有限責(zé)任公司。細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞刮購自Costar公司。其余試劑及材料參照實施 例1。 二、實驗方法 1. Western blot分析純化的抗⑶K4單鏈抗體ANK4與重組人⑶K4的結(jié)合活性重組人⑶K4蛋白經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳后；半干式轉(zhuǎn)移槽IOOmA轉(zhuǎn)移2h，將蛋 白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上；取出NC膜，PBST洗滌之后放入5%脫脂奶粉-PBST中室溫 封閉Ih ；將NC膜取出放入ANK4 (20 μ g/ml稀釋于5%脫脂奶粉-PBST中)中室溫孵育池； 再以抗V5抗體(1 5000稀釋于5%脫脂奶粉-PBST中)為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 為二抗，ECL發(fā)光試劑盒檢測目的條帶的出現(xiàn)。2.抗CDK4單鏈抗體ANK4親和力的測定首先用經(jīng)過2η梯度稀釋的⑶K4蛋白100 μ 1于4°C包被聚苯乙烯板過夜；次日 棄上清，用0. 05% BSA-PBST 200 μ 1封閉Ih ；再加入經(jīng)過2η梯度稀釋的抗⑶Κ4單鏈抗體 100 μ 1室溫孵育2h;棄上清，加入抗V5鼠單克隆抗體(以0.05% BSA-PBST按1 5000稀 釋)孵育2h ；棄上清，再加入50 μ 1 HRP-羊抗小鼠IgG (以0. 05% BSA-PBST按1 5000 稀釋)；以O(shè)PD為底物避光顯色，讀取0D490的值。然后按照公式(n[Abl]-[Ab])/(n-l)計 算抗CDK4單鏈抗體的親和常數(shù)，η為抗CDK4單鏈抗體的稀釋倍數(shù)，Ab和Abl分別表示當(dāng)抗 原濃度為Ag和Agl時，l/2Max0D490對應(yīng)的抗CDK4單鏈抗體濃度。3. ELISA法檢測抗⑶K4多克隆抗體與抗⑶K4單鏈抗體ANK4的競爭性結(jié)合以10 μ g/ml的重組人CDK4蛋白包被ELISA板并4 °C過夜；次日以0. 05 % BSA-PBST封閉2h ；然后每孔加入50 μ 1純化的抗⑶Κ4單鏈抗體ΑΝΚ4 (10 μ g/ml)，加入等 體積的兔抗⑶K4多克隆抗體作為競爭性抑制劑(以0. 05% BSA-PBST按1 2000稀釋) 共同孵育(所得A490的值即抑制后A值)，以不加競爭性抑制劑作為陽性對照(所得A490 的值即抑制前A值)，以不加抗CDK4單鏈抗體而只加兔抗CDK4多克隆抗體為陰性對照，孵 育2h后加入50μ1抗V5鼠單克隆抗體(以0. 5000稀釋)孵育2h， 再加入50 μ 1 HRP-羊抗小鼠IgG (以0. 05 % BSA-PBST按1 5000稀釋)，以O(shè)PD為底物 避光顯色，讀取A49tl的值。用以下公式計算抑制率抑制率=100% Χ(抑制前A值-抑制 后A值)/抑制前A值4.MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，37°C飽和濕度、5% C02 孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每3-5天胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。5. Western blot 實驗將收集的MCF-7細(xì)胞(每管約2 X IO6個)加入20 μ 1 SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻 后冰浴30min，沸水煮樣3-5min后進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳；半干式轉(zhuǎn)移槽IOOmA轉(zhuǎn)移2h， 將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上；取出NC膜，PBST洗滌之后放入5%脫脂奶粉-PBST中 室溫封閉Ih ；將NC膜取出放入抗⑶K4單鏈抗體ANK4 (20 μ g/ml稀釋于5%脫脂奶粉-PBST 中)中室溫孵育；再以抗V5抗體(1 5000稀釋于5%脫脂奶粉-PBST中)為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗，ECL發(fā)光試劑盒檢測目的條帶的出現(xiàn)。
6.免疫沉淀實驗將培養(yǎng)在6孔板中對數(shù)生長的MCF-7細(xì)胞用含ImM PMSF的冷PBS洗滌兩次，每孔 加入500 μ 1細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮子將其刮出，放于1.5ml Eppendorf管中，冰浴40min， 20%的能量超聲兩次，每次IOs ； 15000rpm 4°C離心IOmin ；取上清，加入純化的抗⑶K4單 鏈抗體ANK4 (20 μ g/ml)，于4°C緩慢顛倒?jié)幔辉偌尤? μ 1抗V5鼠單克隆抗體，于4°C緩慢 顛倒 2h;再加入 20μ1 Protein G onSepharose 4Bfast flow 4°C緩慢顛倒過夜,8000rpm 4°C離心3min，棄上清；加500 μ 1細(xì)胞裂解液洗滌一次；棄上清，500 μ 1冷PBS洗滌兩次，棄 上清；沉淀加入20 μ 1 SDS-PAGE上樣緩沖液，電泳，做Wfestern blot分析。Western blot 以抗CDK4兔多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，ECL發(fā)光試劑盒檢測目的條 帶的出現(xiàn)。三、結(jié)果與分析1.純化的抗⑶K4單鏈抗體ANK4具有與重組人⑶K4的結(jié)合活性為了進(jìn)一步檢測抗⑶K4單鏈抗體與重組人⑶K4蛋白結(jié)合活性，以未經(jīng)IPTG誘 導(dǎo)的pEI^Sa-⑶K4/BL21 (DE3)菌體沉淀為陰性對照，將其和純化的重組人⑶K4蛋白經(jīng) SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移到NC膜上，首先與抗⑶K4單鏈抗體結(jié)合，進(jìn)而與抗V5抗體和HRP標(biāo)記 的羊抗小鼠IgG反應(yīng)，ECL顯影觀察，純化的重組人⑶K4蛋白樣品在約34kD處出現(xiàn)一明顯 特異性條帶，而陰性對照組中未發(fā)現(xiàn)目的條帶(附圖幻，這一結(jié)果進(jìn)一步驗證了純化的抗 ⑶K4單鏈抗體可以特異性結(jié)合人重組⑶K4蛋白。2.