專利名稱：抗腫瘤的核酸與多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抑制腫瘤的多肽藥物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗腫瘤藥物是長久以來被廣泛關(guān)注和研究的熱點(diǎn)問題之一。目前對(duì)腫瘤或癌癥的 治療，通常是采用手術(shù)治療結(jié)合放療和化療的綜合療法。放射線和化療藥導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從 而殺傷腫瘤細(xì)胞。高劑量的放療和化療藥物可以破壞或消滅癌細(xì)胞，但同時(shí)也損害正常細(xì) 胞，使患者免疫功能下降，對(duì)人體造成一系列毒副作用。多肽藥物是目前生物醫(yī)藥領(lǐng)域最具成長性的嶄新領(lǐng)域，以其高效、安全、特異性強(qiáng) 等特點(diǎn)逐漸用于癌癥，傳染病等預(yù)防和治療。基因的功能最終要通過其表達(dá)產(chǎn)物——蛋白 質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，生物體的一切活動(dòng)或功能都離不開蛋白質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)和鑒定具有重要功 能的蛋白質(zhì)，可為新藥的開發(fā)帶來決定性的影響。在全球范圍內(nèi)，據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有的大約 65個(gè)肽類藥物，市場規(guī)模約為200億美元，并且每年以15% 20%的速度遞增。多肽藥物目前在傳染病方面，特別是病毒類的疾病，如艾滋病(HIV)的防治中取 得了進(jìn)展。現(xiàn)已經(jīng)開發(fā)出Enfuvirtide (T20)多肽藥物S其能阻止HIV與T細(xì)胞等免疫細(xì) 胞的接觸融合，干擾HIV-I進(jìn)入T細(xì)胞，防止艾滋病患者的免疫系統(tǒng)遭受病毒破壞來發(fā)生作 用，現(xiàn)已作為常規(guī)抗愛滋病藥物，治療效果很好。我們的一項(xiàng)研究證明，多肽藥物與病毒囊 膜糖蛋白相互作用，阻止其構(gòu)象變化，從而阻斷病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合并將其基因 組注入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，以達(dá)到防治病毒感染的目的2。1997年由我國第一個(gè)人工合成 的多肽類新藥"注射用胸腺五肽"正式上市，該新藥具有免疫雙向調(diào)節(jié)功能?？傊c其它 藥品相比，多肽藥物具備高效、低毒和特異性強(qiáng)的顯著優(yōu)勢(shì)。T-box基因家族編碼是在多種動(dòng)物的發(fā)育中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子家族。它 們以具有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)(T區(qū))為特征，能與靶基因的啟動(dòng)子的特異序列相結(jié)合。 T-box基因家族包括多個(gè)亞族，其中TBX2與TBX3同屬于TBX2亞族。在DNA結(jié)合區(qū)域，TBX2 與TBX3有90%的序列是相同的。已經(jīng)證實(shí)，TBX2與TBX3在許多組織中重疊表達(dá)，主要參 與pl9ARF-p53(人類為pl4ARF)途徑等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡。多家實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織(包括結(jié)腸癌，肝癌，乳腺癌，卵巢癌等)中 TBX2/TBX3基因高表達(dá)3’4’5’6，同時(shí)又發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)導(dǎo)致現(xiàn)有的抗腫瘤藥物無效7。

發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明提供了編碼具有抗腫瘤活性的多肽的核酸分子，該核酸分子包 含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或者在嚴(yán)緊雜交條件下與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序 列雜交的核苷酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或由SEQ ID NO :1所示的核酸序列組成。 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子含有TBX2和/或TBX3基因中與腫瘤相關(guān)的結(jié)構(gòu) 域或其部分。
第二方面，本發(fā)明提供了由本發(fā)明的核酸分子編碼的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述多肽是本發(fā)明的核酸分子表達(dá)產(chǎn)生的稱為TAP21的多肽。第三方面，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的多肽或與其具體 相同功能的變體或衍生物，所述多肽、其變體或衍生物具有抗腫瘤的活性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO :2組成。第四方面，本發(fā)明提供重組載體，其包含與本發(fā)明的核酸分子可操作連接的載體。在一實(shí)施方案中，所述載體是適于表達(dá)本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或者 在嚴(yán)緊雜交條件下與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。第五方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主。在一實(shí)施方案中，所述宿主是用本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或者 在嚴(yán)緊雜交條件下與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。第六方面，本發(fā)明提供了藥物或藥物組合物，其包含本發(fā)明的核酸分子、多肽、載 體或其藥物可接受的鹽，以及賦形劑或藥用載體。在一實(shí)施方案中，所述多肽是由本發(fā)明的核酸分子編碼的多肽，或是包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的多肽、或是與其具體相同功能的變體或衍生物。所述多肽、其變 體或衍生物具有抗腫瘤的活性。第七方面，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的核酸分子、多肽、載體或宿主制備抗腫瘤藥 物或藥物組合物的用途，所述藥物或藥物組合物還包含以及賦形劑或藥用載體。第八方面，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞中TBX2和/或TBX3基因表達(dá)的方法，包括根據(jù)TBX2和/或TBX3基因設(shè)計(jì)非編碼RNA、干擾RNA(RNAi)、反義核酸，及向所述細(xì)胞引入所述的非編碼RNA、RNAi、反義核酸或其組合，從而使TBX2和/或 TBX3基因的表達(dá)下調(diào)。在一實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述非編碼RNA、 RNAi或反義核酸針對(duì)TBX2和/或TBX3基因中與腫瘤相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。第九方面，本發(fā)明提供所述的非編碼RNA、RNAi或反義核酸及其在制備抗腫瘤藥 物中的用途。所述非編碼RNA、RNAi或反義核酸針對(duì)TBX2和/或TBX3基因中與腫瘤相關(guān) 的結(jié)構(gòu)域。第十方面，本發(fā)明提供了抑制個(gè)體的腫瘤細(xì)胞或治療個(gè)體的癌癥的方法，包括對(duì) 所述個(gè)體進(jìn)行有效量的本發(fā)明的核酸分子、多肽、載體、RNAi、反義核酸、宿主細(xì)胞、藥物或 藥物組合物的給藥。


