專利名稱：一種從干羅漢果中提取多種活性成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種天然產(chǎn)物的分離方法，更特別地說，是指一種采用閃式輔助提取 技術(shù)，通過樹脂分離得到羅漢果中多種活性成分的制備方法。
背景技術(shù)：
在2005年出版的《中國藥典》中收錄，羅漢果為葫蘆科植物。其成熟果實(shí)味甘、性 涼，具有清熱潤肺，滑腸通便等功效。羅漢果是我國傳統(tǒng)的藥用植物，其營養(yǎng)價(jià)值高，富含 糖、蛋白質(zhì)、維生素、脂肪酸及多種氨基酸和微量元素，被譽(yù)為“東方神果”。羅漢果中的主要活性成分是強(qiáng)甜味的三萜類成分——羅漢果甜苷，約占干果重量 的4%。它是一類低熱量的天然甜味劑，比蔗糖甜300倍，但熱量僅為蔗糖的五十分之一。 因羅漢果甜苷甜度高，熱量低，水溶性及穩(wěn)定性好，食用安全，我國已批準(zhǔn)該產(chǎn)品為食品添 加劑，對肥胖癥及糖尿病患者可作為甜味劑代替蔗糖。因目前只重視對羅漢果甜苷的提取，丟棄殘?jiān)推溆喑煞?，這樣不僅造成資源的 浪費(fèi)，而且給環(huán)境帶來污染。本發(fā)明專利申請采用閃式輔助提取技術(shù)，結(jié)合樹脂層析，分離 出多種有效成分，使羅漢果藥材得到最大限度的利用，從而降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的附加值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種從干羅漢果中提取多種活性成分的方法，屬于天然產(chǎn)物 有效成分的提取分離技術(shù)領(lǐng)域。先將干羅漢果的果皮、果肉分開，再將皮或肉分別加水閃 提，離心得沉淀物和上清。上清分別經(jīng)兩次XAD層析，或上聚酰胺-XAD層析，D213柱脫色， 得甜苷、類黃酮；上述沉淀物經(jīng)酸性溶液提取，D113柱分離得生物堿；廢液濃縮，乙醇分級 沉淀得多糖、低聚糖；廢渣用胃酶水解得多糖、低聚糖、氨基酸。本發(fā)明采用先進(jìn)的提取技 術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對羅漢果藥材的綜合利用，降低了生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的附加值和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的從干羅漢果中提取多種活性成分包括有下列步驟第一步閃式輔助制第一液態(tài)混合物將去核的干羅漢果和去離子水放入提取容器中，在溫度2 2 °C 30 °C下浸泡 30min 120min后，在轉(zhuǎn)速3500r/min 5500r/min下攪拌破碎，并勻菜30s 60s后制得 第一液態(tài)混合物；用量100ml的去離子水中添加5g 15g的去核干羅漢果；第二步離心分離將第一液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速4000r/min 5000r/min下離 心分離lOmin 20min后，取下離心管，獲得第一上層清液和第一沉淀物；第三步制甜苷(3-A)在第一上層清液中加入質(zhì)量百分比濃度0. 5% 的NaCl，再用質(zhì)量百分 比濃度25%的NaOH調(diào)節(jié)第一上層清液的pH值為8 10，制得第一上柱液；
(3-B)將第一上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱吸附甜苷，未吸附的成分流出柱 體制得第一收集液；(3-C)待第一上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第一收集液中無甜 苷；(3-D)柱體再用質(zhì)量百分比濃度40% 60%的乙醇洗脫甜苷，乙醇洗脫液在壓力 0. 08MPa 0. 09MPa、溫度40°C 50°C下濃縮至浸膏，然后加入50ml 100ml去離子水溶
解浸膏制得第二上柱液；(3-E)將第二上柱液通過D型大孔吸附樹脂層析柱，吸附色素，未吸附的成分流出 柱體制得第二收集液；(3-F)將第二收集液在壓力0. 08MPa 0. 09MPa、溫度60°C 80°C下濃縮至浸膏， 浸膏在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第一產(chǎn)物——甜苷；第四步制多酚(4-A)將上述第一收集液用質(zhì)量百分比濃度18%的HC1調(diào)節(jié)pH值為3 5，制得 第三上柱液；(4-B)將第三上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱，吸附多酚，未吸附的成分流出柱 體制得第三收集液；(4-C)待第三上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第三收集液中無多 酚；(4-D)柱體再用質(zhì)量百分比濃度50% 80%的乙醇洗脫多酚，乙醇洗脫液在壓力 0. 08MPa 0. 09MPa、溫度40°C 50°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為50°C 70°C條件下干 燥5h 10h后制得第二產(chǎn)物——多酚；第五步制游離多糖和游離低聚糖(5-A)將上述第三收集液在壓力0. 08MPa 0. 09MPa、溫度50°C 70°C下濃縮 至浸膏，然后在浸膏中加入質(zhì)量百分比濃度70% 80%的乙醇，在0°C 4°C條件下靜置 20min 40min后制得第一醇沉混合物；(5-B)將第一醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/ min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第二上層清液和第二沉淀物；(5-D)在第二沉淀物中加入20ml 50ml無水乙醇溶解后，裝入離心機(jī)的離心管 中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，
得到第三上層清液和第三沉淀物，棄去第三上層清液；(5-E)第三沉淀物在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第三產(chǎn) 物——游離多糖；(5-F)在上述第二上層清液中加入1500ml 2000ml乙醇，并在0°C 4°C條件下 靜置20min 40min后，制得第二醇沉混合物；所述乙醇的質(zhì)量百分比濃度為70% 80%;(5-G)將第二醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/ min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第四上層清液和第四沉淀物，棄 去第四上層清液；(5-H)第四沉淀物在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第四產(chǎn) 物——游離低聚糖；
