專利名稱：重組人干擾素βla基因、其表達(dá)載體和重組人干擾素βla的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說涉及一種用DNA重組技術(shù)合成的人干 擾素β la、其表達(dá)載體、在CHO細(xì)胞中高效表達(dá)及其蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
干擾素(interferon，IFN)是1957年英國科學(xué)家Isaacs和Lindenmann在研究病 毒干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)的一類分泌性蛋白，具有抗病毒活性、激活自然殺傷細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞 增殖及免疫調(diào)節(jié)等作用，是臨床上廣泛應(yīng)用的生物制劑。天然IFN按動(dòng)物來源分類可分為人干擾素(HuIFN)、牛干擾素(BovIFN)等，按IFN 的分子結(jié)構(gòu)、抗原特異性和細(xì)胞來源可分成不同的型別。根據(jù)人不同細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素 分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差別，將白細(xì)胞干擾素、成纖維細(xì)胞干擾素和免疫干擾素分別命名為 IFN- α、IFN- β 禾口 IFN_ γ。人干擾素β分子含166個(gè)氨基酸，在80位氨基酸有一個(gè)N-糖基位點(diǎn)，天然干擾 素β分子量為23kDa，含有3個(gè)半胱氨酸，分別在17、31和141位氨基酸。31與141位半 胱氨酸之間形成的分子內(nèi)二硫鍵對于IFN-β生物學(xué)活性非常很重，141Cys被Tyr替代后則 完全喪失抗病毒作用，而Cysl7被Ser替代后不僅不影響生物學(xué)活性，反而是使IFN-β分 子穩(wěn)定性更好。糖基對生物學(xué)活性無影響。IFN-β的生物學(xué)作用有較強(qiáng)的種屬特異性。由于天然干擾素需要從人體分離純化獲得，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，為臨床研究和應(yīng)用帶來很 大的局限性，國內(nèi)外均已利用基因工程技術(shù)在外源基因表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)、生產(chǎn)重組人IFN， 并投入抗病毒和腫瘤治療的臨床研究。重組IFN-β有大腸桿菌、酵母和中國倉鼠卵巢成纖維(CHO)細(xì)胞三種表達(dá)體系。 哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞體系表達(dá)重組藥物具有活性高、半衰期長、蛋白質(zhì)可以正確折疊等優(yōu)點(diǎn)， 有極大的開發(fā)利用價(jià)值。目前FDA批準(zhǔn)的重組干擾素蛋白藥物有70%為真核細(xì)胞生產(chǎn)的， 而同類國內(nèi)產(chǎn)品均為大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)。申請日為1985年7月31日的美國專利US4966843公開了一種質(zhì)粒表達(dá)載體以及 通過該質(zhì)粒表達(dá)載體在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)人干擾素β的方法，但該方法生產(chǎn)的人干擾素β 蛋白的活性較低。因此開發(fā)一種穩(wěn)定的能夠高效表達(dá)干擾素β的真核細(xì)胞表達(dá)體系，并使表達(dá)量 達(dá)到生產(chǎn)應(yīng)用的先進(jìn)水平，不但可以鞏固國內(nèi)市場，還可進(jìn)一步開拓國際市場，對于提高產(chǎn) 品質(zhì)量、廣泛地治療人類的疾病具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種重組人干擾素β Ia基因，建立可在CHO細(xì)胞中穩(wěn) 定、高效表達(dá)人干擾素β Ia的方法，為工業(yè)化生產(chǎn)人干擾素3 1a，提高產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效 率，改善人類健康奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
通過因特網(wǎng)上的NCBI genebank檢索得到β Ia的cDNA全基因序列，為了提高表達(dá) 后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，本發(fā)明對其進(jìn)行修飾，合成引物后經(jīng)PCR擴(kuò)增得到重組人干擾素β Ia 基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1(圖1)所示。本發(fā)明另一個(gè)目的提供含有上述重組人干擾素β Ia基因的質(zhì)粒表達(dá)載體，使用 了質(zhì)粒pSV2-dhfr，其帶有Bam H I、Eco RI酶切位點(diǎn)，將經(jīng)Bam H I、EcoRI雙酶切后的重 組人干擾素β Ia基因與所述質(zhì)粒連接，形成本發(fā)明的質(zhì)粒載體。