圖1顯示了 pET28a_TAT表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。圖2顯示了四個(gè)寡核苷酸序列形成連接片段的圖示。圖3顯示多肽TAP21的核苷酸和氨基酸序列。圖4顯示多肽TAP21純化的工藝過程。
圖5顯示了多肽TAP21的純度。第一泳道為TAP21多肽，第二、三和四泳道為牛血 清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照(1 μ g、2 μ g和3 μ g)。圖6顯示了 TAP21對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖速度的影響的圖。圖7顯示了 TAP21對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。圖8顯示了 TAP21在體內(nèi)對(duì)腫瘤的抑制效果的圖。圖8A為TAP21對(duì)腫瘤細(xì)胞體 積的影響；圖8B為TAP21對(duì)腫瘤重量的影響；圖8C為TAP21對(duì)腫瘤生長影響的大體照片， 上一行為對(duì)照組，下一行為TAP21治療組，可見治療組的腫瘤體積明顯比對(duì)照組的腫瘤體 積小。
具體實(shí)施方案本發(fā)明人從TBX2和TBX3基因中篩選出一段與腫瘤相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)該結(jié)構(gòu)域 制備的多肽能夠競爭結(jié)合與該結(jié)構(gòu)域相互作用的其他蛋白，從而有效地抑制TBX2和/或 TBX3的活性，達(dá)到抑制或去除腫瘤細(xì)胞的目的。由此，一方面，本發(fā)明提供了核酸分子，該核酸分子包含SEQ ID NO 1所示的核酸 序列或者在嚴(yán)緊的雜交條件下與SEQ ID NO :1雜交的核酸序列。所述核酸序列編碼的多肽 具有抗本發(fā)明所篩選TBX2和/或TBX3基因的結(jié)構(gòu)域的活性，從而具有抗腫瘤的活性或抑 制腫瘤細(xì)胞的生長。本文所用的“嚴(yán)緊的雜交條件”或“雜交的嚴(yán)緊性”能根據(jù)核酸所處的環(huán)境 條件、雜交方法的特點(diǎn)及所用的核酸分子的成分和長度來確定的。Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,2001)禾口 Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York, 1993)討論了為達(dá)到特定的嚴(yán)緊性，所要求的雜交條件的計(jì)算。下 文是一組示例性但非限制性的雜交條件極高嚴(yán)緊件(fri午至Φ 90%相同的序列雜交)雜交5XSSC于65°C達(dá)16小時(shí)洗滌兩次 2 X SSC每次在室溫(RT)達(dá)15分鐘洗滌兩次 0. 5 X SSC每次于65°C達(dá)20分鐘高嚴(yán)緊性(允許至少80%相同的序列雜交)雜交5X-6X SSC 于 65°C-70°C達(dá) 16-20 小時(shí)洗滌兩次 2 X SSC每次在室溫(RT)達(dá)5_20分鐘洗滌兩次1 X SSC每次于55°C _70°C達(dá)30分鐘低嚴(yán)緊性(允許至少50%相同的序列雜交)雜交6 X SSC 在 RT 至 55 °C 達(dá) 16-20 小時(shí)至少洗滌兩次2X-3X SSC每次在RT至55°C達(dá)20_30分鐘。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嚴(yán)緊雜交條件是高度嚴(yán)緊性雜交條件，優(yōu)選是 極高嚴(yán)緊性雜交條件。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子由SEQ ID NO 1 所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列組成。另一方面，提供了由本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽，該多肽具有抗腫瘤活性或抑制腫瘤生長。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽是命名為TAP21的多肽。再一方面，提供了具有抗腫瘤活性或抑制腫瘤生長的多肽，其包含SEQ ID NO :2所 示的氨基酸序列，或其具體相同功能的變體或衍生物。本發(fā)明的“多肽”或“肽”可以交替使用?！岸嚯摹被颉半摹笔嵌N或更多種氨基酸 的任意鏈，無論翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)的情況如何，包括自然發(fā)生或非自然 發(fā)生的氨基酸或氨基酸類似物。在本領(lǐng)域中，眾所周知可以在多肽的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行諸如取代、添加或替換的某些修 飾和變化而基本上不改變?cè)摱嚯牡纳飳W(xué)功能，從而得到生物學(xué)等同的多肽。本發(fā)明的“多肽”或“肽”可包含有異常連接、交聯(lián)和末端帽子，非肽鍵或其它修飾 基團(tuán)。這些修飾基團(tuán)也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。術(shù)語“修飾基團(tuán)”是指包括直接附著于所述肽 結(jié)構(gòu)(例如，通過共價(jià)軛合)的結(jié)構(gòu)，以及那些間接附著于所述肽結(jié)構(gòu)(例如，通過穩(wěn)定的 非共價(jià)連接或通過共價(jià)偶聯(lián)于其它的氨基酸殘基或其模擬物、類似物或衍生物，其可以位 于所述核心肽結(jié)構(gòu)的側(cè)翼)的結(jié)構(gòu)。例如，所述修飾基團(tuán)可以偶聯(lián)于肽結(jié)構(gòu)的氨基末端或 羧基末端，或偶聯(lián)于所述核心結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的肽或肽模擬結(jié)構(gòu)?；蛘撸鲂揎椈鶊F(tuán)可以耦合 于肽結(jié)構(gòu)的至少一個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈，或偶聯(lián)于所述核心結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的肽或肽模擬區(qū)域 (例如，通過賴氨酰殘基的ε氨基，通過天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的羧基，通過酪氨酰殘 基、絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的羥基，或在氨基酸側(cè)鏈上的其它適合的反應(yīng)基團(tuán))。