第六步制生物堿(6-A)在上述第一沉淀物中加200ml 400ml的HC1，在轉(zhuǎn)速為100r/min 500r/ min、水浴溫度40°C 60°C條件下攪拌反應(yīng)180min 360min后，制得第二液態(tài)混合物；所 述HC1的質(zhì)量百分比濃度為；(6-B)將第二液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/ min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第五上層清液和第五沉淀物；(6-C)將第五上層清液通過D型離子交換樹脂層析柱，吸附生物堿，未吸附的成分 流出柱體制得第四收集液；(6-D)待第五上層清液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第四收集液中無生 物堿；(6-E)柱體再用質(zhì)量百分比濃度為3%的HC1洗脫生物堿，HC1洗脫液在壓力 0. 08MPa 0. 09MPa、溫度50°C 70°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為50°C 70°C條件下干 燥5h 10h后制得第五產(chǎn)物——生物堿；第七步制結(jié)合多糖和結(jié)合低聚糖(7-A)在第五沉淀物中加入300ml 600ml去離子水，0. 5g 1. Og胃蛋白酶，用 HC1調(diào)節(jié)pH值為2 3，在轉(zhuǎn)速為lOOr/min 500r/min、水浴溫度40°C 60°C條件下攪拌 反應(yīng)300min 600min后，再在水浴溫度100°C條件下反應(yīng)2min 3min，然后冷卻至22°C 35°C，制得酶解液；所述HC1的質(zhì)量百分比濃度為18% ；(7-B)將酶解液裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/min的條件 下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第六上層清液和第六沉淀物，棄去第六沉 淀物；(7-C)用質(zhì)量百分比濃度25%的NaOH調(diào)節(jié)第六上層清液的pH值為6 8，再裝入 離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/min的條件下離心分離lOmin 20min 后，取下離心管，得到第七上層清液和第七沉淀物，棄去第七沉淀物；(7-D)將第七上層清液在壓力0. 08MPa 0. 09MPa、溫度60°C 80°C下濃縮至 50ml 100ml ；再加入150ml 200ml乙醇，并在0°C 4°C條件下靜置20min 40min后， 制得第三醇沉混合物；所述乙醇的質(zhì)量百分比濃度為70% 80% ；(7-E)將第三醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/ min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第八上層清液和第八沉淀物；(7-F)將第八沉淀物在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第六產(chǎn) 物——結(jié)合多糖；(7-G)在上述第八上層清液中加入1000ml 1500ml乙醇，0°C 4°C條件下靜置 20min 40min后，制得第四醇沉混合物；所述乙醇的質(zhì)量百分比濃度為70% 80% ；(7-H)將第四醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/ min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第九上層清液和第九沉淀物；(7-1)第九沉淀物在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第七產(chǎn) 物——結(jié)合低聚糖；第八步制氨基酸將上述第九上層清液在壓力0. 08MPa 0. 09MPa、溫度40°C 50°C下濃縮至浸膏；該浸膏然后在溫度50°C 70°C下干燥5h 10h后制得第八產(chǎn)物——氨基酸。所述的從干羅漢果中提取多種活性成分的方法，100g的干羅漢果中能夠提取出純 度為90. 16士3%的3. 58g 3. 76g的甜苷、8. 04g 9. 32g的生物堿、純度為68. 63士3% 的3. 22g 3. 36g的多酚、純度為50. 13士3%的12. 13g 12. 41g的游離多糖、純度為 28. 97士3%的11. 35g 11. 72g的游離低聚糖、純度為46. 88士3%的2. 24g 2. 61g的結(jié) 合多糖、純度為34. 29 士 3 %的2. 10g 2. 47g的結(jié)合低聚糖、純度為60. 13 士 3 %的8. 09g 8. 78g的氨基酸。本發(fā)明制備方法的優(yōu)點(diǎn)在于(1)在本發(fā)明中的第一步中采用閃式輔助提取技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比，在室溫下操 作，條件溫和，不耐熱的活性成分免遭破壞，而且提取時(shí)間短，溶劑用量少，提取效率高。(2)聚酰胺樹脂層析柱除鞣質(zhì)等雜質(zhì)效果好，可減輕XAD-16柱和D213柱的壓力， 大孔樹脂用量可減少50%，獲得的甜苷純度高，收率高，色澤好，且類黃酮純度高。(3)本發(fā)明采用XAD-16層析，甜苷收率和純度都高于其它非極性大孔樹脂。(4)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)羅漢果含大量生物堿，這對研究羅漢果生物堿的活性和作用 機(jī)理，找到一個(gè)新的途徑。(5)本發(fā)明從層析后的廢液廢渣中提取了生物堿、多糖、低聚糖和氨基酸。這樣綜 合利用羅漢果，既避免資源的浪費(fèi)，又降低了成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。


圖1是本發(fā)明從干羅漢果中提取多種活性成分的工藝流程圖。圖2是采用實(shí)施例1的方法制得羅漢果中甜苷的高效液相色譜圖。圖2A是廣西桂林思特新技術(shù)公司出售羅漢果中甜苷的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。參見圖1所示，本發(fā)明是一種從干羅漢果中提取出多種活性成分的方法，該提取 方法中包括有下列步驟第一步閃式輔助制第一液態(tài)混合物將去核的干羅漢果和去離子水放入提取容器中，在溫度22 °C 30 °C下浸泡 30min 120min后，在轉(zhuǎn)速3500r/min 5500r/min下攪拌破碎，并勻菜30s 60s后制得 第一液態(tài)混合物；用量100ml的去離子水中添加5g 15g的去核干羅漢果；此步驟中的提取容器選取北京金鼎科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的JHBE-50型閃式提 取器。在本發(fā)明中，在22°C 30°C低溫環(huán)境下采用閃式提取方式對浸泡在去離子水中 的干羅漢果進(jìn)行快速勻漿，不破壞羅漢果的活性成分的同時(shí)提取效率高。第二步離心分離將第一液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速4000r/min 5000r/min下離 心分離lOmin 20min后，取下離心管，獲得第一上層清液和第一沉淀物；