本發(fā)明的質(zhì)粒載體具有如 圖5所示結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供包含上述質(zhì)粒表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，將所述質(zhì)粒載 體轉(zhuǎn)入CHO-DHFR-細(xì)胞，構(gòu)建了基于真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了在CHO細(xì)胞表達(dá)體系中生產(chǎn)所述重組人干擾素β Ia蛋白的方法， 包括以下步驟(1)根據(jù)人干擾素β Ia的核苷酸序列合成重組人干擾素β Ia基因；(2)將重組人干擾素β Ia基因連接到質(zhì)粒載體pSV2_dhfr中，構(gòu)建含有所述重組 人干擾素β Ia基因的質(zhì)粒表達(dá)載體；(3)將所述質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CHO-DHFR-細(xì)胞，構(gòu)建基于真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)；(4)在所述基于真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組人干擾素β Ia蛋白；(5)分離并純化所述重組人干擾素β Ia蛋白。其中，所述步驟(2)中質(zhì)粒載體pSV2_dhfr先經(jīng)磷酸化處理，通過BamHI和EcoR I 雙酶切將重組人干擾素β Ia基因與質(zhì)粒pSV2-dhfr連接。步驟(3)中，所述表達(dá)載體通過 內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理，所述內(nèi)切酶為Nde I和EcoR I，優(yōu)選使用EcoR I。步驟(4)是在氨甲基蝶呤(MTX)的存在下進(jìn)行，并且優(yōu)選的MTX濃度為1 X 10_7至 2Xl(T7mol/l 之間。步驟(4)首先采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式，培養(yǎng)周期為12-24天，每3天換液一次，優(yōu)選的 血清用量在上轉(zhuǎn)瓶時(shí)和第一次換液時(shí)為10%，第二次、第三次換液為5%，以后均為3% ；優(yōu) 選的PH為7. 1-7. 4，溫度為37-38. 5°C ；接著可采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式，優(yōu)選采用灌流培 養(yǎng)，培養(yǎng)周期為20-60天，優(yōu)選20-45天，接種濃度為0. 5X105 5X105Cells/ml，灌流速 度為0. 74L/天-5. 55L/天，攪拌速度為140轉(zhuǎn)/分鐘。步驟(5)中，進(jìn)一步包括如下步驟a)將細(xì)胞培養(yǎng)液離心，超濾濃縮，得到超濾產(chǎn)品；b)將超濾產(chǎn)品經(jīng)藍(lán)標(biāo)親和層析分離，得到層析樣品，洗脫液為含2mol/LNaCl和 60%乙二醇的Tris-HCl緩沖液；c)將上述層析樣品脫鹽，得到脫鹽產(chǎn)品，洗脫液為20mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩 沖液；d)將脫鹽產(chǎn)品經(jīng)CM離子交換層析分離，洗脫液為含0 lmol/LNaCl的檸檬酸-檸 檬酸鈉緩沖液，得到最終蛋白產(chǎn)品。通過本發(fā)明上述方法分離純化得到的最終蛋白產(chǎn)品，其純度達(dá)到96%以上，蛋白 比活為 1. 62X 108IU/mg。本發(fā)明的有益效果是(1)合成經(jīng)修飾的人干擾素β Ia基因，并大量擴(kuò)增，將該干擾素β Ia基因連入合適的載體，完成工程載體的構(gòu)建，使人干擾素β Ia基因在CHO細(xì)胞中成功表達(dá)；(2)將高表達(dá)水平的CHO細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶放大培養(yǎng)，優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)條件，進(jìn)一步在 生物反應(yīng)器上用微載體連續(xù)流培養(yǎng)，對各種培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使細(xì)胞表達(dá)干擾素的水 平達(dá)到了工業(yè)生產(chǎn)的要求；(3)設(shè)計(jì)和優(yōu)化了從細(xì)胞培養(yǎng)液純化干擾素的工藝，確定了簡便的純化工藝，獲得 高的回收率和較好的純化效果。


圖1顯示本發(fā)明重組的干擾素β Ia基因序列；圖2顯示重組人干擾素β Ia的質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建流程；圖3顯示PSV2_dhfr質(zhì)粒圖；圖4顯示PSV2_dhfr過Bam HI和Eco RI酶切后的質(zhì)粒圖；圖5顯示PSV2_dhfr經(jīng)Bam HI和Eco RI酶切后與IFN- β Ia的連接圖；圖6Α和6Β顯示MTX濃度對重組人干擾素表達(dá)的影響；圖7顯示轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞的重組人干擾素β Ia表達(dá)水平的穩(wěn)定性；圖8顯示轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)第3天、12天、18天、24天和30天細(xì)胞的生長狀況和干擾素表 達(dá)情況；圖9顯示批次培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)對CHO細(xì)胞生長的影響；圖10顯示不同的細(xì)胞接種密度對CHO細(xì)胞生長的影響；圖11顯示培養(yǎng)CHO細(xì)胞分泌干擾素β Ia中罐流速度和葡萄糖濃度的比較；圖12顯示培養(yǎng)期間取樣進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)和蛋白活性分析的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)曲線；圖13顯示灌流培養(yǎng)過程中攪拌速度和溶解氧的關(guān)系；圖14顯示灌流培養(yǎng)過程中攪拌速度、灌流量與干擾素β Ia表達(dá)的關(guān)系；圖15顯示藍(lán)標(biāo)親和層析中洗脫緩沖液對分離效果的影響；圖16顯示藍(lán)標(biāo)色譜層析樣品SDS電泳圖，其中1為蛋白質(zhì)標(biāo)記，2為細(xì)胞培養(yǎng)液， 3為超濾液，4為藍(lán)標(biāo)色譜層析樣品；圖17顯示CM離子交換層析色譜圖；圖18顯示CM親和層析樣品SDS電泳圖，其中1為蛋白質(zhì)標(biāo)記，2為細(xì)胞培養(yǎng)液，3 為超濾液，4為CM離子交換色譜樣品；圖19顯示Quantity One I-D分析圖，其中A為藍(lán)標(biāo)純化樣品，B為CM柱純化樣