共價(jià)偶 聯(lián)于所述肽結(jié)構(gòu)的修飾基團(tuán)可通過本領(lǐng)域中公知的方式和方法結(jié)合于連接性化學(xué)結(jié)構(gòu)，包 括，例如酰胺，烷氨基，氨基甲酸鹽或尿素鍵。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽也可以擴(kuò)展為生物學(xué)等同的多肽，或 通過保守性氨基酸替換而獲得的本發(fā)明所述多肽序列的部分序列的變體；或通過不影響生 物學(xué)功能，例如所述結(jié)構(gòu)域的非保守性替換而獲得的本發(fā)明所述多肽序列的部分序列的變 體。本文所使用的術(shù)語“保守的氨基酸替換”是指在所述多肽的給定位置上一種氨基 酸對(duì)另一種氨基酸的替換，其中可以在基本上不喪失相關(guān)功能的條件下進(jìn)行所述替換。保守性的氨基酸替換包括用對(duì)應(yīng)的D-氨基酸或用自然發(fā)生的、非遺傳編碼形式 的氨基酸替換L-氨基酸，或者是L-氨基酸的保守性替換。自然發(fā)生非遺傳編碼的氨基酸包括β -丙氨酸，3-氨基丙酸，2，3- 二氨基丙酸， α -氨基異丁酸，4-氨基丁酸，N-甲基甘氨酸(肌氨酸)，羥基脯氨酸，鳥氨酸，瓜氨酸，t- 丁 基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，N-甲基異亮氨酸，苯基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，正亮氨酸，戊氨 酸，2-萘基丙氨酸，吡啶基丙氨酸，3-苯并噻吩基丙氨酸，4-氯苯基丙氨酸，2-氟苯基丙氨 酸，3-氟苯基丙氨酸，4-氟苯基丙氨酸，青霉胺，1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸，β -2-噻 吩基丙氨酸，甲硫氨酸亞砜，高精氨酸，N-乙酰賴氨酸，2-氨基丁酸，2-氨基丁酸，2，4- 二氨 基丁酸，P"氨基苯丙氨酸，N-甲基纈氨酸，高半胱氨酸，高絲氨酸，磺基丙氨酸，ε _氨基己 酸，S-氨基戊酸或2，3-二氨基丁酸。在某些實(shí)施方案中，“保守取代”為用一氨基酸取代另一具有類似特性的氨基酸的 取代，從而肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)料多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性不會(huì)發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變。 氨基酸取代通?；跉埢臉O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兼性性質(zhì)的相似性 進(jìn)行。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的帶有不帶電荷的極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨 酸和纈氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨 酸。其它可代表保守改變的氨基酸基團(tuán)包括(DAla, Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser, Thr ； (2)Cys、Ser、Tyr、Thr ； (3) Val、lie、Leu、Met、Ala、Phe ； (4) Lys、Arg、His ；禾口 (5)Phe、 Tyr、Trp、HiS。變體也可以或可擇地含有非保守改變。在具體實(shí)施方案中，變體多肽通過5 個(gè)或更少氨基酸的取代、缺失或添加而不同于原序列。變體也可以(或可選地)通過例如 氨基酸的缺失或添加進(jìn)行修飾，所述氨基酸的缺失或添加對(duì)多肽的免疫原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和 水性的影響最小。在其它實(shí)施方案中，保守性改變還可包括通過例如氨基酸的官能側(cè)鏈反應(yīng)，對(duì)非 衍生殘基進(jìn)行化學(xué)衍生。因此，這些取代基可包括這樣的化合物，其游離的氨基被衍生成鹽 酸胺，P-甲苯磺酰基，卞氧羰基，t-丁氧羰基，氯乙酰基或甲?；?。類似地，游離的羧基可被 衍生形成鹽，甲基或乙基酯或其它類型的酯或胼，且側(cè)鏈可被衍生形成游離羥基的O-?；?或0-烷基衍生物，或組氨酸咪唑氮的N-亞氨苯甲基組氨酸。多肽類似物還可包括被化學(xué)改 變的，例如甲基化，通過諸如乙胺，乙醇胺或乙二胺的烷基胺對(duì)C-末端氨基酸的酰胺化，或 對(duì)氨基酸側(cè)鏈的乙?；蚣谆?例如對(duì)賴氨酸ε氨基的乙?；?的氨基酸。多肽衍生 物還可包括用取代的酰胺(例如，通式為-C(O)-NR的基團(tuán)，其中R是(C1-C6)烷基，(C1-C6) 烯基，(C1-C6)炔基，取代的(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烯基或取代的(C1-C6)炔基)對(duì)酰 胺鍵進(jìn)行替換或酰胺鍵的同電子排列體(例如，-CH2NH-, -CH2S, -CH2CH2-, -CH = CH-(順式 和反式),-C (0) CH2-, -CH(OH) CH2-或-CH2SO-)。在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定了本發(fā)明的多肽，例如SEQ ID NO :2中的活性位點(diǎn)，用 不同的氨基酸替換SEQ ID NO 2中的活性位點(diǎn)，例如，用GGGGGGG替換活性位點(diǎn)44-50的 44L45F46P47Y48P49Y50T氨基酸序列，AAA替換活性位點(diǎn)68H69RtoH之后得到SEQ ID NO 17，可獲得 基本不再具有SEQ ID NO :2活性的變體。而在另一實(shí)施方案中，用上述保護(hù)的氨基酸替換 或缺失SEQ ID NO :2序列中非活性位點(diǎn)的氨基酸，使得其二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性不會(huì)發(fā)生實(shí)質(zhì) 性改變，從而獲得活性不發(fā)生實(shí)質(zhì)改變的衍生物或變體。例如，在(l)Ala、Pro、Gly、Glu、 Asp、Gin、Asn、Ser> Thr ； (2) Cys> Ser> Tyr> Thr ； (3) Val、lie、Leu、Met、Ala、Phe ； (4) Lys> Arg.His ；和(5)Phe、Tyr、Trp、His各組中氨基酸間的替換。優(yōu)選地，通過保守取代，替換上 述活性位點(diǎn)以外的氨基酸序列中的約1-20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選替換約1-10個(gè)氨基酸，尤其優(yōu) 選替換約1-5個(gè)氨基酸，最優(yōu)選替換1、2或3個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)例中，用Arg替換5His得 到氨基酸序列SEQ ID NO :18，其具有與SEQ ID NO :2相同的活性。在另一實(shí)例中，用GG替 換53A54A得到序列SEQ ID NO :19，其也具有與SEQ ID NO 2相同的活性。本文所用的氨基酸上角的數(shù)字代表該氨基酸在序列中的位置。取代、缺失多 肽氨基酸序列中特定位點(diǎn)的氨基酸，從而得到該多肽的衍生物或變體的方法是本領(lǐng) 域公知的，例如，通過合成或PCR等定點(diǎn)突變或缺失可以制備上述衍生物或變體。