在本發(fā)明中，離心后的第一液態(tài)混合物在離心管中分為第一上層清液和第一沉淀 物；為了獲得多種活性成分(即多個(gè)產(chǎn)物，如甜苷、生物堿、多酚、游離多糖、游離低聚糖、結(jié) 合多糖、結(jié)合低聚糖和氨基酸)，本發(fā)明將分別對第一上層清液和第一沉淀物進(jìn)行后續(xù)處理 進(jìn)行詳細(xì)說明。第三步制甜苷(3-A)在第一上層清液中加入0.5% (質(zhì)量百分比濃度)的NaCl，再用25% (質(zhì)量百分比濃度)的NaOH調(diào)節(jié)第一上層清液的pH值為8 10，制得第一上柱液；(3-B)將第一上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱吸附甜苷，未吸附的成分流出柱 體制得第一收集液；(3-C)待第一上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第一收集液中不含有 甜苷；在本發(fā)明中，柱液中是否有甜苷的檢測方法為薄層色譜法(色譜條件硅膠G薄層 板，展開劑為正丁醇-乙醇-水，體積比8 2 3，甜苷的比移值為0.4)；(3-D)柱體再用40% 60% (質(zhì)量百分比濃度)的乙醇洗脫甜苷，乙醇洗脫液在 壓力0. 08MPa 0. 09MPa、溫度40°C 50°C下濃縮至浸膏，然后加入50ml 100ml去離子 水溶解浸膏制得第二上柱液；(3-E)將第二上柱液通過D型大孔吸附樹脂層析柱，吸附色素，未吸附的成分流出 柱體制得第二收集液；(3-F)將第二收集液在壓力0. 08MPa 0. 09MPa、溫度60°C 80°C下濃縮至浸膏， 浸膏在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第一產(chǎn)物(即甜苷)。從羅漢果中提取得到的甜苷是一類低熱量的天然甜味劑，比蔗糖甜300倍，但熱 量僅為蔗糖的五十分之一。我國已批準(zhǔn)該產(chǎn)品為食品添加劑，對肥胖癥及糖尿病患者可作 為甜味劑代替蔗糖。1995年，在《中國中藥雜志》上“羅漢果中總皂甙的含量測定”文獻(xiàn)中結(jié)果得到羅 漢果中一般含甜苷3. 81 %。采用本發(fā)明工藝制得的甜苷收率(即甜苷重量占原料重量的百 分比)較高，達(dá)到3. 76%，說明本工藝對甜苷進(jìn)行了更有效的提取；與市售甜苷樣品(廣西 桂林思特新技術(shù)公司，甜苷含量70 %左右)相比，本工藝制得的甜苷純度較好，達(dá)到90 %以 上。第四步制多酚(4-A)將上述第一收集液用18% (質(zhì)量百分比濃度)的HC1調(diào)節(jié)pH值為3 5， 制得第三上柱液；(4-B)將第三上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱，吸附多酚，未吸附的成分流出柱 體制得第三收集液；(4-C)待第三上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第三收集液中不含有 多酚；在本發(fā)明中，柱液中是否有多酚的檢測方法為紫外分光光度法；(4-D)柱體再用50% 80% (質(zhì)量百分比濃度)的乙醇洗脫多酚，乙醇洗脫液在 壓力0. 08MPa 0. 09MPa、溫度40°C 50°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為50°C 70°C條件 下干燥5h 10h后制得第二產(chǎn)物(多酚)；
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，多酚類物質(zhì)具有降血糖、降血脂、抗氧化、清除機(jī)體內(nèi)自由基， 抗衰老，增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能。第五步制游離多糖和游離低聚糖(5-A)將上述第三收集液在壓力0. 08MPa 0. 09MPa、溫度50°C 70°C下濃縮至 浸膏，然后在浸膏中加入質(zhì)量百分比濃度為70% 80%的乙醇，在0°C 4°C條件下靜置 20min 40min后制得第一醇沉混合物；(5-B)將第一醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/ min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第二上層清液和第二沉淀物；(5-D)在第二沉淀物中加入20ml 50ml無水乙醇溶解后，裝入離心機(jī)的離心管 中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，
得到第三上層清液和第三沉淀物，棄去第三上層清液；(5-E)第三沉淀物在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第三產(chǎn)物(游 離多糖)；(5-F)在上述第二上層清液中加入1500ml 2000ml的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為 70% 80% )后，在0°C 4°C條件下靜置20min 40min，制得第二醇沉混合物；(5-G)將第二醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/ min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第四上層清液和第四沉淀物，棄 去第四上層清液；(5-H)第四沉淀物在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第四產(chǎn)物(游 離低聚糖)；第六步制生物堿(6-A)在上述第一沉淀物中加200ml 400ml的HC1 (質(zhì)量百分比濃度為)， 在轉(zhuǎn)速為100r/min 500r/min、水浴溫度40°C 60°C條件下攪拌反應(yīng)180min 360min 后，制得第二液態(tài)混合物；(6-B)將第二液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/ min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第五上層清液和第五沉淀物；(6-C)將第五上層清液通過D型離子交換樹脂層析柱，吸附生物堿，未吸附的成分 流出柱體制得第四收集液；(6-D)待第五上層清液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第四收集液中不含 有生物堿；在本發(fā)明中，生物堿檢測方法為碘化鉍鉀反應(yīng)，若出現(xiàn)紫棕色沉淀則判斷有生物 堿存在；(6-E)柱體再用質(zhì)量百分比濃度為3%的HC1洗脫生物堿，HC1洗脫液在壓力 0. 08MPa 0. 09MPa、溫度50°C 70°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為50°C 70°C條件下干 燥5h 10h后制得第五產(chǎn)物(生物堿)；采用第六步驟的工藝從羅漢果中提取出生物堿。生物堿是一類具有抗菌消炎、抗 腫瘤等功能的活性物質(zhì)。第七步制結(jié)合多糖和結(jié)合低聚糖(7-A)在第五沉淀物中加入300ml 600ml去離 水，0. 5g 1. 0g胃蛋白酶，用HC1 (質(zhì)量百分比濃度為18%)調(diào)節(jié)pH值為2 3，在轉(zhuǎn)速為lOOr/min 500r/min、水浴 溫度40°C 60°C條件下攪拌反應(yīng)300min 600min后，再在水浴溫度100°C條件下反應(yīng) 2min 3min，然后冷卻至22°C 35 °C，制得酶解液；(7-B)將酶解液裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/min的條件 下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第六上層清液和第六沉淀物，棄去第六沉 淀物；(7-C)用25% (質(zhì)量百分比濃度)的NaOH調(diào)節(jié)第六上層清液的pH值為6 8， 再裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第七上層清液和第七沉淀物，棄去第七沉淀物；(7-D)將第七上層清液在壓力0. 08MPa 0. 