抗CDK4單鏈抗體ANK4親和力的測定應(yīng)用非競爭性ELISA法，以抗體的濃度為橫坐標(biāo)，以抗原抗體反應(yīng)的0D490值 為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖6)，根據(jù)曲線及計算公式(n[Abl]-[Ab])/(n-l)來計算 抗CDK4單鏈抗體的親和常數(shù)，η為抗CDK4單鏈抗體的稀釋倍數(shù)，Ab和Abl分別表示當(dāng) 抗原濃度為Ag和Agl時，l/2Max0D490的抗體濃度。通過計算得到親和力的值分別為 (1. 79士0. 42) Xl(T8mol/L。3.抗CDK4多克隆抗體競爭性抑制抗CDK4單鏈抗體ANK4與抗原結(jié)合為了檢測抗CDK4多克隆抗體與抗CDK4單鏈抗體競爭性結(jié)合CDK4的能力，進(jìn)行了 競爭性ELISA實驗。純化的抗CDK4單鏈抗體中混入兔抗CDK4多克隆抗體作為競爭性抑制 劑(以0. BSA-PBST按1 2000稀釋)為實驗組即抑制后，以只加抗⑶K4單鏈抗體不 加兔抗CDK4多克隆抗體作為陽性對照即抑制前，檢測兔抗CDK4多克隆抗體與抗CDK4單 鏈抗體競爭結(jié)合重組人⑶K4的能力，結(jié)果如附圖7所示，根據(jù)公式(抑制率=(抑制前A 值-抑制后A值)/抑制前A值xlOO 可以計算出兔抗CDK4多克隆抗體對抗CDK4單鏈 抗體ANK4的競爭性抑制率為38. 67%。實驗組與陽性對照有顯著性差異(ρ < 0. 01)。從 競爭性抑制率可以看出，兔抗CDK4多克隆抗體能夠競爭性抑制抗CDK4單鏈抗體ΑΝΚ4結(jié)合 重組人CDK4。4.抗⑶Κ4單鏈抗體ΑΝΚ4能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)⑶Κ4蛋白結(jié)合 由于本實驗所用的抗CDK4單鏈抗體是以原核表達(dá)的重組人CDK4蛋白為抗原從人 源噬菌體抗體庫中篩選得到的，因此須對其是否具有結(jié)合天然狀態(tài)下的CDK4蛋白的能力 進(jìn)行檢測。為此，我們分別采用了 Western blot和免疫沉淀技術(shù)來檢測純化的抗CDK4單 鏈抗體與腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CDK4是否有相互作用。
4. 1 Western blot為了檢測抗CDK4單鏈抗體與細(xì)胞內(nèi)源的CDK4蛋白結(jié)合活性，將收集得到的MCF-7 細(xì)胞裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到NC膜上，首先與抗CDK4單鏈抗體孵育，進(jìn)而與抗V5 抗體和HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG反應(yīng)，ECL發(fā)光試劑盒顯影。結(jié)果附圖8所示，在約34kD處 出現(xiàn)一明顯特異性條帶(附圖8B)，而在陰性對照組(未與ANK4反應(yīng)，只加入抗V5抗體) 中未發(fā)現(xiàn)目的條帶(附圖8A)，以β-actin作為細(xì)胞裂解液ffesternblot蛋白加樣的內(nèi)參 對照，各組樣品中β-actin均檢測出清晰的β-actin條帶。4. 2免疫沉淀將收集得到的MCF-7細(xì)胞裂解后在上清中依次加入抗CDK4單鏈抗體，V5單克隆抗 體和Protein G onSepharose 4B fast flow孵育，孵育沉淀進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot 分析。Western blot檢測時以抗⑶K4兔多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二 抗，由于抗⑶K4單鏈抗體引入V5標(biāo)簽，其表達(dá)產(chǎn)物具有結(jié)合抗V5抗體的活性，抗V5抗體 屬于 IgG 型抗體，能與 Protein G onSepharose 4B fast flow 中的 ProteinG 結(jié)合，如果 抗⑶K4單鏈抗體能與⑶K4結(jié)合，則形成的復(fù)合物通過抗V5抗體間接的結(jié)合到ftOtein G 上形成免疫沉淀復(fù)合物，免疫沉淀復(fù)合物進(jìn)行Western blot分析，當(dāng)以抗CDK4兔多克隆抗 體為一抗進(jìn)行檢測時，如能夠檢測到相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，則可說明抗CDK4單鏈抗體確實能特 異性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)CDK4蛋白。實驗結(jié)果如附圖9所示，在34kD處出現(xiàn)了特異性條帶，而在不 加抗CDK4單鏈抗體的陰性對照組中無條帶出現(xiàn)，進(jìn)一步證明了抗CDK4單鏈抗體和CDK4結(jié) 合的特異性。實施例3抗⑶K4人源胞內(nèi)單鏈抗體基因的克隆及重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建。為 了便于閱讀，本專利“抗CDK4人源胞內(nèi)單鏈抗體基因”以下簡稱“NANK4”一、實驗材料1.菌株和質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒購自Invitrogen公司；大腸桿菌E. coli JM109購自北京鼎國 生物技術(shù)有限公司。2.分子克隆主要相關(guān)試劑限制性內(nèi)切酶Hind III、EcoR I，T4DNA連接酶及其相應(yīng)緩沖液，Taq DNA聚合酶 及其相應(yīng)緩沖液，dNTP購自大連寶生物工程有限公司。質(zhì)粒提取純化試劑盒購自Promega 公司。DNA回收試劑盒、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(11Λ Ladder和DL-2000DNAMarker)購自北京鼎國 生物技術(shù)有限公司。瓊脂糖凝膠電泳所需瓊脂糖、溴化乙錠、Tris等購自Sigma公司。其 余試劑及材料參照實施例1和2。2.引物設(shè)計本實驗所用的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體如下以 Pl (FP) (5’ -CCCAAGCTTATGGATCCGAAGAAGAAACGTAAGGTTCCGAAGAAGAAACGTAAGGTTCAGTCTGTGC TGACGCAGCC-3，)為正向引物，以 P2 (RP) (5，-GGAATTCTTAACGCGGTTCCAGCGGATCCGGATACGGCA CCGGCGCACCTGAAGAGACAGTGACCGGGGTTCC-3 ’)為反向引物引入核定位序列、檢測標(biāo)簽及相應(yīng) 酶切位點構(gòu)建胞內(nèi)抗體NANK4。二、實驗方法( 一 ) NANK4基因片段的獲得