也 bJ Lii, # JAL Sambrook 等人’ Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001)所述的方法來進(jìn)行。另一方面，本發(fā)明提供重組載體，其包含與本發(fā)明的核酸分子可操作連接的載體。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體是適于表達(dá)本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)載體。本文所用的術(shù)語“載體”指能轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一個(gè)核酸的核酸分子。一種類型的可用載體是附加體(即能進(jìn)行染色體外復(fù)制的核酸)。可用的載體是能自主復(fù)制和/或表 達(dá)與其連接的核酸的載體。能指導(dǎo)與其可操作地連接的基因表達(dá)的載體在本文中稱為“表 達(dá)載體”。通常，重組DNA技術(shù)中所用的表達(dá)載體經(jīng)常采用“質(zhì)?！钡男问?，其通常指環(huán)狀雙 鏈DNA。本文所用“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以交換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而， 也包括發(fā)揮等同功能且隨后在本領(lǐng)域內(nèi)目前已知的其它形式的表達(dá)載體?？寺≥d體和表達(dá)載體都含有允許載體在一種或多種適宜的生物體中復(fù)制的核苷 酸序列。在克隆載體中，這種序列通常是能使載體不依賴于宿主的染色體復(fù)制的序列，且 還包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。各種細(xì)菌和病毒的復(fù)制起點(diǎn)是公知的，包括但不限于 PBR322來源的ColEl復(fù)制子、P15A復(fù)制子、pCloDF13復(fù)制子、pKN402復(fù)制子、pMBl (pUC)復(fù) 制子、PSClOl復(fù)制子和SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV以及BPV病毒復(fù)制起點(diǎn)。可以通過重組表達(dá)載體，利用本文公開的核酸分子產(chǎn)生多肽?？梢允褂梅N類繁多 的表達(dá)載體。例如，質(zhì)粒、染色體、附加體和病毒來源的載體，包括衍生于細(xì)菌質(zhì)粒、細(xì)菌噬 菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒的載體，所述病毒是諸如桿狀病毒、乳多空病毒 (諸如SV40)、疫苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及衍生于上述 組合的載體，諸如衍生于質(zhì)粒和細(xì)菌噬菌體基因元件的載體，如粘粒和噬菌粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述載體包括但不限于，pET、pBR322 (Ε. coli)、 pACYC177(E. coli)、pKT230 (革蘭氏陰性菌)、pGVl 106 (革蘭氏陰性菌)、pLAFRl (革蘭氏 陰性菌)、pME290 (非E. coli革蘭氏陰性菌)、pHV14 (Ε. coli和枯草芽孢桿菌)、pBD9 (芽孢 桿菌)、Pl J61 (鏈霉菌)、pUC6 (鏈霉菌)、噬菌體X (E. coli), Yip5 (酵母)、YCp 19 (酵母)、 腺病毒、慢病毒或牛乳頭瘤病毒(哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。一般地，可將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入任意適合的宿主細(xì)胞，并在其 中生產(chǎn)本發(fā)明的所述多肽?？稍诖_定宿主系統(tǒng)后，再選擇表達(dá)載體以及確定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的 方法。可采用多種表達(dá)系統(tǒng)。例如，可在原核宿主(例如，E. coli)或真核宿主(例如，啤 酒酵母，諸如Sf21細(xì)胞的昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞、種子或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，NIH3T3，HeLa或 COS細(xì)胞)中生產(chǎn)本發(fā)明所述的多肽。這樣的細(xì)胞可來自多種途徑(例如，美國典型培養(yǎng)物 保藏中心，Manassus，美國，或中國微生物保藏中心)。適合多肽生產(chǎn)的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)包括 E. coli pET 表達(dá)系統(tǒng)(Novagen，Inc.)，以及 pGEX 表達(dá)系統(tǒng)(Pharmacia)。優(yōu)選 pET28a 表 達(dá)系統(tǒng)。通過多種公知的常規(guī)技術(shù)中的任何一種，將適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄胁迦胼d體。通常，通過用一種或多種限制核酸內(nèi)切酶切割核酸序列和表達(dá)載體，隨后利用 T4-DNA連接酶將限制片段連接在一起，將待表達(dá)的核酸序列連接于表達(dá)載體。用于限制性 切割和連接的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。有關(guān)此的適宜方法以及利用替代技術(shù)構(gòu)建表達(dá) 載體的適宜方法，所述替代技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)也是公知的，在Sambrook et al. , Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第三版，1-3 卷，Cold Spring Harbor,New York(2000)中，有非常詳細(xì)的描述。這些替代技術(shù)的非限制性實(shí)例包括，例如， 借助重組酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶并入核酸序列。利用諸如PCR、DNA合成、平末端連接、或在限制酶位點(diǎn)連接的常規(guī)技術(shù)，可以修飾 核酸序列或?qū)⑵溥B接在一起。如果沒有適宜的限制位點(diǎn)，則可以利用合成的寡核苷酸適體 或連接子(參閱，例如Sambrook et al.，同上)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到，許多啟動(dòng)子可以在細(xì)胞中發(fā)揮功能，并在文獻(xiàn) 中已有描述，包括組成性、誘導(dǎo)性、發(fā)育調(diào)節(jié)以及環(huán)境調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。使用在適當(dāng)宿主中發(fā)揮 功能的啟動(dòng)子(也稱為轉(zhuǎn)錄起始區(qū))特別有利。例如，如果用E. coli作為宿主，可以使用 的示例性的啟動(dòng)子包括但不限于噬菌體λ PL啟動(dòng)子、Ε. coli lac、trp、trc和tac啟動(dòng)子、 SV40早期和晚期啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs啟動(dòng)子以及CaMV 35S啟動(dòng)子。