09MPa、溫度60°C 80°C下濃縮至 50ml 100ml，再加入150ml 200ml的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為70 % 80 % )后，在 0°C 4°C條件下靜置20min 40min，制得第三醇沉混合物；(7-E)將第三醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/ min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第八上層清液和第八沉淀物；(7-F)將第八沉淀物在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第六產(chǎn)物 (結(jié)合多糖)；(7-G)在上述第八上層清液中加入1000ml 1500ml的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為 70% 80% )后，在0°C 4°C條件下靜置20min 40min，制得第四醇沉混合物；(7-H)將第四醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min 5000r/ min的條件下離心分離lOmin 20min后，取下離心管，得到第九上層清液和第九沉淀物；(7-1)第九沉淀物在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第七產(chǎn)物(結(jié) 合低聚糖)；多糖在抗病毒、抗凝血、抗衰老等方面發(fā)揮著重要的生物活性作用；低聚糖具有提 高機(jī)體免疫力、抗菌消炎、降血脂、防治齲齒和護(hù)肝等多種生物活性。第八步制氨基酸將上述第九上層清液在壓力0. 08MPa 0. 09MPa、溫度40°C 50°C下濃縮至浸膏， 浸膏再在溫度為50°C 70°C條件下干燥5h 10h后制得第八產(chǎn)物(氨基酸)。氨基酸是生物體內(nèi)構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，與生物的生命活動有著密切的關(guān) 系，它是生物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)成分之一。氨基酸在體內(nèi)具有特殊的生理功能，一些氨基 酸還具有治療作用，例如谷氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸等用于治療肝病疾病、消化道 疾病、腦病、心血管病、呼吸道疾病以及用于提高肌肉活力、」L科營養(yǎng)和解毒等。在本發(fā)明中，三個(gè)實(shí)施例中提取制得的各產(chǎn)物均以100g的干羅漢果進(jìn)行計(jì)量。實(shí)施例1 本實(shí)施從干羅漢果中提取出多種活性成分包括有下列步驟第一步閃式輔助制第一液態(tài)混合物將去核的干羅漢果和去離子水放入閃式提取容器中，在溫度25°C下浸泡120min 后，在轉(zhuǎn)速3500r/min下攪拌破碎，并勻漿60s后制得第一液態(tài)混合物；用量100ml的去離子水中添加10g的去核干羅漢果；第二步離心分離
將第一液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速5000r/min下離心分離15min 后，取下離心管，獲得第一上層清液和第一沉淀物；第三步制甜苷(3-A)在第一上層清液中加入0.65% (質(zhì)量百分比濃度)的NaCl，再用25%(質(zhì)量百分比濃度)的NaOH調(diào)節(jié)第一上層清液的pH值為9.5，制得第一上柱液；(3-B)將第一上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱吸附甜苷，未吸附的成分流出柱 體制得第一收集液；(3-C)待第一上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第一收集液中不含有 甜苷；(3-D)柱體再用60% (質(zhì)量百分比濃度)的乙醇洗脫甜苷，乙醇洗脫液在壓力 0. 09MPa、溫度40°C下濃縮至浸膏，然后加入80ml去離子水溶解浸膏制得第二上柱液；(3-E)將第二上柱液通過D型大孔吸附樹脂層析柱，吸附色素，未吸附的成分流出 柱體制得第二收集液；(3-F)將第二收集液在壓力0. 09MPa、溫度70°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為60°C 條件下干燥8h后制得第一產(chǎn)物(即甜苷)。100g的干羅漢果中可以提取出純度為90. 16%的3. 76g的甜苷。純度采用高效液 相色譜法測試，如圖2、圖2A所示，兩圖相比，本發(fā)明方法制得的甜苷純度略高。色譜條件 Waters Sunfire C18色譜柱(150_X4. 6_，5 y m)；流動相A為水，B為乙腈；梯度洗脫條 件為0 40min，5 68%乙腈；流速為lml/min ；檢測波長為203nm ；進(jìn)樣量為15 yl ；柱溫 為 22°C。第四步制多酚(4-A)將上述第一收集液用18% (質(zhì)量百分比濃度)的此1調(diào)節(jié)？11值為4.5，制 得第三上柱液；(4-B)將第三上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱，吸附多酚，未吸附的成分流出柱 體制得第三收集液；(4-C)待第三上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第三收集液中不含有 多酚；在本發(fā)明中，多酚檢測方法為紫外分光光度法；(4-D)柱體再用75% (質(zhì)量百分比濃度)的乙醇洗脫多酚，乙醇洗脫液在壓力 0. 09MPa、溫度40°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為50°C條件下干燥8h后制得第二產(chǎn)物(多 酚)；100g的干羅漢果中可以提取出純度為68. 63%的3. 36g的多酚。純度測試采用用 分光光度計(jì)測定在760nm下的吸光度(紫外分光光度法)。第五步制游離多糖和游離低聚糖(5-A)將上述第三收集液在壓力0. 09MPa、溫度60°C下濃縮至浸膏，然后在浸膏中 加入質(zhì)量百分比濃度為75%的乙醇，在4°C條件下靜置30min后制得第一醇沉混合物；(5-B)將第一醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下 離心分離15min后，取下離心管，得到第二上層清液和第二沉淀物；(5-D)在第二沉淀物中加入30ml無水乙醇溶解后，裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心分離15min后，取下離心管，得到第三上層清液和第三沉淀
物，棄去第三上層清液；(5-E)第三沉淀物在溫度為60°C條件下干燥8h后制得第三產(chǎn)物(游離多糖)；(5-F)在上述第二上層清液中加入1800ml的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為75% )后， 在4°C條件下靜置30min，制得第二醇沉混合物；(5-G)將第二醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下 離心分離15min后，取下離心管，得到第四上層清液和第四沉淀物，棄去第四上層清液；(5-H)第四沉淀物在溫度為60°C條件下干燥8h后制得第四產(chǎn)物(游離低聚糖)；100g的干羅漢果中可以提取出純度為50. 13 %的12. 41g的游離多糖、純度為 28. 97%的11. 72g的游離低聚糖。純度測試采用用分光光度計(jì)測定在620nm下的吸光度 (紫外分光光度法)。