1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為了通過定向克隆的方法制備抗人CDK4胞內(nèi)單鏈抗體基因NANK4，并能構(gòu)建入真 核表達(dá)載體PCDNA3. 1中，我們設(shè)計了 P1/P2兩條引物。引物設(shè)計根據(jù)抗CDK4人源單鏈抗 體基因序列及不同亞細(xì)胞區(qū)滯留型胞內(nèi)抗體基因序列，并依據(jù)PCR引物設(shè)計原則引入符合 閱讀框的起始密碼子和終止密碼子以及相應(yīng)的酶切位點。具體序列見材料部分。以從人源噬菌體單鏈抗體庫中篩選到的抗CDK4人源單鏈抗體基因ANK4序列為模 板，用PCR的方法擴(kuò)增細(xì)胞核定位的抗人CDK4胞內(nèi)單鏈抗體(NANK4)基因。PCR反應(yīng)體系10 X Ex10 μ 1
Taq buffer8μ 1
dNTPs(2. 5mM each)2 μ 1 (respectively)
Pland P2(20 μ Μ)0. 5μ 1
Template(lOOng/μ 1)0. 5μ 1
ExTaq(5U/μ 1)77 μ 1
dd H2O
Total100 μ 1
操作程序(1) 94 "C，4min ； (2) 94 "C，45sec ； (3) 55 "C，45sec ； (4) 72 "C，45sec ；(5)72°C,10min.其中(2)-(4)進(jìn)行 30 個循環(huán)。
2. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、按照DNA回收純化試劑盒回收并檢驗。
(1)電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上用手術(shù)刀切取含目的片段的瓊脂糖；( 放入預(yù)
先稱量好的Eppendorf管中，稱重，搗碎，按1 3 (重量/mg 體積/ μ 1)的比例加入溶液 A ； (3) 50°C金屬浴lOmin，至膠完全溶解，在室溫下，加入溶液B，充分混勻，溶液分別轉(zhuǎn)移至 離心柱內(nèi)靜置2min，8500rpm離心Imin棄液體(溶液若一次加不完，可以分兩次離心)；(4) 棄液體，加入500 μ 1溶液C，8500rpm離心Imin棄液體；重復(fù)一次；(5) 12000rpm離心Imin, 甩干剩余液體，除去殘余酒精；(6)將離心柱置于新的離心管中室溫敞蓋8min，使乙醇揮發(fā) 盡；⑵加預(yù)熱溶液D，15000rpm離心lOmin，管底即為目的DNA。取少量DNA進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳，檢驗回收片段的純度與濃度。3.目的片段的酶切與回收回收的PCR擴(kuò)增片段產(chǎn)物的HindIII和EcoR I雙酶切反應(yīng)體系ddH2012 μ 1IOXM buffer4μ 1HindIII2μ 1EcoRI2μ 1回收的PCR擴(kuò)增片段20μ1_40 μ 1 上述混合液于37°C金屬浴消化1. 5_2h，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收約 870bp的目的片段(方法同上)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗其回收效果，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> ( 二)pcDNA3. 1載體片段的獲得將質(zhì)粒pcDNA3. 1進(jìn)行Hind III和EcoR I雙酶切，37°C消化1. 5_濁，1 %瓊脂糖凝 膠，98mA電泳30-40min分離約5. 4kb的目的片段。載體質(zhì)粒pcDNA3. 1的酶切體系如下
0125]ddH2012 μ 1
0126]IOXM buffer4μ 1
0127]Hind III2μ 1
0128]EcoRI2μ 1
0129]pcDNA3. 120 μ 1
0130]_
0131]40 μ 1用DNA回收試劑盒回收載體片段pcDNA3. 1，方法同上。1 %瓊脂糖凝膠電泳，檢驗 回收片段。(三)載體與目的基因的連接將目的基因片段和pcDNA3.1酶切大片段通過 T4DNA連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒ρΝΑΝΚ4。構(gòu)建過程見圖1。連接體系如下
0134]dd H2O8. 5μ 10135]T41igase buffer2μ 10136]T41igase1 μ 10137]pcDNA3. 1 片段0. 5μ 10138]NANK4片段8μ 1_20 μ 1混勻，16°C金屬浴連接12_16h。(四)JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)以無菌接種環(huán)刮取凍存于_80°C冰箱的JM109菌種，劃線接種于不含氨芐青霉 素(Amp)的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)1 左右；( 挑取單一菌落接種到5ml液體LB培養(yǎng)基 中，37°C ISOrpm振搖培養(yǎng)至0D60。= 0. 4 ； (3)將細(xì)菌培養(yǎng)管取出，迅速置于冰浴中15min 以上，使培養(yǎng)物冷卻到0°C ； (4)在無菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌、冰預(yù)冷的1.5ml Eppendorf管中(以下操作均需無菌)，4°C、4000rpm離心lOmin，棄上清；(5)以500 μ 1冰 預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，冰浴30min ； (6) 4°C、4000rpm離心lOmin，收集 菌體，經(jīng)80 μ 1冰預(yù)冷的CaCl2重新懸浮菌體，將感受態(tài)細(xì)胞置于4°C冰箱冰浴中備用。(五)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(1)將每管80 μ 1感受態(tài)細(xì)胞加入到20 μ 1連接產(chǎn)物中，輕輕混勻，冰浴30min ； (2)將管放入42°C金屬浴中，熱休克anin;(3)快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻aiiin ； (4)每管加 Λ 900 μ 1 37°C預(yù)熱的 LB 液體培養(yǎng)基，37°C、150rpm 振蕩培養(yǎng) 45min ;(5)4000rpm、4°C離心 5min ； (6)棄700-800 μ 1上清，用余下上清重懸細(xì)胞，涂布于含100 μ g/ml氨卞青霉素抗性 (Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)基中，靜置IOmin ；37°C倒置培養(yǎng)12 16h，出現(xiàn)重組子菌落。轉(zhuǎn)化菌 盤4°C保存?zhèn)溆谩?六)表達(dá)質(zhì)粒pNANK4的鑒定