如果釀酒酵母是 宿主，則目的序列通常受酵母啟動(dòng)子的調(diào)控?？捎玫慕湍竼?dòng)子的非限制性實(shí)例包括GAL/ CYC啟動(dòng)子。本文中未曾提及的、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何適宜的啟動(dòng)子，都可以很容 易地用于本文所述的本發(fā)明中。例如，可以使用已知調(diào)控原核或真核細(xì)胞中基因表達(dá)的其 它啟動(dòng)子。表達(dá)載體也可以含有翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。載體也可以 含有可用于擴(kuò)增基因表達(dá)的序列。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子可操作地連接于編碼多肽的核酸分子。本文所用術(shù)語“可操作地連接”意指所選的核苷酸序列(如編碼本文所述的多肽) 緊密接近啟動(dòng)子，以允許啟動(dòng)子調(diào)節(jié)所選核酸分子或DNA的表達(dá)。另外，在轉(zhuǎn)錄和翻譯方向 上，啟動(dòng)子位于所選核苷酸序列的上游。所謂“可操作地連接”意指，當(dāng)適當(dāng)?shù)姆肿?如轉(zhuǎn) 錄激活蛋白)結(jié)合于調(diào)控序列時(shí)，核苷酸序列和該調(diào)控序列的連接方式使得基因被表達(dá)。也可以在表達(dá)構(gòu)建體或載體中提供轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)可由編碼Ole蛋白序 列的載體序列提供，或使用與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然相關(guān)的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。能在宿主生物體中終止 轉(zhuǎn)錄的任何便利的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，都可以用于本文公開的構(gòu)建體中。表達(dá)載體和克隆載體可 以，且通常的確含有具有用于在宿主中表達(dá)的必要調(diào)節(jié)區(qū)的結(jié)構(gòu)基因或選擇標(biāo)記，以便選 擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞?；蚩梢蕴峁?duì)細(xì)胞毒性劑(如抗生素、重金屬、或毒素)的抗性、為營養(yǎng)缺 陷型宿主提供原養(yǎng)型性的互補(bǔ)性、病毒免疫性等。取決于引入了表達(dá)構(gòu)建體或其組分的不 同宿主物種的數(shù)量，可使用一種或多種標(biāo)記，其中對(duì)于不同的宿主，采用不同的選擇條件。適宜的選擇標(biāo)記的具體、非限制性實(shí)例包括賦予針對(duì)下述物質(zhì)的抗性的基因博 來霉素、紅霉素、慶大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、萘啶酸、腐草霉素、草銨膦 (phosphinotricin)、壯觀霉素、鏈霉素、磺胺藥物、磺酰脲、氨芐青霉素/羧芐青霉素、氯霉 素、鏈霉素/壯觀霉素或四環(huán)素。適宜的選擇標(biāo)記的另一個(gè)實(shí)例是營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記基 因，諸如組氨酸選擇標(biāo)記基因。標(biāo)記的具體、非限制性實(shí)例包括但不限于，堿性磷酸酶(AP)、 myc、血凝素(HA)、13葡糖苷酸酶(GUS)、熒光素酶以及綠色熒光蛋白(GFP)。優(yōu)選，分離的 核酸還包含與編碼多肽的核酸偶聯(lián)的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記可以是氨芐青霉素/羧芐青霉素 抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、紅霉素抗性、鏈霉素/壯觀霉素抗性或組氨酸營養(yǎng)缺陷 型選擇標(biāo)記基因。本發(fā)明的另一方面涉及非編碼RNA、RNAi、反義核酸，其可以下調(diào)TBX2和/或TBX3 基因的表達(dá)。本發(fā)明的“RNAi分子”是一般術(shù)語，指雙鏈RNA分子，包括小干擾RNA(siRNA)、發(fā) 夾RNA (shRNA)以及在體內(nèi)切割成siRNA的其它RNA分子。RNAi分子可包含與靶核酸序列 相同或基本相同的雙鏈RNA(dsRNA)分子的長片段，或僅與靶核酸序列的一個(gè)區(qū)域相同或 基本相同的dsRNA短片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述RNAi是siRNA。分子通常以雙鏈合成，其中每條鏈長為19-30個(gè)核苷酸左右，優(yōu)選20-25個(gè)核苷酸。siRNA可以被理解為寡聚核酸酶復(fù)合體，并通 過與特異序列配對(duì)將所述復(fù)合體引導(dǎo)至靶mRNA，從而導(dǎo)致靶mRNA被蛋白復(fù)合體中的核酸 酶降解。在另一實(shí)施方案中，所述RNAi是shRNA。shRNA可以是外源性合成的，或可以在體 內(nèi)由RNA聚合酶III啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄形成。優(yōu)選地，所述RNAi分子或反義核酸針對(duì)TBX2和/或TBX3基因中與腫瘤相關(guān)的結(jié) 構(gòu)域。更優(yōu)選地，所述RNAi分子針對(duì)的結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明的多肽所抑制的TBX2和/或TBX3 基因結(jié)構(gòu)域相同。本發(fā)明的另一方面涉及所述的多肽、核酸分子、RNAi、反義核酸或載體(也稱為本 發(fā)明的化合物或活性化合物)在制備藥物、多肽藥物或藥物組合物中的用途，所述藥物、多 肽藥物或藥物組合物用于治療和/或預(yù)防個(gè)體的腫瘤，優(yōu)選惡性腫瘤或癌癥。所述的多肽、 核酸分子、RNAi、反義核酸或載體可以與脂質(zhì)體、賦形劑或藥用載體組方成藥物或藥物組合 物。本發(fā)明的另一方面涉及治療和/或預(yù)防個(gè)體的腫瘤，優(yōu)選惡性腫瘤或癌癥的方 法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體進(jìn)行有效量的所述多肽、核酸分子、RNAi、反義核酸、載體、多 肽藥物或組合物的給藥。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述腫瘤或癌癥選自肝癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、乳 腺癌、諸如骨肉瘤的肉瘤、白血病、卵巢癌、輸尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、多發(fā)性骨 髓瘤、胰腺癌、腎癌、內(nèi)分泌腺癌、皮膚癌、黑素瘤、血管瘤以及腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述癌癥是肝癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、肺癌。所述癌癥可以原發(fā)腫 瘤，也可以是轉(zhuǎn)移性癌癥。