第六步制生物堿(6-A)在上述第一沉淀物中加350ml的HC1 (質(zhì)量百分比濃度為)，在轉(zhuǎn)速為 300r/min、水浴溫度50°C條件下攪拌反應(yīng)240min后，制得第二液態(tài)混合物；(6-B)將第二液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下 離心分離15min后，取下離心管，得到第五上層清液和第五沉淀物；(6-C)將第五上層清液通過D型離子交換樹脂層析柱，吸附生物堿，未吸附的成分 流出柱體制得第四收集液；(6-D)待第五上層清液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第四收集液中不含 有生物堿；在本發(fā)明中，生物堿檢測方法為碘化鉍鉀反應(yīng)，若出現(xiàn)紫棕色沉淀則判斷有生物 堿存在；(6-E)柱體再用質(zhì)量百分比濃度為3%的HC1洗脫生物堿，HC1洗脫液在壓力 0. 09MPa、溫度70°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為70°C條件下干燥5h后制得第五產(chǎn)物(生 物堿)；100g的干羅漢果中可以提取出8. 32g的生物堿。由于生物堿在干羅漢果中為首次 發(fā)現(xiàn)，并且天然產(chǎn)物中生物堿存在的種類較多，故發(fā)明人未對其進(jìn)行純度測試。第七步制結(jié)合多糖和結(jié)合低聚糖(7-A)在第五沉淀物中加入300ml去離子水，0. 5g胃蛋白酶，用HC1 (質(zhì)量百分比 濃度為18% )調(diào)節(jié)pH值為2. 5，在轉(zhuǎn)速為300r/min、水浴溫度50°C條件下攪拌反應(yīng)600min 后，再在水浴溫度10(TC條件下反應(yīng)2min，然后冷卻至25°C，制得酶解液；(7-B)將酶解液裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心分離 15min后，取下離心管，得到第六上層清液和第六沉淀物，棄去第六沉淀物；(7-C)用25% (質(zhì)量百分比濃度)的NaOH調(diào)節(jié)第六上層清液的pH值為7，再裝入 離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心分離15min后，取下離心管，得到第 七上層清液和第七沉淀物，棄去第七沉淀物；(7-D)將第七上層清液在壓力0. 09MPa、溫度70°C下濃縮至60ml，再加入200ml的 乙醇(質(zhì)量百分比濃度為70% )后，在4°C條件下靜置30min，制得第三醇沉混合物；(7-E)將第三醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心分離15min后，取下離心管，得到第八上層清液和第八沉淀物；(7-F)將第八沉淀物在溫度為70°C條件下干燥5h后制得第六產(chǎn)物(結(jié)合多糖)；(7-G)在上述第八上層清液中加入1500ml的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為70% )后， 在4°C條件下靜置30min，制得第四醇沉混合物；(7-H)將第四醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下 離心分離15min后，取下離心管，得到第九上層清液和第九沉淀物；(7-1)第九沉淀物在溫度為70°C條件下干燥5h后制得第七產(chǎn)物(結(jié)合低聚糖)；100g的干羅漢果中可以提取出純度為46. 88%的2. 61g的結(jié)合多糖、純度為 34. 29%的2. 41g的結(jié)合低聚糖。純度測試采用用分光光度計(jì)測定在620nm下的吸光度(紫 外分光光度法)。第八步制氨基酸將上述第九上層清液在壓力0.09MPa、溫度45°C下濃縮至浸膏，浸膏再在溫度為 60°C條件下干燥8h后制得第八產(chǎn)物(氨基酸)。100g的干羅漢果中可以提取出純度為60. 13%的8. 32g的氨基酸。純度采用氨基 酸測定儀測試。實(shí)施例2 本實(shí)施從干羅漢果中提取出多種活性成分包括有下列步驟第一步閃式輔助制第一液態(tài)混合物將去核的干羅漢果和去離子水放入提取容器中，在溫度30°C下浸泡30min后，在 轉(zhuǎn)速5500r/min下攪拌破碎，并勻漿30s后制得第一液態(tài)混合物；用量100ml的去離子水中添加5g的去核干羅漢果；第二步離心分離將第一液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速4000r/min下離心分離20min 后，取下離心管，獲得第一上層清液和第一沉淀物；第三步制甜苷(3-A)在第一上層清液中加入(質(zhì)量百分比濃度)的NaCl，再用25% (質(zhì)量 百分比濃度)的NaOH調(diào)節(jié)第一上層清液的pH值為8，制得第一上柱液；(3-B)將第一上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱吸附甜苷，未吸附的成分流出柱 體制得第一收集液；(3-C)待第一上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第一收集液中不含有 甜苷；在本發(fā)明中，甜苷檢測方法為薄層色譜法(色譜條件硅膠G薄層板，展開劑為正 丁醇-乙醇-水，體積比8 2 3，甜苷的比移值為0.4)；(3-D)柱體再用40% (質(zhì)量百分比濃度)的乙醇洗脫甜苷，乙醇洗脫液在壓力 0. 08MPa、溫度50°C下濃縮至浸膏，然后加入50ml去離子水溶解浸膏制得第二上柱液；(3-E)將第二上柱液通過D型大孔吸附樹脂層析柱，吸附色素，未吸附的成分流出 柱體制得第二收集液；(3-F)將第二收集液在壓力0. 08MPa、溫度80°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為70°C 條件下干燥5h后制得第一產(chǎn)物(即甜苷)。
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100g的干羅漢果中可以提取出純度為89. 77%的3. 58g的甜苷。第四步制多酚(4-A)將上述第一收集液用18% (質(zhì)量百分比濃度)的HC1調(diào)節(jié)pH值為3，制得 第三上柱液；(4-B)將第三上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱，吸附多酚，未吸附的成分流出柱 體制得第三收集液；(4-C)待第三上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第三收集液中不含有 多酚；在本發(fā)明中，多酚檢測方法為紫外分光光度法；(4-D)柱體再用50% (質(zhì)量百分比濃度)的乙醇洗脫多酚，乙醇洗脫液在壓力 0. 08MPa、溫度50°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為70°C條件下干燥5h后制得第二產(chǎn)物(多 酚)；100g的干羅漢果中可以提取出純度為67. 03%的3. 22g的多酚。第五步制游離多糖和游離低聚糖(5-A)將上述第三收集液在壓力0. 08MPa、溫度70°C下濃縮至浸膏，然后在浸膏 中加入質(zhì)量百分比濃度為70%的乙醇，在0°C條件下靜置20min后制得第一醇沉混合物；(5-B)將第一醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下 離心分離20min后，取下離心管，得到第二上層清液和第二沉淀物；(5-D)在第二沉淀物中加入50ml無水乙醇溶解后，裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn) 速為4000r/min的條件下離心分離20min后，取下離心管，得到第三上層清液和第三沉淀 物，棄去第三上層清液；(5-E)第三沉淀物在溫度為70°C條件下干燥5h后制得第三產(chǎn)物(游離多糖)；(5-F)在上述第二上層清液中加入1500ml的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為70% )后， 在0°c條件下靜置20min，制得第二醇沉混合物；(5-G)將第二醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下 離心分離20min后，取下離心管，得到第四上層清液和第四沉淀物，棄去第四上層清液；(5-H)第四沉淀物在溫度為70°C條件下干燥5h后制得第四產(chǎn)物(游離低聚糖)；100g的干羅漢果中可以提取出純度為49. 