專利名稱：：一種維生素b12的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法制備維生素B12的方法，具體地說(shuō)，涉及一種維生素B12的提取方法。
背景技術(shù)：
：維生素B12(VitaminB12)又稱氰鈷胺素(Cyanocobalamin)，也稱為動(dòng)物蛋白因子，是一類含有類似氰鈷胺素維生素活性物質(zhì)的總稱。它是唯一含有金屬離子的水溶性維生素，又是人體必需的維生素之一。維生素B12的分子式為C63H88CoN14014P，其熔點(diǎn)很高(320°C時(shí)不熔)，無(wú)臭無(wú)味，極易吸潮，晶體吸水后在空氣中穩(wěn)定。維生素B12溶于水，難溶于乙醇，不溶于丙酮、氯仿和乙醚，遇強(qiáng)光可分解，在21022(TC高溫下會(huì)變色，在強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性環(huán)境中可分解。維生素B12是比較特殊的一種維生素，大多數(shù)植物性食品中不含維生素B12，主要存在于動(dòng)物組織中。維生素B12是人體組織代謝過(guò)程中必需的維生素，是人和其它哺乳動(dòng)物維持生長(zhǎng)和促進(jìn)紅細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因子，具有廣泛的生理作用，如參與體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)換及葉酸代謝，促進(jìn)神經(jīng)髓鞘中脂蛋白的形成，保持中樞神經(jīng)和外周髓鞘神經(jīng)纖維的功能完整。臨床上用于治療惡性貧血和恢復(fù)造血功能，也用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病如多發(fā)性神經(jīng)炎、末梢神經(jīng)麻痹等?？傊?，維生素B12是一種人體必需的維生素，其生理功能及營(yíng)養(yǎng)作用正日漸引起全社會(huì)的普遍關(guān)注。目前我國(guó)維生素B12的應(yīng)用面較窄，主要是醫(yī)藥用。在國(guó)外，維生素B12除用于醫(yī)藥方面(約占全部消費(fèi)量40%左右)以外，還大量應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和食品加工方面(約占全部消費(fèi)量的24%左右)，如維生素口服液、維生素強(qiáng)化面粉、嬰兒食品等。因此我國(guó)的維生素B12應(yīng)用于食品行業(yè)相關(guān)產(chǎn)品的市場(chǎng)發(fā)展空間很大，可以借鑒發(fā)達(dá)國(guó)家的經(jīng)驗(yàn)，開(kāi)發(fā)添加維生素B12等多種維生素的營(yíng)養(yǎng)食品、保健食品等，這樣既能改善人們的營(yíng)養(yǎng)狀況和提高人們的身體素質(zhì)，又能促進(jìn)維生素B12相關(guān)食品行業(yè)的發(fā)展與進(jìn)步。雖然Woodward已于1973年以非常出色的工作完成了VitaminB12的全化學(xué)合成，但目前工業(yè)上仍然主要是利用細(xì)菌培養(yǎng)液發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12。以謝氏丙酸桿菌的厭氧發(fā)酵工藝為例，其基本提取流程如下<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>人孔樹(shù)脂吸附—乙醇解吸—氰化鈉轉(zhuǎn)化—大孔樹(shù)脂吸附—丙酮解吸<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>目前，發(fā)酵法生產(chǎn)維生素B12的研究重點(diǎn)主要集中在菌株的選育、優(yōu)化以及發(fā)酵工藝、設(shè)備的改進(jìn)等方面。如專利W02003018826"制備維生素B12的方法"公開(kāi)了一種用巨大芽孢桿菌制備維生素B12的方法，主要涉及厭氧條件下巨大芽孢桿菌的發(fā)酵工藝。專利CN200510119016.5"酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法"公開(kāi)了一種酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法利用三磷酸腺苷一維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12，其中的羥鈷型維生素B12使用的終濃度為0.001-0.05mol/l。該方法具有工藝簡(jiǎn)潔、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)。利用本發(fā)明中的生產(chǎn)工藝獲得的終產(chǎn)物腺苷輔酶維生素B12純度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，可加工成多種劑型，為藥用腺苷輔酶維生素B12的大規(guī)模生產(chǎn)提供了一條新途徑。Nakano等人(NakanoK，KataokaH，MatsumuraM.HighdensitycultureofPropionibacteriumfreudenreichiicoupledwithpropionicacidremovalsystemwithactivatedcharcoal[J].FermentBioeng，1996，81(1):37-41.)建立了由旋轉(zhuǎn)陶瓷膜濾器、活性炭填裝柱和發(fā)酵罐組成的發(fā)酵體系。