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述多肽藥物或藥物組合物能以適于對(duì)哺乳動(dòng)物個(gè)體， 例如人、猴子、豬、馬、牛、綿羊、狗、大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、貓等給藥的適當(dāng)形式，可單獨(dú)提 供本發(fā)明所述的活性化合物(例如，所述的多肽、核酸分子、RNAi、反義核酸或表達(dá)所述核 酸分子的載體)或與其它化合物(例如，核酸分子、小分子、多肽、肽或肽類似物)組合提 供。如果需要的話，可將本發(fā)明的活性化合物與多種傳統(tǒng)和現(xiàn)存的治療癌癥的藥物或手段 聯(lián)合使用，例如與化療藥物和/或放療聯(lián)合使用。在一實(shí)施方案中，與本發(fā)明的活性化合物聯(lián)合使用的抗癌試劑選自順鉬；卡鉬； 環(huán)磷酰胺；美法侖(左旋苯丙氨酸氮芥)；卡莫司??；氨甲蝶呤；5_氟尿嘧啶；阿糖胞苷； 巰基嘌呤；柔紅霉素；阿霉素；表阿霉素；長春花堿；長春新堿；放線菌素；絲裂霉素C ；紫 杉醇；左旋天冬酰胺酶；粒細(xì)胞集落刺激因子G-CSF ；依托泊甙；秋水仙素；甲磺酸；及喜樹 堿。可使用常規(guī)的制藥方法提供適合的藥物制劑或組合物從而對(duì)患有癌癥的個(gè)體，優(yōu) 選人，進(jìn)行所述化合物或所述藥物的給藥。可以采用任意適合的、例如非腸道的、靜脈的、皮 下的、肌肉的、顱內(nèi)的、眶內(nèi)的、眼的、心室內(nèi)的、囊內(nèi)的、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的、 氣霧劑或口服給藥方法。藥物制劑或配方可以是液體溶液或懸液；片劑或膠囊；粉末，滴鼻 劑或氣霧劑形式。制備所述制劑的方法是本領(lǐng)域公知的。適于非腸道給藥的配方可含有，例如，賦型 劑，滅菌水，或鹽水，諸如聚乙二醇的聚亞烷基二醇，植物來源的油，或氫化的萘。也可以采用生物匹配的、生物可降解的交酯聚合物、交酯/乙交酯聚合物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚 物來控制所述化合物的釋放。其它潛在的用于調(diào)節(jié)化合物非腸道傳遞的系統(tǒng)包括乙烯-醋 酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的灌注系統(tǒng)以及脂質(zhì)體。適于吸入的配方可包括賦 型劑，例如乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂酸酯、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶 液，或可以是以滴鼻劑形式給藥的油狀溶液或作為凝膠。對(duì)治療性或預(yù)防性組合物而言，可 以足以中止或延緩腫瘤細(xì)胞增殖的量對(duì)個(gè)體給藥所述化合物。本發(fā)明所用術(shù)語“有效量”包括治療有效量或預(yù)防有效量。“治療或預(yù)防有效量” 是指在劑量上的有效量，并且在必需的時(shí)間階段內(nèi)，達(dá)到所需要的治療或預(yù)防結(jié)果。在通常 情況下，短語“治療有效量”是足以實(shí)現(xiàn)期望反應(yīng)或改善例如轉(zhuǎn)移或原發(fā)腫瘤進(jìn)展、大小或 生長的癥狀或指征的量。針對(duì)特定個(gè)體的治療有效量可以根據(jù)例如接受治療個(gè)體的疾病狀 態(tài)、整體健康狀況、給藥方法、途徑和劑量以及副作用的嚴(yán)重程度等因素變化。當(dāng)在組合中 時(shí)，治療有效量是相對(duì)組分組合的比例且效果不限于單一組分。本發(fā)明的核酸分子、多肽、反義核酸、RNAi、藥物或藥物組合物的治療有效量通常 能夠改善癌癥癥狀至少約10%;通常至少約20%;優(yōu)選至少約30%;或更優(yōu)選至少約50%。 癌癥轉(zhuǎn)移的抑制指腫瘤細(xì)胞的遷移或轉(zhuǎn)移受到影響或抑制。這將導(dǎo)致例如受影響細(xì)胞數(shù)目 的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的或可定量的變化，例如，在一段時(shí)間內(nèi)或靶區(qū)域內(nèi)受影響的靶細(xì)胞數(shù)目的 減少。還可以監(jiān)測(cè)原發(fā)腫瘤進(jìn)展的速度、大小、擴(kuò)散或生長。本發(fā)明活性成分或化合物的優(yōu)選治療或預(yù)防有效量范圍可以是0. InM-O. 1M、 0. InM-O. 05Μ、0. 5ηΜ_15 μ Μ、ΙηΜ-10 μ M 或 IOnM-I μ M 以及其中的任意整數(shù)。以下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施方案，但在任何意義上都不應(yīng)理解為對(duì)其 范圍的限定。實(shí)施例實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建在表達(dá)載體pET28a(NOVagen，Inc.)基礎(chǔ)上，插入便于免疫組化實(shí)驗(yàn)的HA標(biāo)簽以 及便于表達(dá)的多肽穿過細(xì)胞膜的TAT信號(hào)肽。首先設(shè)計(jì)一連接片段。為產(chǎn)生該連接片段，先合成4組寡核苷酸，然后以首尾相連 方式連接(連接方式參見圖2)。具體的連接步驟包括按等比例混合4組寡核苷酸鏈，1.TATGTATCCATATGACGTCCCAGAC(SEQ ID NO 7)2. TATGCCGGCGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAG(SEQ ID NO 8)3. GATCCTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTC(SEQ ID NO 9)4. TTCCTGCCGCCGGCATAGTCTGGGACGTCATATGGATACA(SEQ ID NO 10)；95°C變性lOmin，然后經(jīng)過6小時(shí)緩慢冷卻至室溫，最后形成帶有兩個(gè)限制性酶切 位點(diǎn)(NdeI和BamHI)的兩端均為粘末端的雙鏈接頭正向序列5' -tatgtatcca tatgacgtcc cagactatgc cggcggcagg aagaagcggagacagcgacg aagag-3，(SEQ ID NO 13)反向序列5 ‘ -gatcctcttc gtcgctgtct ccgcttcttc ctgccgccgg catagtctgg gacgtcatatggataca-3‘ (SEQ ID NO: 14)。
該雙鏈接頭，與經(jīng)NdeI和BamHI酶切后pET28a載體連接，命名為pET28a_TAT (參 見圖1)。為了克隆來自TBX2和TBX3的基因片段，根據(jù)所公開的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)首先制備PCR引物5，-CGCGGATCCCTGTTCCCTTACCCCTAC-3，(SEQ ID NO 11)5，-CCGCTCGAGTTAGCGCAGCCGCGGGCGCAT-3，(SEQ IDNO 12)然后，利用已有的TBX3或TBX2的cDNA(SEQ ID NO 3和SEQID NO 4)做為模板， 進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出141bp的產(chǎn)物(SEQ IDNO 15)。經(jīng)BamHI和XhoI酶切消化所擴(kuò)增的 片段和載體，將酶切、純化后的片段(SEQ ID NO 16)插入載體(參見圖3)，形成重組表達(dá) 載體，命名為pET28a-TAT-TAP21。根據(jù)該載體欲表達(dá)的核酸序列，其產(chǎn)生的多肽預(yù)計(jì)有83 個(gè)氨基酸，分子量為9kDa。