11 %的12. 13g的游離多糖、純度為 28. 01%的11. 35g的游離低聚糖。第六步制生物堿(6-A)在上述第一沉淀物中加200ml的HC1 (質(zhì)量百分比濃度為)，在轉(zhuǎn)速為 lOOr/min、水浴溫度40°C條件下攪拌反應(yīng)180min后，制得第二液態(tài)混合物；(6-B)將第二液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下 離心分離20min后，取下離心管，得到第五上層清液和第五沉淀物；(6-C)將第五上層清液通過D型離子交換樹脂層析柱，吸附生物堿，未吸附的成分 流出柱體制得第四收集液；(6-D)待第五上層清液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第四收集液中不含 有生物堿；在本發(fā)明中，生物堿檢測方法為碘化鉍鉀反應(yīng)，若出現(xiàn)紫棕色沉淀則判斷有生物堿存在；(6-E)柱體再用質(zhì)量百分比濃度為3%的HC1洗脫生物堿，HC1洗脫液在壓力 0. 08MPa、溫度50°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為50°C條件下干燥10h后制得第五產(chǎn)物(生 物堿)；100g的于羅漢果中可以提取出8. 04g的生物堿。第七步制結(jié)合多糖和結(jié)合低聚糖(7-A)在第五沉淀物中加入600ml去離子水，1. 0g胃蛋白酶，用HC1 (質(zhì)量百分比 濃度為18% )調(diào)節(jié)pH值為2，在轉(zhuǎn)速為lOOr/min、水浴溫度60°C條件下攪拌反應(yīng)300min 后，再在水浴溫度100°C條件下反應(yīng)3min，然后冷卻至35°C，制得酶解液；(7-B)將酶解液裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下離心分離 20min后，取下離心管，得到第六上層清液和第六沉淀物，棄去第六沉淀物；(7-C)用25% (質(zhì)量百分比濃度)的NaOH調(diào)節(jié)第六上層清液的pH值為6，再裝入 離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下離心分離20min后，取下離心管，得到第 七上層清液和第七沉淀物，棄去第七沉淀物；(7-D)將第七上層清液在壓力0. 08MPa、溫度60°C下濃縮至100ml，再加入150ml 的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為80% )后，在0°C條件下靜置20min，制得第三醇沉混合物；(7-E)將第三醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下 離心分離20min后，取下離心管，得到第八上層清液和第八沉淀物；(7-F)將第八沉淀物在溫度為50°C條件下干燥10h后制得第六產(chǎn)物(結(jié)合多糖)；(7-G)在上述第八上層清液中加入1000ml的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為80% )后， 在0°c條件下靜置20min，制得第四醇沉混合物；(7-H)將第四醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下 離心分離20min后，取下離心管，得到第九上層清液和第九沉淀物；(7-1)第九沉淀物在溫度為50°C條件下干燥10h后制得第七產(chǎn)物(結(jié)合低聚糖)；100g的干羅漢果中可以提取出純度為45. 08%的2. 24g的結(jié)合多糖、純度為 31. 49%的2. 10g的結(jié)合低聚糖。第八步制氨基酸將上述第九上層清液在壓力0. 08MPa、溫度50°C下濃縮至浸膏，浸膏再在溫度為 70°C條件下干燥5h后制得第八產(chǎn)物(氨基酸)。100g的干羅漢果中可以提取出純度為58. 73%的8. 09g的氨基酸。實(shí)施例3 本實(shí)施從干羅漢果中提取出多種活性成分包括有下列步驟第一步閃式輔助制第一液態(tài)混合物將去核的干羅漢果和去離子水放入提取容器中，浸泡90min后，在轉(zhuǎn)速4500r/min 下攪拌破碎，并勻漿45s后制得第一液態(tài)混合物；用量100ml的去離子水中添加15g的去核干羅漢果；第二步離心分離將第一液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速4500r/min下離心分離lOmin
后，取下離心管，獲得第一上層清液和第一沉淀物；
第三步制甜苷(3-A)在第一上層清液中加入0.5% (質(zhì)量百分比濃度)的NaCl，再用25% (質(zhì) 量百分比濃度)的NaOH調(diào)節(jié)第一上層清液的pH值為10，制得第一上柱液；(3-B)將第一上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱吸附甜苷，未吸附的成分流出柱 體制得第一收集液；(3-C)待第一上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第一收集液中不含有 甜苷；在本發(fā)明中，甜苷檢測方法為薄層色譜法(色譜條件硅膠G薄層板，展開劑為正 丁醇-乙醇-水，體積比8 2 3，甜苷的比移值為0.4)；(3-D)柱體再用50% (質(zhì)量百分比濃度)的乙醇洗脫甜苷，乙醇洗脫液在壓力 0. 085MPa、溫度40°C 50°C下濃縮至浸膏，然后加入50ml 100ml去離子水溶解浸膏制得 第二上柱液；(3-E)將第二上柱液通過D型大孔吸附樹脂層析柱，吸附色素，未吸附的成分流出 柱體制得第二收集液；(3-F)將第二收集液在壓力0.085MPa、溫度60°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為 50°C條件下干燥10h后制得第一產(chǎn)物(即甜苷)。100g的干羅漢果中可以提取出純度為90. 61%的3. 66g的甜苷。第四步制多酚(4-A)將上述第一收集液用18% (質(zhì)量百分比濃度)的HC1調(diào)節(jié)pH值為5，制得 第三上柱液；(4-B)將第三上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱，吸附多酚，未吸附的成分流出柱 體制得第三收集液；(4-C)待第三上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第三收集液中不含有 多酚；在本發(fā)明中，多酚檢測方法為紫外分光光度法；(4-D)柱體再用60% (質(zhì)量百分比濃度)的乙醇洗脫多酚，乙醇洗脫液在壓力 0. 085MPa、溫度45°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為60°C條件下干燥10h后制得第二產(chǎn)物 (多酚)；100g的干羅漢果中可以提取出純度為66. 03%的3. 25g的多酚。第五步制游離多糖和游離低聚糖(5-A)將上述第三收集液在壓力0. 