膜濾器和活性炭填裝柱可用于去除丙酸和回收重復(fù)使用的發(fā)酵細(xì)胞和培養(yǎng)基，菲氏丙酸桿菌在發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液先經(jīng)旋轉(zhuǎn)陶瓷膜過(guò)濾，濾液再進(jìn)入裝填柱，最終的透過(guò)液里已不再含有丙酸，可以循環(huán)回到發(fā)酵罐中重復(fù)使用，丙酸和乙酸也可回收成為副產(chǎn)品。與傳統(tǒng)的發(fā)酵法相比，菲氏丙酸桿菌和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率都大大提高了，減少了基質(zhì)的浪費(fèi)，可進(jìn)一步降低成本，有利于實(shí)際生產(chǎn)的應(yīng)用和推廣。用發(fā)酵法生產(chǎn)維生素B12，大多指生產(chǎn)氰基型維生素B12(又稱氰鈷胺素)。在發(fā)酵液和生產(chǎn)維生素B12菌體細(xì)胞內(nèi)，B12的存在形式主要是腺苷輔酶型B12及少量其它型B12，為了把腺苷輔酶等B12轉(zhuǎn)化成氰基B12，必須使用氰化物，目前普遍使用的氰化物為NaCN，它是劇毒品，在生產(chǎn)過(guò)程中存在著職工中毒的安全隱患；產(chǎn)生的廢液中有大量的游離氰根，為了環(huán)保達(dá)標(biāo)，須加入大量的NaC10進(jìn)行廢水處理；產(chǎn)生的廢渣也屬危險(xiǎn)化學(xué)品，須焚燒處理，這樣不僅污染環(huán)境，并且增加了生產(chǎn)成本。對(duì)于上述問(wèn)題，雖然專利CN200810008004.9"—種菌體提取物及其制備方法"實(shí)現(xiàn)了維生素B12發(fā)酵生產(chǎn)廢水的零排放以維生素B12發(fā)酵生產(chǎn)廢水為原料，經(jīng)過(guò)乳酸菌、酵母菌和芽胞桿菌的發(fā)酵過(guò)程后將其制備成微生態(tài)制劑產(chǎn)品，并將該產(chǎn)品用于無(wú)公害農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，開(kāi)辟出了維生素B12廢水的一種新用途，變廢為寶。但是，上述方法仍然無(wú)法避免制備過(guò)程中NaCN的使用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種發(fā)酵法制備維生素B12的新方法，具體地說(shuō)，是一種維生素B12的提取方法。該方法是指在發(fā)酵液的氰化物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，用化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的鐵氰絡(luò)合物代替現(xiàn)有技術(shù)中普遍使用的氰化鈉，在整個(gè)使用過(guò)程和生產(chǎn)過(guò)程中，不產(chǎn)生對(duì)人體、環(huán)境有害的物質(zhì)，廢水廢渣不用進(jìn)行氰離子的回收處理，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本，并且氰基維生素B12的轉(zhuǎn)化率高于NaCN方法。鐵氰絡(luò)合物轉(zhuǎn)化的具體操作過(guò)程為向維生素B12的發(fā)酵液中加入鐵氰絡(luò)合物水溶液，使其反應(yīng)濃度為200-4000ug/ml。用稀H2S04水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ffl值為3.0-8.O，然后將其全部轉(zhuǎn)移至反應(yīng)瓶中，再滴入2滴消沫劑，控制反應(yīng)溫度為50-12(TC，在磁力攪拌反應(yīng)器中反應(yīng)0.5-6小時(shí)。上述轉(zhuǎn)化過(guò)程中的發(fā)酵液也可以是發(fā)酵濾液或其濃縮液。本發(fā)明所述鐵氰絡(luò)合物最好是六氰合鐵(II)酸四鉀。眾所周知，NaCN法轉(zhuǎn)化工藝是把腺苷輔酶B12及其它型B12先轉(zhuǎn)為雙氰B12或亞硝基B12、磺酸基B12，最后再全部轉(zhuǎn)成氰基B12，因多次轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化率會(huì)降低。而本發(fā)明氰基B12的轉(zhuǎn)化工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)過(guò)程安全，生產(chǎn)條件溫和，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，使用的原材料價(jià)格低廉，具有較高的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中維生素B12的含量用高壓液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。具體實(shí)施例方式原材料及試劑l發(fā)酵液本實(shí)驗(yàn)中所用的發(fā)酵液是指將用于生產(chǎn)維生素B12的脫氮假單孢菌(Pseudomonasdenitrificans)，經(jīng)常規(guī)工藝發(fā)酵、水解、過(guò)濾后，所得的濾液，其所含維生素B12的主要類型是腺苷輔酶型維生素B12。2鐵氰絡(luò)合物水溶液、NaCN水溶液、亞硝酸鈉水溶液。儀器與設(shè)備1高壓液相色譜(Lc-10A型)色譜柱C18L=30cmd=3.9mm流動(dòng)相甲醇和水的比例為30%壓力p=2500psi溫度40。