擴(kuò)增的片段序列如下5 ’ CGCGGATCCCTGTTCCCTTACCCCTACACGTACATGGCCGCAGCGGCGGCCGCCTCCTCTGCGGC AGCCTCCAGCTCGGTGCACCGCCACCCCTTCCTCAATCTGAACACCATGCGCCCGCGGCTGCGCTAACTCGAGCG G3，(SEQ ID NO 15)酶切后片段如下5，GATCCCTGTTCCCTTACCCCTACACGTACATGGCCGCAGCGGCGGCCGCCTCCTCTGCGGCAGCCTC CAGCTCGGTGCACCGCCACCCCTTCCTCAATCTGAACACCATGCGCCCGCGGCTGCGCTAAC3' (SEQ ID NO 16)實(shí)施例2在大腸桿菌中表達(dá)重組多肽TAP21將表達(dá)載體pET28a-TAT-TAP21導(dǎo)入大腸桿菌BL-21 (DE3)，以3L體積培養(yǎng)所述的 轉(zhuǎn)化體，來表達(dá)多肽TAP21并且獲得內(nèi)涵體。將所獲得的內(nèi)涵體溶解于50毫升的裂解緩 沖液(8M尿素，20mMNaH2P04，500mM NaCl)，離心獲得上清液。然后，利用Ni柱(Qiagen)和 PDlO柱(GE)的層析純化His標(biāo)簽的多肽TAP21 (參見圖4)。Coomassie blue染色表明該 多肽分子量約為9kDa，純度約為95% (參見圖5)。實(shí)施例3多肽TAP21的抑制腫瘤細(xì)胞生長在體外檢測(cè)多肽TAP21的生物活性。采用MTT (USB)檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，先 將3X103肝腫瘤細(xì)胞BEL7404和H印G2 (ATCC)接種到96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)一天后，加入不同濃 度(具體濃度如圖6A和6B所示)的TAP21多肽以及失活突變的TAP21 (TAPm, SEQ IDNO 17)，并以PBS作為對(duì)照(control)。一天后，在待測(cè)孔內(nèi)加入MTT，選擇490nm波長檢測(cè)吸 光值，記錄結(jié)果。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果如圖6A和6B 所示。在另一實(shí)驗(yàn)中，每天更換含有20 μ M多肽(TAP21和TAPm)的培養(yǎng)液，并以PBS作為 對(duì)照，培養(yǎng)3天。期間，每天在待測(cè)孔內(nèi)加入ΜΤΤ，選擇490nm波長檢測(cè)吸光值，記錄結(jié)果。 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果如圖6C和6D所示。從圖6A-6D 可見，與對(duì)照組比較，變化的水平是明顯的(BEL7404p < 0. 001 ；HepG2p < 0. 0005)。這些 結(jié)果證明，TAP21對(duì)BEL7404和H印G2腫瘤細(xì)胞增殖有強(qiáng)烈的劑量和時(shí)間依賴性的抑制效 果。根據(jù)同樣的實(shí)驗(yàn)方法，在腸癌細(xì)胞(DLD-1，SW620)上也做了檢測(cè)，都獲得了相同的抑制 腫瘤細(xì)胞的效果。Annexin V-FITC(Invitrogen)細(xì)胞凋亡檢測(cè)法，是用來檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)在細(xì) 胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種檢測(cè)方法。方法如下將上述腫瘤細(xì)胞接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)一天后，加入10 μ ΜΤΑΡ21培養(yǎng)6小時(shí)后，用胰酶處理，收集細(xì)胞，PBS清洗一次， 將細(xì)胞與Armexin V-FITC，PI溫浴15min，然后用流式細(xì)胞儀分析。以H印G2為例，TAP21 處理組與相同濃度的TARii對(duì)照組數(shù)據(jù)是55%與10% (圖7A)。BEL7404的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 7B所示。其它腫瘤細(xì)胞也觀察到了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)證明，TAP21能有效促進(jìn)腫 瘤細(xì)胞的凋亡。在體內(nèi)評(píng)估TAP21的生物活性。即在N0D/SCID小鼠(CUHKLASEC)背部皮下注射 2xl06腫瘤細(xì)胞BEL7404，共十二只小鼠，隨機(jī)分為兩組，一組為對(duì)照組，注射PBS ；—組為治 療組，注射TAP21。當(dāng)腫瘤體積為50mm3左右，開始在腫瘤部位原位注射多肽或PBS，持續(xù)10 天，每天注射IOOyg TAP21或等體積PBS。10天后，停止注射后，繼續(xù)測(cè)量10天。其中每 間隔3天測(cè)量腫瘤大小，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，體積為縱坐標(biāo)繪制腫瘤生長曲線。治 療20天后，取出腫瘤組織，稱重，記錄結(jié)果。從圖8可見，與對(duì)照組相比，注射TAP21組小鼠， 腫瘤的體積、重量明顯減小，變化水平是明顯的(P < 3. 3X10_5)。其它腫瘤細(xì)胞在體實(shí)驗(yàn)也 觀察到了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。正如以上實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供編碼TBX2和TBX3基因中與腫瘤相關(guān)的一段結(jié)構(gòu) 域，和由此獲得的多肽。該多肽TAP21有83個(gè)氨基酸，分子量為9kDa。在大腸桿菌成功地 表達(dá)了所述的多肽，并且發(fā)現(xiàn)表達(dá)的多肽能有效地抑制腫瘤細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖。因 此，確定可以利用多肽TAP21作為有效的抗腫瘤藥物。實(shí)施例4通過等點(diǎn)突變的方法制備SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19，并用SEQ ID NO: 18或 SEQ ID N0:19代替TAP21，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，也獲得的類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以任意組合上文所述的各種實(shí)施方案，以便提供其 它的實(shí)施方案。而且，在不違背本發(fā)明精神的前提下，可對(duì)上述實(shí)施方案的元素、步驟、特征 做出適當(dāng)?shù)男薷暮吞鎿Q，獲得其等同的實(shí)施方案。