P
ΡΠ O
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1-4描述工程質(zhì)粒psv2-dhfr-IFN- β Ia的構(gòu)建材料菌株大腸桿菌JM109，購于上海超研生物科技有限公司；載體PUC57，南京金斯瑞 生物科技有限公司；psv2-dhfr購自ATCC。主要試劑限制性內(nèi)切酶EcoR I，Bam HI購自東洋紡生物技術(shù)有限公司。Taq DNA聚合酶， Pfu DNA聚合酶，超純dNTPs，DNA Marker DL2000, AHind III購自北京鼎國生物技術(shù)有限
5公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。氨芐青霉素購自Sigma公司。感受態(tài)細(xì)胞， 大量質(zhì)粒提取試劑盒，DNA純化、回收試劑盒、堿性磷酸酶購自Takara Biotech公司。瓊脂糖電泳緩沖液50xTAE :242g Tris，57. Iml 冰乙酸，18. 6g EDTA0 EB 溶液 IOOml無菌水中溶入Ig溴化乙錠。DNA載樣液0. 25%溴酚藍(lán)，0. 25%二甲苯青，50%甘油。LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOgo LB固體培養(yǎng)基在LB液 體培養(yǎng)基中加入1. 5%的瓊脂粉，高壓滅菌，鋪平板后4°C保存。2YT液體培養(yǎng)基1. 6% 胰蛋白胨，酵母抽提物，0.5%NaCl，用蒸餾水配置，pH = 7.0。TE緩沖液10ml Tris-HCl(ρΗ7· 6)，ImM EDTA。用于小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解緩沖液溶液I :50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris · HCl (ρΗ8· 0)，10mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)， 在6. 895 X IO4Pa高壓下蒸氣滅菌15min后，保存于4°C ；溶液II 0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS ；溶液III :5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml，所配溶液中鉀濃度為 3mol/L,乙酸濃度為5mol/L。 實(shí)施例1干擾素β Ia基因的PCR擴(kuò)增1、目的基因的獲得通過因特網(wǎng)上的NCBI genebank檢索得到干擾素β Ia的cDNA全基因序列，為了 提高表達(dá)后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，本發(fā)明將干擾素β Ia的17位半胱氨酸進(jìn)行了修飾，得到重組 人干擾素β Ia基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。將重組干擾素β Ia基因克隆到載體PUC57，受體菌為大腸桿菌DH5 α菌株。培養(yǎng) 含有IFN-β Ia基因的大腸桿菌DH5 α菌株，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取出pUC57_IFN_i3 Ia02、質(zhì)粒DNA的小量制備(1)將菌培養(yǎng)物倒入1. 5ml微量離心管中，用微量離心機(jī)12，OOOrpm離心30s，倒
盡培養(yǎng)液；(2)用400 μ 1 TE溶液重懸、洗滌沉淀后，12000rpm離心30s，倒盡上清液；將細(xì)菌 沉淀重懸于90μ 1用冰預(yù)冷的溶液I中，將菌體混勻，使菌體在溶液I中完全分散，然后加 入10 μ 1的50mg/ml溶菌酶溶液，混勻，在4°C放置1小時(shí)；(3)加入200 μ 1新配置的溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管數(shù)次，以混合內(nèi)容 物，確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液II接觸，將離心管放置于冰上5min ；(4)加150 μ 1用冰預(yù)冷的溶液III，蓋緊管口，將管倒置后溫和振蕩10s，將管置于 冰上3-5min，12，OOOrpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中；(5)加入等量的酚氯仿異戊醇，振蕩混勻，12000rpm離心幾分鐘，將上清液移 到另一離心管中；(6)用2倍體積的乙醇于室溫沉淀雙鏈DNA，然后12000rpm離心5min，倒去上清 后，用70%乙醇洗滌DNA沉淀后，將離心管倒置于一張吸水濾紙上，吸盡殘液，使核酸沉淀 干燥，然后保存，或用TE緩沖液重新溶解后，貯存于-20°C冰箱。3、引物設(shè)計(jì)根據(jù)公司保存的原核表達(dá)載體序列和保存資料中的基因序列，以及目標(biāo)載體中的 酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)了高選擇性引物，設(shè)計(jì)軟件采用Primer Premier 5。