1.表達(dá)質(zhì)粒pNANK4的小量提取與純化(參照《分子克隆實驗指南》堿裂解法小量 提取質(zhì)粒)(1)挑取轉(zhuǎn)化細(xì)胞單個陽性克隆，接種于5ml含100 μ g/ml Amp+的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C、180-200rpm振蕩培養(yǎng)12 16h ;(2)菌液分裝于1. 5ml Eppendorf管中， 15000rpm、4°C離心5min收菌體沉淀；(3)加入0. ImL冰預(yù)冷的溶液I，吹懸沉淀，靜置5min ； ⑷加入現(xiàn)配的0. 2mL溶液II，顛倒混勻；(5)加入0. 15mL冰預(yù)冷溶液III，輕輕顛倒混勻； (6)冰浴15min，15000rpm 4°C離心5min ； (7)收集上清，加入2. 5倍體積的無水乙醇，室溫 靜置20min ； (8) 15000rpm 4°C離心15min ； (9)棄上清，加入2. 5倍體積預(yù)冷的70%乙醇洗 滌，15000rpm 4°C離心5min ； (10)棄上清，控干，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥；(11)沉淀溶于50 μ 1 TE中(含50 μ g/ml RNaseA)，37°C 30min, 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗，_20°C保存?zhèn)溆谩?.重組質(zhì)粒的酶切鑒定利用限制性內(nèi)切酶消化法初步檢驗提取的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒進(jìn)行Hind III 和EcoR I雙酶切，37°C消化1. 5-濁，瓊脂糖凝膠，98mA電泳30-40min，凝膠成像分析儀 上觀測。pNANK4質(zhì)粒的Hind III和EcoR I雙酶切反應(yīng)體系ddH206 μ 1IOXM buffer2μ 1Hind III1 μ 1EcoRI1 μ 1pNANK410 μ 1_20 μ 13.重組質(zhì)粒的序列測定由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。三、結(jié)果與分析為了獲得定位于細(xì)胞核的抗CDK4人源胞內(nèi)單鏈抗體基因，我們以抗CDK4人源單 鏈抗體ΑΝΚ4基因為模板，用含有細(xì)胞核定位信號、Hind III和EcoR I酶切位點序列以及 E-tag標(biāo)簽肽序列的引物，通過PCR的方法擴(kuò)增細(xì)胞核定位型抗CDK4人源胞內(nèi)單鏈抗體 NANK4基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，在約860bp處有一明顯的DNA條帶(見 附圖10A)；產(chǎn)物回收后克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1的CMV啟動子下游的限制性內(nèi)切酶 Hind III和EcoRI之間；陽性重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoRI雙酶切，瓊脂糖 凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，在^OObp和840bp處分別出現(xiàn)一條明顯的DNA條帶(見附圖10B)。進(jìn)一 步通過T7和BGH通用引物正反雙向測通載體pNANK4上的目的片段，測序結(jié)果表明，插入序 列與實驗設(shè)計一致，并且讀碼框完全正確，這說明通過PCR擴(kuò)增成功地引入了細(xì)胞核定位 信號、E-tag檢測標(biāo)簽等，NANK4基因全長834bp (序列見kquence No. 2),編碼278個氨基 酸。這說明我們已成功獲得了重組胞內(nèi)抗體NANK4基因的真核表達(dá)載體PNANK4。實施例4抗CDK4單鏈抗體抗腫瘤活性分析一、實驗材料1.分子生物學(xué)相關(guān)試劑及材料
去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT_PCI )試劑盒購自大連 寶生物工程有限公司；其余參照實施例1-3。2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染及活性檢測試劑及材料脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)、G418、Trizol 為 hvitrogen 公司產(chǎn)品；DMS0、MTT、 溴化丙啶(PI)、RNase A、Hoechst 33342購自Sigma公司；RIPA裂解液購自碧云天生物技 術(shù)有限公司；抗E-tag抗體購自Wiamarcia公司；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉 金橋生物技術(shù)公司；Armexin V凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；其余同 實施例1-3。3. RT-PCR所需引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。(1) RT-PCR擴(kuò)增胞內(nèi)抗體弓丨物序列正向引物P3為5’ -CCCAAGCTTATGGGATGGAGCTGT-3，， 反向引物P4為5’ -GGTAC0GCT0GAGGATAACT-3‘，擴(kuò)增產(chǎn)物為460bp ；⑵擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)β -actin合成 的引物序列正向引物 P5 為 5，-TGGMTCCTGTGGCATCCATGMAC-3，，反向引物 P6 為 5，-TAMA0GCAGCT CAGTMCAGTC0G-3，。4.相關(guān)溶液的配制參照《分子克隆實驗指南》。二實驗方法1.轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的準(zhǔn)備(參照去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書)1.1使用前準(zhǔn)備工作將試劑盒中附帶的RNaseA加入Solution I中，4°C保存；向DNA Washing Buffer 中加入60mL無水乙醇進(jìn)行稀釋，稀釋后的DNA Washing Buffer室溫保存。1. 2操作方案(所有步驟按照試劑盒說明書在室溫下進(jìn)行)(1)過夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到一個干凈的5mL離心管中，5000g室溫離心 10!