參考文獻(xiàn)1.Carmona etal.,2005, Natural resistance-associated mutations to Enfuvirtide (T20)and polymorphisms in the gp41 region of different HIV-I genetic forms from T20 naivepatients. J Clin Virol 32,248-253.2.Bo-Jian Zheng, Yi Guan, Ming-Liang He, Hongzhe Sun, Lanying Du, YingZheng, Kin-Ling Wong, Honglin Chen, Ying Chen, Linyu Lu,Julian A Tanner, Rory MWatt, Neri Niccolai, Andrea Bernini, Ottavia Spiga, Patrick CY Woo, Hsiang-fu Kung, Kwok-Yung Yuen, Jian-Dong Huang(2005)Synthetic peptides outside the spikeprotein hepted repeat regions as potent inhibitors of SARS—associated coronavirus. AtiviralTherapy 10 :375-385.3. Fan etal. ,2004, TBX3 and its isoform TBX3+2a are functionally distinctive ininhibition of senescence and are overexpressed in a subset of breast cancer cell lines. Cancer Res. 2004 Aug 1 ；64(15) :5132-9.4. Vance etal. ,2005, Tbx2 is overexpressed and plays an important role inmaintaining proliferation and suppression of senescence in melanomas. Cancer Res. 2005Mar 15 ；65 (6) :2260-8.
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<213>DNA fragment
<400>8
tatgccggcg gcaggaagaa gcggagacag cgacgaagag
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>DNA fragment
<400>9
gatcctcttc gtcgctgtct ccgcttc27
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>DNA fragment
<400>10
ttcctgccgc cggcatagtc tgggacgtca tatggataca40
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>forward primer
<400>11
cgcggatccc tgttccctta cccctac27
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>reverse primer
<400>12
ccgctcgagt tagcgcagcc gcgggcgcat30
<210>13
<211>65
<212>DNA
<213>DNA fragment
<400>13
tatgtatcca tatgacgtcc cagactatgc cggcggcagg aagaagcgga gacagcgacg60
aagag65
<210>14
<211>67
<212>DNA
<213>DNA fragment
<400>14
gatcctcttc gtcgctgtct ccgcttcttc ctgccgccgg catagtctgg gacgtcatat60
ggataca67
<210>15
<211>141
<212>DNA
<213>amplified fragment
<400>15
cgcggatccc tgttccctta cccctacacg tacatggccg cagcggcggc cgcctcctct60
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其包含SEQID NO :1所示的核苷酸序列或在嚴(yán)緊雜交條件下與 SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核酸序列，所述核酸分子編碼具有抑制腫瘤活性的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述核酸分子，其由SEQID NO :1所示的核酸序列組成。
3.由權(quán)利要求1或2所述的核酸分子編碼的具有抗腫瘤活性的多肽。
4.具有抗腫瘤活性的多肽，其包含SEQID NO :2所示的氨基酸序列或其具體相同功能 的變體或衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其中所述多肽由SEQID NO :2所示的氨基酸序列組成。
6.重組載體，其包含載體和與其可操作連接的權(quán)利要求1或2所述的核酸分子。
7.如權(quán)利要求6所述的重組載體，其中所述載體是表達(dá)載體。
8.如權(quán)利要求6或7所述的載體，其中所述核酸分子與選自pET、pBR322、pACYC177、 pKT230、pGVl 106、pLAFRU pME290, pHV14、pBD9、pIJ61、pUC6、噬菌體 X、Yip5、YCpl9、腺病 毒、慢病毒或牛乳頭瘤病毒的載體可操作連接。
9.用權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。
13.治療腫瘤的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1或2所述的核酸分子、權(quán)利要求3-5任 一項(xiàng)所述的多肽、或者權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的載體，以及賦形劑。
14.權(quán)利要求1或2所述核酸分子、權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述多肽、或者權(quán)利要求6-8 中任一項(xiàng)所述載體在制備治療個(gè)體腫瘤的藥物中的用途。
15.如權(quán)利要求1或2所述核酸分子、權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述多肽、權(quán)利要求6-8 中任一項(xiàng)所述載體、權(quán)利要求13所述組合物、或者權(quán)利要求14所述的用途，其中所述腫瘤 選自肝癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肉瘤、白血病、卵巢癌、輸尿管癌、膀胱癌、前 列腺癌、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌、腎癌、內(nèi)分泌腺癌、皮膚癌、黑素瘤、血管瘤以及腦 或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗腫瘤的多肽或其衍生物以及編碼該多肽或其衍生物的分離的核酸分子。該多肽的核酸序列來自多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的TBX2和TBX3的cDNA片段。本發(fā)明還提供用表達(dá)載體來產(chǎn)生所述多肽的方法，以及所述的核酸分子、多肽以及載體在抑制腫瘤或阻斷腫瘤細(xì)胞增殖中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102140473SQ201010110980
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者何明亮, 孔祥復(fù), 董琦, 陳纓 申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)