C流速F=lml/min進(jìn)樣體積20ul波長(zhǎng)361nm2磁力攪拌器(85-2型)3全自動(dòng)機(jī)械攪拌不銹鋼發(fā)酵系統(tǒng)(GUJT-10-100AUT0BI02000型)實(shí)施例1在100ml小燒杯中加入30ml發(fā)酵液，在攪拌下加入lml濃度為20000ug/ml的鐵氰絡(luò)合物水溶液，使鐵氰絡(luò)合物的反應(yīng)濃度為667ug/ml，用質(zhì)量百分含量為10%的H2S04水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的PH值為3.5±0.5，然后將其全部轉(zhuǎn)移至100ml的容量瓶中，再滴入2滴消沫劑，在磁力攪拌反應(yīng)器中反應(yīng)6小時(shí)，控制溫度55±5°C，反應(yīng)完畢，用蒸餾水定容至100ml，過(guò)濾，取濾液用高壓液相色譜測(cè)定氰基型維生素B12的含量為52.97ug/ml。對(duì)比實(shí)施例1在100ml容量瓶中加入30ml與實(shí)施例1相同的發(fā)酵液，在攪拌下依次加入3ml冰醋酸，3ml質(zhì)量百分含量為8%的亞硝酸鈉水溶液，2.Oml質(zhì)量百分含量為2%的NaCN水溶液，2滴消沫劑，在磁力攪拌反應(yīng)器上反應(yīng)6小時(shí)，控制溫度55±5°C，反應(yīng)完畢，用蒸餾水定容至100ml，過(guò)濾，取濾液用高壓液相色譜測(cè)定氰基型維生素B12的含量為52.50ug/ml。實(shí)施例2向容積為10L的反應(yīng)罐中加入7L發(fā)酵濾液(用NaCN法轉(zhuǎn)化后其氰基維生素B12的含量為115.2ug/ml)，然后邊攪拌邊加入70ml濃度為20000ug/ml的鐵氰絡(luò)合物水溶液，使鐵氰絡(luò)合物的反應(yīng)濃度為200ug/ml，用質(zhì)量百分含量為10%的H2S04水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ra值為7.5±0.5，控制反應(yīng)溫度115±5°C，攪拌轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分，在反應(yīng)罐中反應(yīng)0.5小時(shí)，反應(yīng)完畢，取純凈濾液用高壓液相色譜測(cè)定氰基型維生素B12的含量，結(jié)果為117.59ug/ml。實(shí)施例3向10L反應(yīng)罐中加入7L樹(shù)脂解吸液的濃縮液(用NaCN法轉(zhuǎn)化后其氰基維生素B12的含量為3300.32ug/ml)，開(kāi)啟攪拌，加入280ml濃度為100000ug/ml的六氰合鐵(II)酸四鉀水溶液，使六氰合鐵(II)酸四鉀的反應(yīng)濃度為4000ug/ml，用質(zhì)量百分含量為10%的H2S04水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ra值為6.5±0.5，控制反應(yīng)溫度80±5°C，反應(yīng)罐中反應(yīng)1.5小時(shí)。反應(yīng)完畢，取濾液用高壓液相色譜測(cè)定氰基維生素B12的含量為3368.72ug/ml。。權(quán)利要求一種發(fā)酵法制備維生素B12的方法，包括發(fā)酵、水解、過(guò)濾、氰化物轉(zhuǎn)化、結(jié)晶、干燥等過(guò)程，其特征在于，氰化物轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的氰基化合物為鐵氰絡(luò)合物，其反應(yīng)濃度為200-4000ug/ml，且轉(zhuǎn)化過(guò)程中反應(yīng)體系的PH值為3.0-8.0，反應(yīng)溫度為50-120℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5-6小時(shí)。2.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵法制備維生素B12的方法，其特征在于，所述鐵氰絡(luò)合物為六氰合鐵(II)酸四鉀。全文摘要本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法制備維生素B12的方法，包括發(fā)酵、水解、過(guò)濾、氰化物轉(zhuǎn)化、結(jié)晶、干燥等過(guò)程，尤其是氰化物轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的氰基化合物為鐵氰絡(luò)合物，其反應(yīng)濃度為200-4000ug/ml，且反應(yīng)體系的pH值為3.0-8.0，反應(yīng)溫度為50-120℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5-6小時(shí)。本發(fā)明制備方法克服了目前普遍使用NaCN轉(zhuǎn)化維生素B12所存在的環(huán)境污染、工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、轉(zhuǎn)化收率低等一系列的缺點(diǎn)。文檔編號(hào)C07H23/00GK101736061SQ20101010607公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2010年2月5日優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日發(fā)明者馮勝利,牛瑞昕申請(qǐng)人:馮勝利