^11，棄上清、收集菌體沉淀；(幻加入50(^1^ Solution I，將菌體沉淀懸起，并將其轉(zhuǎn) 移至1.5mL離心管中；(3)加入500 μ L Solutionll，上下顛倒四次，室溫靜置^iin ； (4) 加入250 μ L冰浴的Buffer N3,上下顛倒四次，直到出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000g, 4°C，離心 IOmin ； (5)小心地將上清轉(zhuǎn)移到一個1. 5mL離心管中，加入0. 1體積的ETR Solution，冰 浴lOmin，其間顛倒幾次；(6)將裂解液42°C孵育5min, 12000g離心3min，ETR Solution會 在底部形成一藍(lán)色條帶；(7)將上清轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管中，并加入0. 5體積的無水乙醇， 充分混勻，室溫靜置Hmin ；⑶將以上混合物700 μ L轉(zhuǎn)移到一個套在2mL收集管中柱II 中，室溫離心，10000g，lmin ；將流出液倒掉，按上述操作，將剩余溶液再轉(zhuǎn)移到柱中并離心； (9)用500 μ L HB Buffer洗柱，室溫離心，IOOOOg, Imin ； (10)倒掉流出液，用700 μ L含乙醇 的DNA Wash Buffer洗柱，室溫離心，10000g，lmin，倒掉流出液，重復(fù)此操作一次；(11)倒 掉流出液，將空柱離心13000g，;3min，以干燥柱的介質(zhì)，特別是將乙醇除去；(12)將柱置于 一個新的 1. 5mL 離心管中，加入 100 μ L 的 Endotoxin-Free Elution Buffer (70°C預(yù)熱)， 室溫靜置2min，13000g,離心;3min以洗脫DNA ； (13)棄回收柱，洗脫DNA保存于_20°C備用。1.3DNA的產(chǎn)量與質(zhì)量把抽提得到的DNA樣品稀釋100倍，分別測量其在260nm和280nm處的吸光度，得 到DNA濃度(μ g/mL)和A260與A280的比值。A260與A280的比值可顯示核酸的純度，本 實驗要求的比值應(yīng)該在1. 8-2. 0之間。2.細(xì)胞培養(yǎng)
MCF-7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37°C飽和濕度、 5% C02孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每2-4天胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立將生長狀態(tài)良好的24h前換液的MCF-7細(xì)胞按IX IO6Cells/孔的密度、HeLa細(xì)胞 按IXlO5ceIls/孔的密度分別接種至6孔板中，37°C、飽和濕度、5% C02孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)6 孔板內(nèi)細(xì)胞生長達(dá)到90-95%匯合時即可轉(zhuǎn)染。具體如下(1)配制溶液A 將4 μ g質(zhì)粒DNA與不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液輕輕混合至總體積 為 250 μ L ； (2)配制溶液 B 將 10 μ L LipofectAMINETM2000 與 240 μ L 不含抗生素的 DMEM 培養(yǎng)液混合，室溫孵育5min ； (3)將溶液B加入到溶液A中，充分混合，室溫孵育20min ； (4) 將6孔板中的細(xì)胞用無血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液洗兩遍，每孔加入2mL不含抗生素的 DMEM培養(yǎng)液；(5)加入上述混合物，37°C、飽和濕度，5% C02培養(yǎng)；(6)于轉(zhuǎn)染后7 將轉(zhuǎn)染 細(xì)胞消化，按照1 10傳代培養(yǎng)，同時加入600 μ g/mLG 418進(jìn)行抗性篩選，每3天換液一 次并保持G 418的濃度。約2周后，空對照組細(xì)胞全部死亡，出現(xiàn)陽性克隆，逐步降低G 418 濃度至200 μ g/mL維持篩選。擴(kuò)大培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，凍存，相關(guān)檢測備用。4. ANAK4的穩(wěn)定表達(dá)分析4. IRT-PCR 檢測4. 1.1 總 RNA 的提取將篩選到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞組、HeLa細(xì)胞組分別消化，冷PBS洗2次后，加 入0. 5ml Trizol提取液，室溫放置5min ；加入0. Iml氯仿劇烈震蕩15s，室溫靜置^iin ； 40C 12000g離心15min ；上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管內(nèi)，加入0. 25ml異丙醇，混勻，室溫放置 IOmin ；4°C 12000g 離心 IOmin ；沉淀用 Iml 75% 乙醇(DEPC 水配制)洗一次；4°C IOOOOg 離 心5min ；空氣中干燥，加入適量DEPC水溶解(55_60°C水浴IOmin助溶)，存于_80°C備用。4. 1. 2RT-PCR以提取的mRNA為起始物，按照RT-PCR試劑盒說明，分別加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的各 種成分進(jìn)行 RT 反應(yīng)，其條件為30°C 10min，45°C 30min，99°C 5min，5°C 5min ；94°C 2min。 從反應(yīng)混合液中各取5 μ 1放入新的PCR管中，依次加入IOOpmol的上下游引物Ρ3和Ρ4或 β -actin 的上下游引物 P5 和 P6，5 μ 1 PCR 緩沖液(IOX)，2. 5mmol/L 的 dNTP 和 U 的 DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase)，最終體積為50 μ 1 ；放置PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù) 為94°C 30S，50°C 30S，72°C lmin，30個循環(huán)；最后于72°C延伸lOmin。擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳檢驗。5.