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上游引物AgTCgA TAT ggA TCC ATg AgC TAC AAC TTg CTT g下游引物CCTACA Cgg AAT TCT TCA gTT TCg gAg gTA ACC Tg4、目的基因的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系人工合成的人干擾素β基因 Ιμ PCR 緩沖液10 μ 1dNTP4 μ 1上游引物Ιμ 下游引物Ιμ Tag DNA 聚合酶1 μ 1Pfu 聚合酶1 μ 1重蒸水81 μ 1_Total100 μ 1反應(yīng)條件如下:l)94°C,3min；2)94°C,45s ；3)45-50°C,45s ；4)72°C,45s ；5)72°C, IOmin0 2)-4)步驟循環(huán)36次。反應(yīng)完成后，采用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。實(shí)施例2 PCR產(chǎn)物的凝膠回收和雙酶切用TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，對目的基因進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。在紫外燈下切 出含有目的基因的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。為了加快之后進(jìn)行的膠塊融 化，將碎膠塊，稱得膠塊重量共0. 63g，管A為0. 32g，管B為0. 31g，分別向管A和B加入膠 塊融化液DR-I Buffer 960 μ 1和930 μ 1，均勻混合后于75°C加熱融化膠塊。向上述膠塊 融化液中加入DR-I Buffer量的1/2體積量的DR-II Buffer，制得均勻混合的溶液。將試 劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，并將上述均勻混合的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column, 12000rpm 離心 IOmin,棄濾液。然后加入 500 μ 1 RinseA, 12000rpm 離心 30s,棄濾 液，并重復(fù)操作一次。將Spin Column安置于新的1. 5ml的離心管上，在SpinColumn膜的 中央處加入25 μ 1的滅菌蒸餾水，室溫靜置lmin，12000rpm離心，Imin洗脫DNA。雙酶切反應(yīng)條件Buffer H2 μ 1DNA5 μ 1EcoR I0· 5 μ 1BamH I0. 5 μ 1超純水12 μ 1_Total20 μ 1 酶切產(chǎn)物的回收和純化通過Gel Extraction Kit回收目的基因片段。將100 μ 1 PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳，切下含有目的基因的瓊脂糖凝膠塊，稱重后加入3倍 體積的Binding Buffer緩沖液(lg凝膠相當(dāng)于Iml BindingBuffer)，在60°C水浴中溶解 凝膠塊，等完全溶解后將凝膠加入到DNA結(jié)合柱上，每個(gè)柱子加入800 μ 1液體，IOOOOrpm離 心lmin，將流出液再掛一次柱子以提高回收率，再IOOOOrpm離心lmin，棄廢液。用700 μ 1
7洗滌緩沖液洗柱子，IOOOOrpm離心lmin，再重復(fù)洗一次。將空DNA結(jié)合柱子離心lmin，棄廢 液，換上新Eppendorf管，用30 μ 1無菌重蒸水或TE Buffer在IOOOOrpm下離心Imin洗脫 DNA, DNA溶液在-20°C冰箱保存并測序。實(shí)施例3 psv2-dhfr質(zhì)粒的擴(kuò)增、雙酶切以及磷酸化1、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備2YT培養(yǎng)基的配制胰酶蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，溶于IL水中，高 溫滅菌備用。鋪平板和細(xì)菌擴(kuò)增將甘油保藏的菌種200 μ 1接種于裝有IOml LB培養(yǎng)液的 50ml試管中于37°C振蕩(250rpm)培養(yǎng)過夜；向兩個(gè)內(nèi)裝200ml LB培養(yǎng)液的IL三角瓶中 各加入4ml過夜培養(yǎng)細(xì)胞，于37°C下振蕩培養(yǎng)至光密度(0D600)值介于0. 5-0. 6之間(約 需l-2h)；將每份細(xì)胞培養(yǎng)物分別倒入一個(gè)預(yù)先冰浴的無菌250ml離心瓶并置于冰上保持 20min，于4°C下8000rpm離心lOmin，棄上清；將每份沉淀輕緩地懸于IOOml冰冷的0. Imol/ L MgCl2 (pH 7.2)溶液中，按上述方法再次離心；去上清，并將每一沉淀輕緩地懸浮于20ml 冰冷的含20%甘油的0. lmol/L CaCl2(pH7. 2)溶液中；每管Iml分裝于40個(gè)1. 5ml Ep管 中，-80°C冷凍貯存?zhèn)溆谩?、psv2-dhfr 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將200 μ 1 Ep管放在_20°C冰箱中預(yù)冷。從_80°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，立即放 入冰中。細(xì)胞融化后，取100 μ 1放入預(yù)冷的Ep管中，在冰上放置IOmin ；加入1 μ 1酶切產(chǎn) 物，在冰上冷卻30min，將混合物在42°C熱休克30s (勿搖晃)后立即放到冰浴中冷卻2min， 加入800μ1 SOC培養(yǎng)基37°C下振蕩培養(yǎng)lh，涂平板。每個(gè)平板首先涂布20 40 μ 1 500Χ 氨芐青霉素，放在通風(fēng)櫥中風(fēng)干。然后分別取10μ 1、100μ 1、250μ 1和640μ 1的培養(yǎng)液涂 布于平板上。風(fēng)干后倒置于培養(yǎng)箱中37°C過夜培養(yǎng)。