專利名稱：田薊苷的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥提取物制備和應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種田薊苷的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香青蘭為唇形科植物香青蘭(Dracoc印halum Moldevica L.)的干燥地上部分， 夏季盛花期采割，除去雜質(zhì)，曬干?；ǘ辔s，藍(lán)紫色。氣清香，葉微辛。香青蘭含有大量 的黃酮類化合物，如田薊苷(Tilianin)、藿香苷(Agastachoside)、木犀草素-7-0-葡萄 糖苷(Luteolin-7-0-glucoside)、木犀草素(Luteolin)、山奈酚(Kaempferol)、異鼠李素 (Isorhamnetin)等。文獻(xiàn)報(bào)道，其中，黃酮苷類化合物田薊苷含量較高。
田薊苷(tilianin)有顯著擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的作用，可用于制備治療心血管疾病，特 別是抗心肌缺血的藥物。雖然黃酮苷類化合物中田薊苷含量較高，但目前還沒(méi)有得到很好 的分離和提純，也無(wú)市售的田薊苷純品。 綜上，需要提供一種田薊苷的制備方法，增加其純度。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述至少一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種制備高純度田薊苷的方法，同 時(shí)提高了從香青蘭中提取田薊苷的得率。 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的田薊苷的制備方法，包括以下步驟(a)將香 青蘭地上部分，用10 40重量倍數(shù)的20 60vol %的醇溶液提取，得到提取液；(b)濃縮、 干燥所述提取液，得到浸膏粉；(c)使用有機(jī)溶劑萃取所述浸膏粉，得到萃取液；(d)濃縮所 述萃取液后，進(jìn)行硅膠柱層析，流動(dòng)相采用復(fù)合洗脫劑，所述復(fù)合洗脫劑由A組分和B組分 構(gòu)成，所述A組分選自下述組中的至少一種甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮或丁醇，所述B組分選 自下述組中的至少一種氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷，所述A組分與B組分的體積 比為90 : 10 10 : 90，進(jìn)行梯度洗脫得到洗脫液；以及(e)合并相同組分洗脫液，濃縮， 得到所述田薊苷。 本發(fā)明所提供的方法操作簡(jiǎn)便，提取效率高，所得田薊苷的純度不低于98%，可用 于制備治療心血管疾病的藥物，如治療冠心病、心肌梗死、心肌缺血等癥，特別是對(duì)缺血心 肌的保護(hù)，藥效明顯，質(zhì)量可控性強(qiáng)。 根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，步驟a所述醇溶液選自下述組中的至少一種甲醇、乙 醇或丙醇，提取時(shí)間為1 7h。 黃酮類化合物在花、葉、果等組織中，一般多以苷的形式存在，而在木部堅(jiān)硬組織 中，則多以游離苷元形式存在。黃酮苷類以及極性稍大的苷元(如羥基黃酮、雙黃酮、橙酮、 查耳酮等)，一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些極性較大的混合溶劑進(jìn)行提取。經(jīng)反 復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述田薊苷難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，在對(duì)香青蘭 進(jìn)行提取時(shí)，可以用20 60vol^的醇溶液進(jìn)行提取，其中，以乙醇溶液的提取效果較好。
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根據(jù)本發(fā)明，步驟b所述濃縮為減壓濃縮，所述干燥為真空干燥，在此條件下濃縮