間接免疫熒光實驗將無菌處理的載玻片放到6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞按適當(dāng)密度分別接種至6孔板中， 37°C飽和濕度、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞可自然貼附于載玻片上。當(dāng)6孔板內(nèi)細(xì)胞生長達(dá) 到80%以上匯合時將細(xì)胞爬片從6孔培養(yǎng)板中取出，370C D-Hanks洗滌2次，5min/次；將 D-Hanks液吸出，4%多聚甲醛固定30min ；dd H2O洗滌3次，分別為lOmin, lOmin, 5min ；風(fēng) 機(jī)吹干，_20°C保存?zhèn)溆茫籣20°C取出片子室溫水化20min ；PBST洗滌lOmin，PBS洗滌3次， 每次5min ；0. 01%胰酶消化40s，PBS洗滌3次，每次5min ；3% H2O2室溫阻斷20min，PBS洗 滌3次，每次5min ；3% BSA-PBST封閉20min，PBST洗滌3次，每次IOmin ；加入PBST稀釋 (1 12 的抗E-tag鼠單克隆抗體，4°C過夜；PBST洗滌3次，每次IOmin ；加入PBST稀釋(1 100)的FITC-山羊抗小鼠IgG，避光室溫20min ；PBST洗滌3次，每次IOmin ；加入 2 μ g/mL的Hoechst 33342，室溫避光20min ；PBST充分洗滌；甘油封片，上機(jī)觀察。6. Western-blot 分析收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞，冷PBS洗2次；加入約500 μ L的RIPA強(qiáng)裂解液(含 ImM PMSF)，冰上裂解40min-lh ；超聲破碎，能量20%，10s，兩次；15000rpm離心3_5min，收 獲上清液；進(jìn)行SDS-PAGE，用半干式電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；轉(zhuǎn)膜后，將膜置 于PBST中緩搖15min ；用含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉Ih ；膜置于PBST中緩搖3次，每 次IOmin ；加入封閉液稀釋的一抗，室溫緩搖池；膜置于PBST中緩搖3次，每次IOmin ；加 入封閉液稀釋(1 5000)的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，室溫緩搖Ih;膜置于PBST中緩搖3 次，每次IOmin ；利用ECL試劑盒顯影。注抗E_tag鼠單克隆抗體稀釋比例(1 1000)，抗 β-actin鼠單克隆抗體稀釋比例(1 5000)。7.免疫共沉淀實驗將培養(yǎng)在6孔板中對數(shù)生長的細(xì)胞用含ImM PMSF的冷PBS洗滌兩次，每孔加入 500 μ 1弱的RIPA裂解液(含ImM PMSF)，用細(xì)胞刮子將其刮出，放于1. 5ml Eppendorf 管中，冰浴40min，20%的能量超聲兩次，每次IOs ； 15000rpm 4°C離心5min ；取上清，向 各樣品上清中加入4yL抗E-tag抗體，4°C，緩慢顛倒，Ih以上；加入20 μ L Protein Gon S印harose，4°C，緩慢顛倒，過夜；8000rpm，4°C，離心!3min，棄掉上清；用500 μ L弱的 RIPA裂解液洗滌沉淀一次，再用0.01Μ PBS洗滌兩次，每次IOmin ；向沉淀中加入20 μ L 1 X SDS-PAGE上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE，之后將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，參照上述實驗方法， 以抗⑶Κ4多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行Wfestern-blot實驗。8. MTT法檢測細(xì)胞增殖活性(1)接種細(xì)胞用0. 25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，MCF-7細(xì)胞按7X IO3ceIls/孔；HeLa細(xì)胞按5X IO3ceIls/孔的 密度接種至96孔培養(yǎng)板中，200 μ L/孔，每種設(shè)10個平行孔，同時以200 μ L/孔培養(yǎng)液作為 陰性對照。( 培養(yǎng)細(xì)胞將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在371、5%0)2及飽和濕度條件下，分 別在培養(yǎng)4h、24h、幼h、7 、邪h、120h后取出培養(yǎng)板，每孔加入5mg/mL MTT溶液20 μ L，放回 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。( 繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。加入DMSO(150 μ L/孔)溶解 ΜΤΤ，振蕩IOmin混勻，使結(jié)晶物充分溶解。(4)比色選擇492nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀 上調(diào)定各孔吸收值，記錄結(jié)果。以培養(yǎng)液孔光吸收值作為陰性對照，計算每種細(xì)胞在492nm 波長處的平均光吸收值，以時間為橫軸，492nm光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。9. FACS分析細(xì)胞周期收獲細(xì)胞并用冷PBS洗滌2次，然后用70%冷乙醇4°C固定過夜，檢測前用PBS洗 凈乙醇，重懸于200 μ L含50 μ g/mL的PI染液的PBS中，加入RNase A至終濃度50 μ g/mL, 避光孵育30min，上流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞周期的變化情況。10. Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測分析(1)收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，冷PBS洗滌細(xì)胞2次，收集5X IO5個細(xì)胞；(2)吸 取250μ L的2XBinding Buffer和250 μ L的滅菌去離子水混勻；(3)用上述500yL的 IXBinding Buffer 懸浮細(xì)胞；(4) WAlyL Annexin V-EGFP 混勻，加入 5 μ L ΡΙ，混勻； (5)避光反應(yīng)IOmin ； (6)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。