3、質(zhì)粒的提取大腸桿菌的培養(yǎng)從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至l_4ml的含有抗生素的液體 培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。取l_4ml的過夜培養(yǎng)菌液，12000rpm離心2min，棄上清。用250 μ 1 的溶液I (含RnaseA)充分懸浮細(xì)菌沉淀，加入250 μ 1的溶液II輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5_6 次，使菌體充分裂解，形成透明溶液；加入400μ 1的4°C預(yù)冷的溶液III，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合 5-6次，直至形成緊實(shí)凝集塊，然后室溫靜置2min ；室溫12000rpm離心lOmin，取上清液；將 試劑盒的Spin Column安置于Collection Tube上；將上述上清液轉(zhuǎn)移至Spin Column中， 12000rpm 離心 30s，棄濾液。將 500 μ 1 RinseA 加入 Spin Column 中，12000rpm 離心 30s， 棄濾液。將700μ1 RinseB加入Spin Column中，12000rpm離心30s，棄濾液，重復(fù)操作一 次。將Spin Column安置于新的1. 5ml的離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入60 μ 1 滅菌蒸餾水或析出緩沖液(Elution Buffer)，室溫靜置lmin，12000rpm離心lmin洗脫。4、質(zhì)粒的酶切將轉(zhuǎn)化后的單克隆菌落放大培養(yǎng)后按照質(zhì)粒提取的方法提取出pSV2-dhfr，并通 過瓊脂糖凝膠電泳純化回收。在與雙酶切目的基因同樣條件下用Eco RI和Bam H I酶切 后再純化回收。質(zhì)粒的單酶切反應(yīng)體系Buffer K 2μ 1Buffer H 2μ 1
DNA5μ 1Bam H I 0. 5 μ 1超純水12. 5μ1_Total20 μ 1質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)體系Buffer H 2μ 1DNA5μ 1EcoRI0. 5μ 1Bam H I0. 5 μ 1超純水12 μ 1_Total20 μ 137°C恒溫反應(yīng)1. 5h后，用瓊脂糖凝膠進(jìn)行膠回收。5、質(zhì)粒的磷酸化質(zhì)粒的磷酸化可以去除載體DNA片段的5’ -末端的磷酸基，為了避免質(zhì)粒的自連 接，必須進(jìn)行磷酸化處理。磷酸化反應(yīng)體系DNA 片段l-20pmolIOX堿性磷酸酶緩沖液5μ1CIAP(10-30V/y 1)1-2 μ 1dH20定容至 50 μ 1磷酸化步驟在微量離心管中配制上述反應(yīng)液，全量定容至50μ 1，37°C或50°C反 應(yīng)30min，用苯酚/氯仿/異戍醇(25 24 1)抽提2次，氯仿/異戍醇(24 1)抽提1 次，加入5μ 1 3Μ的NaoAC，加入125 μ 1(2. 5倍量)冷乙醇，在_20°C下保冷30_60min，離心 分離回收沉淀，用200μ 1 70%冷乙醇洗凈后，減壓干燥，用20μ IWTWTE Buffer溶解沉淀。實(shí)施例4人干擾素β Ia基因與pSV2_dhfr載體的連接、轉(zhuǎn)化與鑒定1、連接與轉(zhuǎn)化采用連接試劑盒連接雙酶切后的目的基因IFN-β Ia與載體pSV2_dhfr質(zhì)粒。將 IFN-β Ia溶解液7μ l，psv2-dhfr質(zhì)粒溶解液3μ 1，加入溶液I 10 μ 1，總共20 μ 1，16°C下 連接lh。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，將200μ 1 Ep管放在-20°C冰箱中預(yù)冷。從_80°C 冰箱中取出致敏細(xì)胞，立即放入冰中。細(xì)胞融化后，取100 μ 1放入預(yù)冷的Ep管中，輕輕混 合，在冰上放置lOmin，每兩分鐘輕晃幾下。涂平板，每個(gè)平板首先涂布20 40 μ 1 500Χ氨 芐青霉素，放在通風(fēng)櫥中風(fēng)干。然后分別梯度培養(yǎng)液涂布于平板上。風(fēng)干后倒置于培養(yǎng)箱 中30°C過夜培養(yǎng)。2、表達(dá)載體 psv2-dhfr_IFN-0 Ia 的鑒定選取平板上的單克隆細(xì)胞菌落，挑取部分單菌落接種于5ml 2YT培養(yǎng)液中培養(yǎng)過 夜。將0. 5ml培養(yǎng)的菌液與0. 5ml 50%的甘油混合于_40°C _70°C保存。其余培養(yǎng)液離
9
DNA5 μ 1
EcoR I0. 5μ 1
超純水12. 5μ1
Total20 μ 1心，提取表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶Bam HI和EcoR I酶切，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 結(jié)果顯示，與預(yù)期得到的基因大小相一致，表明表達(dá)載體psV2-dhfr-IFN-i3 Ia構(gòu)建成功。實(shí)施例5-7描述細(xì)胞轉(zhuǎn)染和單克隆篩選材料CHO-dhfr 購自 ATCC，WISH 公司保存。主要試劑IMDM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清均購自Gbico公司。二甲基亞砜、鏈霉素、 卡那霉素、胰蛋白酶均購自Sigma公司。氨甲基喋呤購自CALBI0CHEM公司。胸苷購自上海 華舜生物工程有限公司。次黃嘌呤購自BBI公司。PBS 取 NaCl 8. Og、KCl 0. 2g、Na2HPO4 1. 44g、KH2PO4 0. 24g，加水溶解并定容到 1000ml, 121°C下 15min 滅菌。動(dòng)物細(xì)胞基因組提取試劑盒。