和干燥的效果均可在不破壞田薊苷有效成分的前提下達(dá)到最佳。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式之一，步驟C所述有機(jī)溶劑選自下述組中的至少一種乙 酸乙酯、甲苯、四氯化碳、乙醚、氯仿、溴苯或二氯甲烷，萃取次數(shù)為2 6次。
利用黃酮類化合物與混入的雜質(zhì)極性不同，選用不同溶劑進(jìn)行萃取可達(dá)到精制純 化目的。研究人員發(fā)現(xiàn)，在制備田薊苷的過(guò)程中，上述有機(jī)溶劑均能達(dá)到分離田薊苷的效
果，其中，選用乙酸乙酯進(jìn)行萃取效果較好，在除去雜質(zhì)的同時(shí)，還起到了分離苷和苷元、極 性苷元與非極性苷元的效果，從而使得田薊苷分離效果較好。 根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，步驟d中采用的硅膠為100 200目的層析用硅膠H。 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，濃縮后的所述萃取液與所述層析用硅膠H的重量比為1 : 30 70。 硅膠H不含粘合劑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于田薊苷的分離效果最好，分離度較高。
硅膠柱層析流動(dòng)相，依據(jù)所分離的提取物極性不同，可選用乙酸乙酯-丙酮、環(huán)己 烷_(kāi)丙酮、乙酸乙酯_石油醚、甲醇_氯仿、正丁醇_醋酸、四氯化碳_乙腈等，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)， 田薊苷的分離中，采用乙酸乙酯_丙酮、氯仿_甲醇作為流動(dòng)相分離效果較好。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式之一，當(dāng)步驟d中所述復(fù)合洗脫劑中A組分為甲醇且B組
分為氯仿時(shí)，氯仿和甲醇的體積比依次為95 : 5、9 : 1、8 : 2。此時(shí)能提高香青蘭中田薊
苷組分的分離能力，得率高，同時(shí)縮短分析周期。 當(dāng)流動(dòng)相被設(shè)置為上述比例時(shí)，田薊苷的組分主要在流動(dòng)相氯仿_甲醇體積比為 9 : l時(shí)被洗脫。因此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟e中所述相同組分洗脫液為氯仿和
甲醇的溶劑體積比在9 : i時(shí)流出的洗脫液。此時(shí)的洗脫液中，田薊苷有效成分最集中，因
而合并這部分洗脫液，其分離效果最好，收率最高。 根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，所述步驟e進(jìn)一步包括用醇溶液對(duì)田薊苷進(jìn)行重結(jié)晶 的步驟。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式之一，重結(jié)晶步驟中使用的所述醇溶液為40 60vol^甲 醇-水溶液。 在提取分離田薊苷過(guò)程中，為了進(jìn)一步純化所得田薊苷，濾去雜質(zhì)，可對(duì)田薊苷進(jìn) 行重結(jié)晶。所用試劑可以包括甲醇、乙醇、異丙醇、氯仿、乙酸乙酯等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以 50vol %甲醇_水溶液進(jìn)行重結(jié)晶效果較好，所得產(chǎn)品純度高。 本發(fā)明通過(guò)上述制備方法，首次從少數(shù)民族藥物香青蘭中得到了高純度的田薊 苷，與現(xiàn)階段對(duì)田薊苷組分分離鑒定的提取工藝相比，提取純度明顯提高，可高達(dá)98%以 上。同時(shí)，本發(fā)明所采用的流動(dòng)相濃度梯度配比縮短了分析周期，增加了分離靈敏度，從而 提高了各組分的分離能力，使得田薊苷的得率提高。


下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)作出進(jìn) 一步詳細(xì)的說(shuō)明。
圖1為本發(fā)明提供方法的工藝流程圖； 圖2為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例所制備的田薊苷的紫外光譜(UV)圖；