三、結(jié)果與分析1. pNANK4在腫瘤細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)為了檢測NANK4的表達(dá)情況以及其體外生物學(xué)活性，以脂質(zhì)體LipofectameTM 2000介導(dǎo)重組質(zhì)粒PNANK4及空對照質(zhì)粒pcDNA3. 1轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞和人子 宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞，經(jīng)G 418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞克隆，為了鑒定這些 克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行如下實驗。1. IRT-PCR 檢測 NANK4 的表達(dá)為了檢測NANK4在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)，我們分別提取了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA， 以P3和P4為引物進(jìn)行了 RT-PCR分析，并且在實驗中以β-actin基因作為內(nèi)參照。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，在以特異性擴(kuò)增β-actin的相應(yīng)引物(P5，P6)進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增時，所有樣品均能擴(kuò)增出350bp的β-actin片段，而且每組內(nèi)各樣品擴(kuò)增出的 條帶亮度基本一致(附圖11)，而在以特異性擴(kuò)增NANK4的相應(yīng)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增時，只 有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PNANK4的細(xì)胞，才能擴(kuò)增出約460bp的產(chǎn)物，而以空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或空細(xì)胞 的RNA為模板時均無該條帶的出現(xiàn)(附圖11)，這一結(jié)果在mRNA水平上證明了我們選擇的 細(xì)胞克隆為穩(wěn)定表達(dá)NANK4的細(xì)胞株，表明已初步獲得穩(wěn)定表達(dá)NANK4的細(xì)胞克隆MCF-7/ PNANK4細(xì)胞株和HeLa/pNANK4細(xì)胞株。1. 2間接免疫熒光實驗分析以RT-PCR結(jié)果呈陽性的細(xì)胞為材料，經(jīng)細(xì)胞爬片等一系列處理，以抗E-tag 的鼠單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC-山羊抗小鼠IgG為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光實驗分析。 H0eChst33342與細(xì)胞核區(qū)域結(jié)合，發(fā)出藍(lán)色熒光。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PNANK4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 的MCF-7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)域均發(fā)出明亮的黃綠色熒光，而pcDNA3. 1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 的MCF-7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞以及空對照的MCF-7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)域沒有熒光 (附圖12)，這表明NANK4基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞中得到有效表達(dá)，并且其表達(dá)產(chǎn)物定 位在細(xì)胞核，進(jìn)一步驗證了我們所獲得的陽性細(xì)胞株。1. 3Western_blot 分析為了進(jìn)一步檢測NANK4在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中的表達(dá)，我們分別裂解穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 PNANK4以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1的MCF-7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，并以空細(xì)胞作對照，用抗E_tag 鼠單克隆抗體進(jìn)行Western-blot檢測，同時以各樣品內(nèi)β -actin的表達(dá)水平為內(nèi)參照。結(jié) 果如附圖13所示，各樣品內(nèi)β-actin基因均有表達(dá)，且表達(dá)量均一。而在所篩選到的穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染pNANK4的MCF-7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的細(xì)胞裂解液中檢測到NANK4基因的表達(dá)，即在大 約31kD的位置上檢測到一目的條帶。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1以及空細(xì)胞的細(xì)胞裂解液中并 沒有檢測到相關(guān)目的條帶的產(chǎn)生。此結(jié)果證明了在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PNANK4的MCF-7細(xì)胞和HeLa 細(xì)胞中得到了穩(wěn)定的表達(dá)，同時也進(jìn)一步驗證了我們所獲得的陽性細(xì)胞株。2.胞內(nèi)抗體NANK4能夠與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的⑶K4蛋白結(jié)合為了檢測MCF-7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)抗體NANK4的表達(dá)及其能否在細(xì)胞內(nèi) 與CDK4結(jié)合，我們進(jìn)行了免疫共沉淀實驗。我們以穩(wěn)定表達(dá)NANK4的MCF-7細(xì)胞和HeLa 細(xì)胞為材料，以轉(zhuǎn)染了 pcDNA3. 