瓊脂糖電泳緩沖液50XTAE :242gTris，57. Iml冰 乙酸，18. 6g EDTA定容至1000ml，平時(shí)稀釋到4X備用。EB溶液100ml無菌水中溶入Ig 溴化乙錠，完全溶解后分裝避光保存。DNA載樣液0. 25%溴酚藍(lán)，0. 25%二甲苯青，50%甘 油。TE 緩沖液:10ml Tris-HCl (ρΗ7· 6)，ImM EDTA0干擾素活性測定試劑RPMI1640培養(yǎng)基取IL規(guī)格RPMI1640培養(yǎng)基1袋，加800ml 水溶解，加入青霉素和鏈霉素各IO5IU,再加入碳酸氫鈉2. lg，溶解后定容到1L，混勻，除菌 過濾后4°C保存。完全培養(yǎng)基取新生牛血清10ml，加入RPMI1640培養(yǎng)基90ml，4°C保存。 測定培養(yǎng)基取新生牛血清7ml，加入RPMI1640培養(yǎng)基93ml，4°C保存。攻毒培養(yǎng)基取新 生牛血清3ml，加入RPMI1640培養(yǎng)基97ml，4°C保存。消化液取EDTA 0. 2g、NaCl 8. Og、 KC10. 2g,Na2HPO4 1. 152g,KH2PO4 0. 2g，加水溶解并定容到 1000ml，121°C下 15min 滅菌。染 色液取結(jié)晶紫50mg，加入無水乙醇20ml溶解后加水稀釋到100ml。脫色液取無水乙醇 50ml，乙酸0. 1ml，加水稀釋到100ml。實(shí)施例5 CHO細(xì)胞的培養(yǎng)1、CHO-dhfr 細(xì)胞的復(fù)蘇從干冰或液氮中取出冷凍管，迅速投入37 38°C水浴中，約lmin，使其融化。室 溫下于5min內(nèi)用血清培養(yǎng)液稀釋道原體積的4倍。500 800rpm離心lOmin。除去上清 液，加入新鮮的培養(yǎng)液。一天后換液。剛復(fù)蘇的細(xì)胞生長緩慢，傳代后恢復(fù)正常。2、細(xì)胞的傳代、凍存?zhèn)鞔?，棄去舊培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入25%胰酶消化液，靜置40-60s。細(xì)胞開始 脫落時(shí)加入含血清培養(yǎng)液中止消化，用移液管反復(fù)輕微吹打，至成細(xì)胞懸液后按細(xì)胞密度 稀釋到所需比例轉(zhuǎn)移到新細(xì)胞瓶中培養(yǎng)。凍存，將單層細(xì)胞用胰蛋白酶消化后用細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù) 約106細(xì)胞/ml，800-1000rpm離心20s，去上清。加入含有10%二甲基亞砜和10%小牛血 清的培養(yǎng)液。細(xì)胞懸浮液按每個(gè)2ml的冷凍管加入Iml的量分裝，記上細(xì)胞株名和冷凍日 期。先放到_20°C冰箱凍2h，再放到-70°C冰箱凍3h，最后放入液氮罐中保存。實(shí)施例6表達(dá)載體psv2-dhfr-IFN-0的轉(zhuǎn)染1、CHO-dhfr-細(xì)胞對氨甲基蝶呤(MTX)敏感劑量檢測在24孔板中，每孔接種IX IO5細(xì)胞，加入不同濃度的MTX，2周后觀察細(xì)胞生長狀
10況。結(jié)果如下表1所示。表1 CHO-dhfr-細(xì)胞對MTX的耐受程度
MTX 的濃度(mol/L)0IxlO82> 0"85χ10"81χ1(Τ72χ10"7IxlO"6細(xì)胞耐受程度--++++++++++++-細(xì)胞正常生長；+部分細(xì)胞變型；++ 大量細(xì)胞死亡；+++ 全部細(xì)胞死亡由于CH0-dhfr_細(xì)胞的生長需要添加胸苷和次黃嘌呤，因此完全培養(yǎng)基中需加入 這兩種營養(yǎng)。當(dāng)將培養(yǎng)基換成普通培養(yǎng)基時(shí)細(xì)胞也能繼續(xù)分裂數(shù)次，但在隨后的持續(xù)培養(yǎng) 過程中，活細(xì)胞并不死亡，只是在慢慢衰老，但當(dāng)培養(yǎng)基中加入ι χ 10_7mol/L的MTX后該缺 陷型細(xì)胞全部死亡，因此本發(fā)明在初篩過程中選擇的MTX濃度為1 X liTmol/L。2、表達(dá)載體的線性化處理研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)過單酶切處理的表達(dá)載體無法轉(zhuǎn)染入CH0-dhfr_細(xì)胞。為了保證 DHFR基因(細(xì)胞從缺陷型恢復(fù)為野生型必須的基因片段，不能破壞)和Amp基因的完整，根 據(jù)載體質(zhì)粒基因圖譜，選擇Nde I或EcoR I內(nèi)切酶對表達(dá)載體進(jìn)行線性化處理，其中線性 化內(nèi)切酶中EcoR I的效果要好于Nde I。酶切條件Nde I 單酶切H Buffer2μ 1psv2-dhfr-IFN-^5μ 1Nde I0. 5 μ 1dd H2O12. 5μ 1_Total37°C恒溫水浴保溫1EcoRI 單酶切H Bufferpsv2-dhfr-IFN-^EcoRIdd H2O_Total20 μ 137 °C恒溫水浴保溫1. 5h。反應(yīng)完成后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行0. 7%瓊脂糖凝膠電泳確定大小，然后通過DNA回收 試劑盒進(jìn)行回收純化。3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，將8X IO5細(xì)胞接種于6孔板，每池中加上3ml培養(yǎng)液，放入37°C 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞飽和度在40%-80%。將2. 5yg上述分別用Nde I 或EcoRI酶切線性化處理的質(zhì)粒溶于TE緩沖液，加入無血清、無抗生素、無蛋白培養(yǎng)基到總
20 μ 1
.5h。
2μ 1 5 μ 1 0. 5μ 1 12. 5μ 1