圖3為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例所制備的田薊苷的紅外光譜(IR)4
圖4為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例所制備的田薊苷的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)圖；
圖5為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例所制備的田薊苷的核磁共振氫譜CH-NMR)圖；
圖6為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例所制備的田薊苷的核磁共振碳譜(13C_NMR)圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的一種田薊苷的制備方法，包括獲得香青蘭的提取物，以及對(duì)提取物
進(jìn)一步萃取、層析、結(jié)晶等步驟。下面結(jié)合附圖，詳述本發(fā)明所提供的方法。 如圖1所示，首先，將1份重量的香青蘭干燥的地上部分粉碎，用10 40重量倍
數(shù)的20 60vol^的醇溶液提取，例如可以選用乙醇或甲醇或丙醇或它們的任意混合物回
流提取1 5次，每次提取1 7h。然后，將提取液濃縮，例如可以采用減壓濃縮的方法，濃
縮后提取液呈膏狀。之后再將膏狀物干燥，例如可以采用真空干燥的方法，將膏狀物制成浸膏粉。 將浸膏粉用有機(jī)溶劑萃取，得到萃取液。萃取用的有機(jī)溶劑包括，但不限于乙酸乙 酯、甲苯、四氯化碳、乙醚、氯仿、溴苯或二氯甲烷，以及它們的任意組合。優(yōu)選乙酸乙酯，萃 取的次數(shù)一般為2 6次。 將萃取液濃縮后，進(jìn)行硅膠柱層析。層析的步驟可以為將濃縮后的萃取液中拌 入硅膠，例如可以采用100 200目的層析用硅膠H，拌入的比例為濃縮后的萃取液與層析 用硅膠H的重量比為1 : 30 70。上柱完畢后，按梯度比例通入流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。流動(dòng) 相采用復(fù)合洗脫劑，該復(fù)合洗脫劑由A組分和B組分構(gòu)成，A組分可選自下述組中的至少一 種甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮或丁醇，B組分可選自下述組中的至少一種氯仿、乙酸乙酯、 二氯甲烷或二氯乙烷，A組分與B組分的體積比為90 : 10 10 : 90。例如流動(dòng)相可以采 用氯仿-甲醇或乙酸乙酯-丙酮，優(yōu)選氯仿-甲醇。當(dāng)流動(dòng)相采用氯仿-甲醇時(shí)，氯仿和甲
醇的梯度洗脫的溶劑體積比依次為95 : 5、9 : 1、8 : 2，此時(shí)田薊苷的組分主要在流動(dòng)相 氯仿-甲醇體積比為9 : i時(shí)被洗脫。最后，合并相同組分洗脫液并濃縮，得到田薊苷提取物。 進(jìn)一步地，為了提高田薊苷的收率，還可利用醇溶液，例如40 60vol^、特別是 50vol %的甲醇-水溶液，再對(duì)上述田薊苷提取物進(jìn)行重結(jié)晶，即得到淡黃色粉末狀結(jié)晶， 為田薊苷成品，其純度可達(dá)98%以上。經(jīng)UV、 IR、 MS H-NMR、"C-NMR對(duì)所得組分的結(jié)構(gòu)進(jìn) 行鑒定，可知其為田薊苷。 圖2、圖3為根據(jù)本發(fā)明的制備方法制備的田薊苷的UV圖譜和IR圖譜。
圖4為根據(jù)本發(fā)明的制備方法制備的田薊苷的ESI-MS圖譜，根據(jù)田薊苷的 ESI-MS的分析可知，ESI-MS特征峰在m/z 447 [M+](正離子)，m/z 481 [M+CL—](負(fù)離子)， m/z 285. 33[M+H-glc]， m/z 233. 84[M+_CH3]。再結(jié)合圖5、圖6所示的根據(jù)本發(fā)明的制 備方法制備的田薊苷的NMR圖譜分析，可確定其分子量為446，分子式為GAA。，其中， 力-NMR(400MHz， DMSO)圖譜中表現(xiàn)出典型的黃酮苷類化合物的氫譜特征，通過(guò)耦合常數(shù)及 化學(xué)位移可確定每個(gè)氫的歸屬,C-NMR(DMS0，400MHz)圖譜中呈現(xiàn)出22個(gè)碳信號(hào)，為1個(gè) CH3，12個(gè)CH，8個(gè)季碳。Sc表明分子中含一個(gè)羰基(Sl82.9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù) 基本一致，因此，可確定所得化合物為田薊苷。 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限