1空載體的細(xì)胞及空細(xì)胞做對照，將細(xì)胞進(jìn)行裂解后，加入 抗E-tag的鼠單克隆抗體，進(jìn)行孵育，之后加入ftOtein G-Sepharose進(jìn)行結(jié)合，然后以抗 ⑶K4多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行ffestern-blot實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在約34kD的位置處可以出現(xiàn)一明顯的條帶，即為⑶K4與NANK4結(jié)合的⑶K4蛋白。結(jié)果如 附圖14所示，這說明胞內(nèi)抗體NANK4在MCF-7細(xì)胞及HeLa細(xì)胞內(nèi)得到了表達(dá)，并且與抗原 CDK4結(jié)合。4.NANK4抑制腫瘤細(xì)胞生長我們采用MTT比色法測定活細(xì)胞線粒體內(nèi)i^ormazan含量以檢測腫瘤細(xì)胞群體增 殖能力。選用對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞、HeLa細(xì)胞以5_7X IO3ceIls/孔的細(xì)胞量鋪96孔 板，每種細(xì)胞分為3組(pNANK4轉(zhuǎn)染、pcDNA3. 1轉(zhuǎn)染，空細(xì)胞組)，共設(shè)置l_6d六個時相點， 每天測定的比色值取10個重復(fù)孔的平均數(shù)，繪制生長曲線，平行組間進(jìn)行t檢驗。結(jié)果如 附圖15所示，與pcDNA3. 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞組和空細(xì)胞組相比，pNANK4組細(xì)胞R)rmazan的生成量 隨時間的延長明顯的減少，顯著差異(P < 0. 01)。這些結(jié)果說明，NANK4的表達(dá)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞 的生長起到顯著的抑制作用。5. NANK4引起腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯為了檢測NANK4基因的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，我們通過流式細(xì)胞儀測 定細(xì)胞中DNA含量，從而獲得各細(xì)胞周期時相的百分比。首先將空細(xì)胞、篩選的含有空載 體pcDNA3. 1的陽性細(xì)胞株以及表達(dá)NANK4基因的陽性細(xì)胞株分別擴(kuò)增培養(yǎng)，收獲細(xì)胞經(jīng)冷 PBS洗滌、70 %冷乙醇固定過夜、PI染色后，進(jìn)行FACS分析。結(jié)果如圖3. 10所示，表達(dá)NANK4 基因的陽性細(xì)胞株與對照組相比，GO-Gl期的細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少。在MCF-7細(xì) 胞中，GO-Gl期細(xì)胞由40. 01 士 1. 0%增加到64. 91 士2. 4%，而S期細(xì)胞由40. 12士 1. 3%減 至24. 37士3.2%，與對照組相比，差異顯著(ρ <0. 01)(附圖16)；在HeLa細(xì)胞中，GO-Gl期 細(xì)胞由 40. 70士2. 增加到 67. 10士3. 9%，S 期細(xì)胞由 42. 06士3. 2%減至 24. 58士3. 4%, 與對照組相比，差異顯著(P < 0. 01)(附圖16)。這一結(jié)果說明，NANK4基因的表達(dá)可以引 起腫瘤細(xì)胞Gl期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞由Gl期向S期過渡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。6.NANK4能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡樣品經(jīng)處理后，用流式細(xì)胞儀檢測，以Armexin V為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)作圖發(fā) 現(xiàn)，MCF-7空細(xì)胞的自然凋亡率為4. 01 士0. 9%，表達(dá)NANK4基因的陽性細(xì)胞株的凋亡率為 26. 23士 1.4% (附圖17A) ；HeLa空細(xì)胞的自然凋亡率為3. 98士0. 4%，表達(dá)NANK4基因的 陽性細(xì)胞株的凋亡率為25. 75士2.0% (附圖17A)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，與對照組相比，差異顯 著(P < 0. 01)(附圖17B)。本結(jié)果說明NANK4基因的表達(dá)顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤人源單鏈抗體，其特征在于是特異性抗人CDK4人源單鏈抗體，其核苷 酸序列如kquence NO. 1所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤人源單鏈抗體，其特征在于還包含核定位信號肽 NLS、E-tag標(biāo)簽肽基因編碼序列，其核苷酸序列如kquence NO. 2所述。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤人源單鏈抗體在制備具有抗腫瘤作用的藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的抗腫瘤人源單鏈抗體的應(yīng)用，所述的腫瘤為人乳腺癌和人宮頸癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤人源單鏈抗體，屬于一種人源抗體。是特異性抗人CDK4人源單鏈抗體，其核苷酸序列如Sequence NO.1所述；還包含核定位信號肽NLS、E-tag標(biāo)簽肽基因編碼序列，其核苷酸序列如Sequence NO.2所述；所述的抗腫瘤人源單鏈抗體在制備具有抗腫瘤作用的藥物中的應(yīng)用；所述的腫瘤為人乳腺癌和人宮頸癌。本發(fā)明是一種低毒、高效、特異的抑制CDK4的活性的分子，具有分子量小、免疫原性低等優(yōu)點，通過使用腫瘤特異性真核表達(dá)載體，進(jìn)行該抗體的腫瘤靶向治療，實現(xiàn)該治療基因的可控性，具有腫瘤特異性，確保治療的安全有效。
文檔編號C07K16/40GK102140139SQ20101010460
公開日2011年8月3日 申請日期2010年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月3日
發(fā)明者馮晶, 李桂英, 王磊, 許晶晶 申請人:吉林大學(xué)