11體積150 μ 1，DNA濃度0. 1 μ g/ μ 1。加入15 μ 1轉(zhuǎn)染試劑到DNA溶液中，上下混合5次或 旋轉(zhuǎn)混合10秒，室溫放置5-lOmin，形成復(fù)合物。將培養(yǎng)基從培養(yǎng)池中吸出，用4ml PBS,加 入3ml新鮮含有血清和抗生素的培養(yǎng)基。取Iml培養(yǎng)基加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物中上下混合兩次， 立即將其加入含細(xì)胞的6cm池中，輕輕混合。將細(xì)胞放入37°C 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 并使重組人干擾素β Ia基因表達(dá)。4、穩(wěn)定的細(xì)胞株的獲得和活力測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)過MTX的篩選壓力淘汰后留下的細(xì)胞繼續(xù)加壓篩選，這時(shí)將MTX濃度 提高到3X10_7mol/l，絕大部分細(xì)胞死亡，將剩余的活細(xì)胞按單個(gè)克隆轉(zhuǎn)入24孔板培養(yǎng)，每 個(gè)孔的細(xì)胞來自一個(gè)克隆，經(jīng)過一到兩周培養(yǎng)后孔中密度達(dá)80%時(shí)取培養(yǎng)三天的上清液進(jìn) 行測活篩選，將活力高的細(xì)胞株轉(zhuǎn)入方瓶培養(yǎng)，凍存。將MTX的篩選濃度提高后可以提高篩 選效率，增加獲得高表達(dá)細(xì)胞株的幾率。經(jīng)過篩選，采用psV2-dhfr載體轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞表 達(dá)表達(dá)IFN-β的活性最高為194670IU/mL。5、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的確定將轉(zhuǎn)染后經(jīng)過篩選后的細(xì)胞使用方瓶培養(yǎng)后收集細(xì)胞，采用動(dòng)物細(xì)胞基因組提取 試劑盒提取細(xì)胞的基因組，通過擴(kuò)增用的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，如能擴(kuò)增出目的基因則為陽 性克隆，否則為假陽性。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示目的基因已經(jīng)成功克隆進(jìn)CH0-dhfr_細(xì)胞。6、重組人干擾素β Ia基因的活性測定按照藥典的規(guī)定采用WISH細(xì)胞病變抑制法測定重組人干擾素β Ia基因的活性。 干擾素可以保護(hù)人羊膜細(xì)胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV)破壞的作用，用結(jié)晶紫對存 活的WISH細(xì)胞染色，于波長570nm處測定其吸光度，可得到干擾素對WISH細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng) 曲線，以此測定干擾素生物學(xué)活性。本實(shí)施例分別制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液和本發(fā)明供試品溶液進(jìn)行活性測定和比較。1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取人干擾素生物學(xué)活性測定的國家標(biāo)準(zhǔn)品，按說明書復(fù)溶后，用測定培養(yǎng)液稀釋 至每Iml含1000IU。在96孔細(xì)胞板中做4倍系列稀釋，共稀釋8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做 2個(gè)孔。在無菌條件下操作。2)本發(fā)明供試品溶液的制備將供試品按標(biāo)示量溶解后，用測定培養(yǎng)液稀釋成每Iml約含1000IU。在96孔細(xì)胞 板中做4倍系列稀釋，共稀釋8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做2個(gè)孔。在無菌條件下操作。3)測定法使WISH細(xì)胞在培養(yǎng)基中貼壁生長。按1 2 1 4傳代，每周2 3次，于完 全培養(yǎng)液中生長。取培養(yǎng)的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次后消化收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基 配制成每Iml含2. 5 X IO5 3. 5 X IO5個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每 孔ΙΟΟμΙ。于37°C、5% 二氧化碳條件下培養(yǎng)4 6小時(shí)。將配制完成的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供 試品溶液移入接種WISH細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔加入100 μ 1。于37°C、5%二氧化碳條件下 培養(yǎng)18 24h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液。將保存的水泡性口炎病毒(_70°C保存)用 攻毒培養(yǎng)液稀釋至100 CCID 50，每孔ΙΟΟμΙ。于37°C、5% 二氧化碳條件下培養(yǎng)24小時(shí)。 然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，每孔加入染色液50 μ 1，室溫放置30min后，用流水小心 沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100 μ 1，室溫放置3 5min?；靹蚝螅妹笜?biāo)儀以630nm為參比波長，在波長570nm處測定吸光度，記錄測定結(jié)果。在檢測過程中我們 以干擾素-α國家標(biāo)準(zhǔn)品作對照品的效價(jià)在自動(dòng)酶標(biāo)儀上計(jì)算樣品的效價(jià)值。結(jié)果顯示，本發(fā)明的IFNi3 Ia基因在CHO細(xì)胞表達(dá)體系的滴度高于對照品。此外 本發(fā)明的IFNi3 Ia基因在CHO細(xì)胞表達(dá)體系的滴度明顯高于現(xiàn)有技術(shù)中公開的滴度值，說 明本表達(dá)載體和表達(dá)水平優(yōu)于現(xiàn)有的公開技術(shù)，如表2所示。表2 IFN^ Ia基因在CHO細(xì)胞表達(dá)體系的滴度結(jié)果