085MPa、溫度50°C下濃縮至浸膏，然后在浸膏 中加入質(zhì)量百分比濃度為80%的乙醇，在2°C條件下靜置40min后制得第一醇沉混合物；(5-B)將第一醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4500r/min的條件下 離心分離lOmin后，取下離心管，得到第二上層清液和第二沉淀物；(5-D)在第二沉淀物中加入20ml無水乙醇溶解后，裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn) 速為4500r/min的條件下離心分離lOmin后，取下離心管，得到第三上層清液和第三沉淀 物，棄去第三上層清液；(5-E)第三沉淀物在溫度為50°C條件下干燥10h后制得第三產(chǎn)物(游離多糖)；(5-F)在上述第二上層清液中加入2000ml的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為80% )后，在2°C條件下靜置40min，制得第二醇沉混合物；(5-G)將第二醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4500r/min的條件下 離心分離lOmin后，取下離心管，得到第四上層清液和第四沉淀物，棄去第四上層清液；(5-H)第四沉淀物在溫度為50°C條件下干燥10h后制得第四產(chǎn)物(游離低聚糖)；100g的干羅漢果中可以提取出純度為50. 41 %的12. 38g的游離多糖、純度為 29. 07%的11. 6lg的游離低聚糖。第六步制生物堿(6-A)在上述第一沉淀物中加400ml的HC1 (質(zhì)量百分比濃度為)，在轉(zhuǎn)速為 500r/min、水浴溫度60°C條件下攪拌反應(yīng)360min后，制得第二液態(tài)混合物；(6-B)將第二液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4500r/min的條件下 離心分離lOmin后，取下離心管，得到第五上層清液和第五沉淀物；(6-C)將第五上層清液通過D型離子交換樹脂層析柱，吸附生物堿，未吸附的成分 流出柱體制得第四收集液；(6-D)待第五上層清液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第四收集液中不含 有生物堿；在本發(fā)明中，生物堿檢測方法為碘化鉍鉀反應(yīng)，若出現(xiàn)紫棕色沉淀則判斷有生物 堿存在；(6-E)柱體再用質(zhì)量百分比濃度為3%的HC1洗脫生物堿，HC1洗脫液在壓力 0. 085MPa、溫度60°C下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為60°C條件下干燥8h后制得第五產(chǎn)物(生 物堿)；100g的干羅漢果中可以提取出8. 23g的生物堿。第七步制結(jié)合多糖和結(jié)合低聚糖(7-A)在第五沉淀物中加入450ml去離子水，0. 8g胃蛋白酶，用HC1 (質(zhì)量百分比 濃度為18% )調(diào)節(jié)pH值為3，在轉(zhuǎn)速為500r/min、水浴溫度40°C條件下攪拌反應(yīng)450min 后，再在水浴溫度100°C條件下反應(yīng)2. 5min，然后冷卻至30°C，制得酶解液；(7-B)將酶解液裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4500r/min的條件下離心分離 lOmin后，取下離心管，得到第六上層清液和第六沉淀物，棄去第六沉淀物；(7-C)用25% (質(zhì)量百分比濃度)的NaOH調(diào)節(jié)第六上層清液的pH值為8，再裝入 離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4500r/min的條件下離心分離lOmin后，取下離心管，得到第 七上層清液和第七沉淀物，棄去第七沉淀物；(7-D)將第七上層清液在壓力0. 085MPa、溫度80°C下濃縮至80ml，再加入180ml 的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為75% )后，在2°C條件下靜置40min，制得第三醇沉混合物；(7-E)將第三醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4500r/min的條件下 離心分離lOmin后，取下離心管，得到第八上層清液和第八沉淀物；(7-F)將第八沉淀物在溫度為60°C條件下干燥8h后制得第六產(chǎn)物(結(jié)合多糖)；(7-G)在上述第八上層清液中加入1800ml的乙醇(質(zhì)量百分比濃度為75% )后， 在2°C條件下靜置40min，制得第四醇沉混合物；(7-H)將第四醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4500r/min的條件下 離心分離lOmin后，取下離心管，得到第九上層清液和第九沉淀物；
(7-1)第九沉淀物在溫度為60°C條件下干燥8h后制得第七產(chǎn)物(結(jié)合低聚糖)；100g的干羅漢果中可以提取出純度為45. 17%的2. 57g的結(jié)合多糖、純度為 35. 02%的2. 34g的結(jié)合低聚糖。第八步制氨基酸將上述第九上層清液在壓力0. 085MPa、溫度40°C下濃縮至浸膏，浸膏再在溫度為 50°C條件下干燥10h后制得第八產(chǎn)物(氨基酸)。100g的干羅漢果中可以提取出純度為60. 41%的8. 26g的氨基酸。
權(quán)利要求
一種從干羅漢果中提取多種活性成分的方法，其特征在于該提取方法中包括有下列步驟第一步閃式輔助制第一液態(tài)混合物將去核的干羅漢果和去離子水放入提取容器中，在溫度22℃～30℃下浸泡30min～120min后，在轉(zhuǎn)速3500r/min～5500r/min下攪拌破碎，并勻漿30s～60s后制得第一液態(tài)混合物；用量100ml的去離子水中添加5g～15g的去核干羅漢果；第二步離心分離將第一液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速4000r/min～5000r/min下離心分離10min～20min后，取下離心管，獲得第一上層清液和第一沉淀物；第三步制甜苷(3-A)在第一上層清液中加入質(zhì)量百分比濃度0.5％～1％的NaCl，再用質(zhì)量百分比濃度25％的NaOH調(diào)節(jié)第一上層清液的pH值為8～10，制得第一上柱液；(3-B)將第一上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱吸附甜苷，未吸附的成分流出柱體制得第一收集液；(3-C)待第一上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第一收集液中無甜苷；(3-D)柱體再用質(zhì)量百分比濃度40％～60％的乙醇洗脫甜苷，乙醇洗脫液在壓力0.08MPa～0.09MPa、溫度40℃～50℃下濃縮至浸膏，然后加入50ml～100ml去離子水溶解浸膏制得第二上柱液；(3-E)將第二上柱液通過D型大孔吸附樹脂層析柱，吸附色素，未吸附的成分流出柱體制得第二收集液；(3-F)將第二收集液在壓力0.08MPa～0.09MPa、溫度60℃～80℃下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為50℃～70℃條件下干燥5h～10h后制得第一產(chǎn)物——甜苷；第四步制多酚(4-A)將上述第一收集液用質(zhì)量百分比濃度18％的HCl調(diào)節(jié)pH值為3～5，制得第三上柱液；(4-B)將第三上柱液通過XAD型大孔吸附樹脂柱，吸附多酚，未吸附的成分流出柱體制得第三收集液；(4-C)待第三上柱液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第三收集液中無多酚；(4-D)柱體再用質(zhì)量百分比濃度50％～80％的乙醇洗脫多酚，乙醇洗脫液在壓力0.08MPa～0.09MPa、溫度40℃～50℃下