權(quán)利要求
分離的重組人干擾素β1a基因，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的重組人干擾素βIa基因的質(zhì)粒表達(dá)載體，其具有圖5所示的 結(jié)構(gòu)。
3.含有權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒表達(dá)載體的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其是將所述質(zhì)粒表達(dá)載 體轉(zhuǎn)入CHO-DHFR-細(xì)胞中構(gòu)建而成。
4.一種在CHO細(xì)胞表達(dá)體系中生產(chǎn)所述重組人干擾素β Ia蛋白的方法，包括以下步驟(1)根據(jù)人干擾素βIa的核苷酸序列合成重組人干擾素β Ia基因；(2)將重組人干擾素βIa基因連接到質(zhì)粒載體pSV2-dhfr中，構(gòu)建含有所述重組人干 擾素β Ia基因的質(zhì)粒表達(dá)載體；(3)將所述質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CHO-DHFR-細(xì)胞，構(gòu)建含有重組人干擾素βIa基因的CHO 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)；(4)在所述CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組人干擾素βIa蛋白；(5)分離并純化所述重組人干擾素βIa蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述步驟(2)中質(zhì)粒載體pSV2-dhfr先經(jīng)磷酸化 處理，通過BamH I和EcoR I雙酶切將重組人干擾素β Ia基因與質(zhì)粒pSV2_dhfr連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(3)中，所述表達(dá)載體通過內(nèi)切酶進(jìn)行線性化 處理，所述內(nèi)切酶為Nde I或EcoR I。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(4)是在含有氨甲基蝶呤的培養(yǎng)體系下進(jìn)行 細(xì)胞培養(yǎng)，所述的氨甲喋呤濃度為1X10_7至2X10_7mol/l之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(4)首先采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式，培養(yǎng)步驟(3)獲 得的含有重組人干擾素β Ia基因的CHO細(xì)胞，培養(yǎng)周期為12-24天，細(xì)胞培養(yǎng)液每3天換一 次，血清含量在上轉(zhuǎn)瓶時(shí)和第一次換液時(shí)為10%，第二次、第三次換液為5%，以后均為3% ； 培養(yǎng)液的PH為7. 1-7. 4，溫度為37-38. 5°C ；接著采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式灌流培養(yǎng)，培養(yǎng) 周期為20-60天，接種濃度為0. 5 X IO5 5 X IO5細(xì)胞/ml，灌流速度為0. 74L/天-5. 55L/ 天，攪拌速度為140轉(zhuǎn)/分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中步驟(5)所述的分離并純化包括如下步驟a)將步驟(4)的細(xì)胞培養(yǎng)液離心，超濾濃縮，得到超濾產(chǎn)品；b)將超濾產(chǎn)品經(jīng)親和層析分離，得到層析樣品；c)將上述層析樣品脫鹽，得到脫鹽產(chǎn)品；d)將脫鹽產(chǎn)品經(jīng)陽離子交換層析分離，得到純化的蛋白產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人干擾素β1a基因、其表達(dá)載體和重組人干擾素β1a的制備方法。重組人干擾素β1a基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，通過將重組人干擾素β1a基因與質(zhì)粒pSV2-dhfr連接構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，并將所述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入CHO-DHFR-細(xì)胞，構(gòu)建基于真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還公開了在CHO細(xì)胞表達(dá)體系中生產(chǎn)所述重組人干擾素β1a蛋白的方法，并對各步驟進(jìn)行了優(yōu)化，產(chǎn)生的重組人干擾素β1a蛋白比活達(dá)到1.62×108IU/ml。
文檔編號C07K14/565GK101974536SQ20101011188
公開日2011年2月16日 申請日期2010年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者黨建章, 張麗君, 王妍, 黃志斌, 黃志立 申請人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院