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為50℃～70℃條件下干燥5h～10h后制得第二產(chǎn)物——多酚；第五步制游離多糖和游離低聚糖(5-A)將上述第三收集液在壓力0.08MPa～0.09MPa、溫度50℃～70℃下濃縮至浸膏，然后在浸膏中加入質(zhì)量百分比濃度70％～80％的乙醇，在0℃～4℃條件下靜置20min～40min后制得第一醇沉混合物；(5-B)將第一醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min～5000r/min的條件下離心分離10min～20min后，取下離心管，得到第二上層清液和第二沉淀物；(5-D)在第二沉淀物中加入20ml～50ml無水乙醇溶解后，裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min～5000r/min的條件下離心分離10min～20min后，取下離心管，得到第三上層清液和第三沉淀物，棄去第三上層清液；(5-E)第三沉淀物在溫度為50℃～70℃條件下干燥5h～10h后制得第三產(chǎn)物——游離多糖；(5-F)在上述第二上層清液中加入1500ml～2000ml乙醇，并在0℃～4℃條件下靜置20min～40min后，制得第二醇沉混合物；所述乙醇的質(zhì)量百分比濃度為70％～80％；(5-G)將第二醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min～5000r/min的條件下離心分離10min～20min后，取下離心管，得到第四上層清液和第四沉淀物，棄去第四上層清液；(5-H)第四沉淀物在溫度為50℃～70℃條件下干燥5h～10h后制得第四產(chǎn)物——游離低聚糖；第六步制生物堿(6-A)在上述第一沉淀物中加200ml～400ml的HCl，在轉(zhuǎn)速為100r/min～500r/min、水浴溫度40℃～60℃條件下攪拌反應(yīng)180min～360min后，制得第二液態(tài)混合物；所述HCl的質(zhì)量百分比濃度為1％；(6-B)將第二液態(tài)混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min～5000r/min的條件下離心分離10min～20min后，取下離心管，得到第五上層清液和第五沉淀物；(6-C)將第五上層清液通過D型離子交換樹脂層析柱，吸附生物堿，未吸附的成分流出柱體制得第四收集液；(6-D)待第五上層清液全部過柱后，用去離子水沖洗柱體，直至第四收集液中無生物堿；(6-E)柱體再用質(zhì)量百分比濃度為3％的HCl洗脫生物堿，HCl洗脫液在壓力0.08MPa～0.09MPa、溫度50℃～70℃下濃縮至浸膏，浸膏在溫度為50℃～70℃條件下干燥5h～10h后制得第五產(chǎn)物——生物堿；第七步制結(jié)合多糖和結(jié)合低聚糖(7-A)在第五沉淀物中加入300ml～600ml去離子水，0.5g～1.0g胃蛋白酶，用HCl調(diào)節(jié)pH值為2～3，在轉(zhuǎn)速為100r/min～500r/min、水浴溫度40℃～60℃條件下攪拌反應(yīng)300min～600min后，再在水浴溫度100℃條件下反應(yīng)2min～3min，然后冷卻至22℃～35℃，制得酶解液；所述HCl的質(zhì)量百分比濃度為18％；(7-B)將酶解液裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min～5000r/min的條件下離心分離10min～20min后，取下離心管，得到第六上層清液和第六沉淀物，棄去第六沉淀物；(7-C)用質(zhì)量百分比濃度25％的NaOH調(diào)節(jié)第六上層清液的pH值為6～8，再裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min～5000r/min的條件下離心分離10min～20min后，取下離心管，得到第七上層清液和第七沉淀物，棄去第七沉淀物；(7-D)將第七上層清液在壓力0.08MPa～0.09MPa、溫度60℃～80℃下濃縮至50ml～100ml；再加入150ml～200ml乙醇，并在0℃～4℃條件下靜置20min～40min后，制得第三醇沉混合物；所述乙醇的質(zhì)量百分比濃度為70％～80％；(7-E)將第三醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min～5000r/min的條件下離心分離10min～20min后，取下離心管，得到第八上層清液和第八沉淀物；(7-F)將第八沉淀物在溫度為50℃～70℃條件下干燥5h～10h后制得第六產(chǎn)物——結(jié)合多糖；(7-G)在上述第八上層清液中加入1000ml～1500ml乙醇，0℃～4℃條件下靜置20min～40min后，制得第四醇沉混合物；所述乙醇的質(zhì)量百分比濃度為70％～80％；(7-H)將第四醇沉混合物裝入離心機(jī)的離心管中，在轉(zhuǎn)速為4000r/min～5000r/min的條件下離心分離10min～20min后，取下離心管，得到第九上層清液和第九沉淀物；(7-I)第九沉淀物在溫度為50℃～70℃條件下干燥5h～10h后制得第七產(chǎn)物——結(jié)合低聚糖；第八步制氨基酸將上述第九上層清液在壓力0.08MPa～0.09MPa、溫度40℃～50℃下濃縮至浸膏；該浸膏然后在溫度50℃～70℃下干燥5h～10h后制得第八產(chǎn)物——氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從干羅漢果中提取多種活性成分的方法，其特征在于第一 步中的提取容器為閃式提取器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從干羅漢果中提取多種活性成分的方法，其特征在于100g的 干羅漢果中能夠提取出純度為90. 16士3%的3. 58g 3. 76g的甜苷； 純度為68. 63士3%的3. 22g 3. 36g的多酚； 純度為50. 13士3%的12. 13g 12. 41g的游離多糖； 純度為28. 97士3%的11.35g 11. 72g的游離低聚糖; 純度為46. 88士3%的2. 24g 2. 61g的結(jié)合多糖； 純度為34. 29士3%的2. 10g 2. 47g的結(jié)合低聚糖； 純度為60. 13士3%的8. 09g 8. 78g的氨基酸； 8. 04g 9. 32g的生物堿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從干羅漢果中提取多種活性成分的方法，屬于天然產(chǎn)物有效成分的提取分離技術(shù)領(lǐng)域。先將干羅漢果去核，再將果皮和果肉進(jìn)行加水閃提、離心得沉淀物和上清。上清分別經(jīng)兩次XAD層析，或上聚酰胺-XAD層析，D213柱脫色，得甜苷、多酚；上述沉淀物經(jīng)酸性溶液提取，D113柱分離得生物堿；廢液濃縮，乙醇分級沉淀得多糖、低聚糖；廢渣用胃酶水解得多糖、低聚糖、氨基酸。本發(fā)明采用先進(jìn)的提取技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對羅漢果藥材的綜合利用，降低了生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的附加值和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C07H3/06GK101851265SQ201010107948
公開日2010年10月6日 申請日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者劉兆, 劉燦, 劉靜, 楊曄, 王志濱, 榮永海, 榮龍 申請人:北京航空航天大學(xué)