5定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1 首先，取2kg香青蘭干燥的地上部分粉碎，用20重量倍數(shù)的40% vol的乙醇回流 提取1次，提取時(shí)間為3h。然后，將提取液減壓濃縮成膏狀，再真空干燥成浸膏粉，用醋酸乙 酯萃取3次。隨后，將萃取液濃縮拌硅膠，所用提取物樣品與層析用100目的硅膠H按重量
比i : 50上樣，進(jìn)行柱層析，流動(dòng)相采用氯仿-甲醇，以濃度梯度配比95 : 5-9 :i-8:2 進(jìn)行梯度洗脫，其中，田薊苷組分在9 : i濃度范圍內(nèi)流出。最后，合并相同組分并濃縮，析
出田薊苷，再用50vol%甲醇-水溶液重結(jié)晶，得到淡黃色粉末狀結(jié)晶。 (1)結(jié)構(gòu)鑒定取所得樣品分別進(jìn)行UV、 IR、 MS、 NMR分析鑒定，確定實(shí)施例1所提
純的樣品為田薊苷。 (2)純度鑒定 熔點(diǎn)(mp)測(cè)定255°C 257°C。 薄層色譜檢測(cè)采用三種展開(kāi)體系進(jìn)行檢測(cè)，薄層板用硅膠HF254板。展開(kāi)劑A為 氯仿-甲醇(體積比為8.5 : 1.5)，RfA為0.42;展開(kāi)劑B為甲苯-乙酸乙酯-甲酸(體積
比為5 : 4 : D，RfB為o.45 ;展開(kāi)劑c為甲苯-甲酸乙酯-甲酸(體積比為5 : 4 : i)，
RfB為0. 45 ;紫外254nm下見(jiàn)棕黑色斑點(diǎn)，無(wú)雜質(zhì)點(diǎn)。HPLC檢測(cè)用HPLC歸一化法測(cè)定含量，選定324nm和350nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。選用
甲醇-O. 4%磷酸水溶液(48 : 52，V/V)和甲醇-O. 5%甲酸水溶液(27 : 73， V/V)兩種溶
劑系統(tǒng)做歸一化含量測(cè)定，以兩種測(cè)定方法結(jié)果的平均值作為含量測(cè)定結(jié)果。將實(shí)施例1
制備的田薊苷結(jié)晶用甲醇溶解，經(jīng)分析型高效液相色譜檢測(cè)，采用歸一化法定量，其純度為
99%。
洗脫液中田薊苷濃度X洗脫液體積
得率計(jì)算田薊苷得率(％)=-xioo
香青蘭中田薊苷的量 經(jīng)檢測(cè)，實(shí)施例1提取得到的田薊苷純度為99%，得率為78. 2% 。
實(shí)施例2 首先，取lkg香青蘭干燥的地上部分粉碎，用10重量倍數(shù)的50% vol的乙醇回流 提取4次，提取時(shí)間為3h。然后，將提取液減壓濃縮成膏狀，再真空干燥成浸膏粉，用醋酸乙 酯萃取3次。隨后，將萃取液濃縮拌硅膠，所用提取物樣品與層析用120目硅膠H按重量比
i : 40上樣，進(jìn)行柱層析，流動(dòng)相采用氯仿-甲醇，以濃度梯度配比i7 : l-8 : l-3 : i進(jìn) 行梯度洗脫，其中，田薊苷組分在8 : i濃度范圍內(nèi)流出。最后，合并相同組分并濃縮，析出
田薊苷，再用50vol^甲醇-水溶液重結(jié)晶，得到淡黃色粉末狀結(jié)晶。 按照實(shí)施例1中方法對(duì)所得組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和純度分析，可確定實(shí)施例2所提 純的樣品為田薊苷，其純度為98 % ，得率為75. 0 % 。
實(shí)施例3 首先，取3kg香青蘭干燥的地上部分粉碎，用40重量倍數(shù)的60% vol的乙醇 回流提取5次，提取時(shí)間為2h。然后，將提取液減壓濃縮成膏狀，再真空干燥成浸膏粉， 用醋酸乙酯萃取4次。隨后，將萃取液濃縮拌硅膠，所用提取物樣品與層析用150目硅
6膠H按重量比1 : 60上樣，進(jìn)行柱層析，流動(dòng)相采用乙酸乙酯-丙酮，以濃度梯度配比
16 : i-io : 1-4 : i進(jìn)行梯度洗脫，其中，田薊苷組分在io : i濃度范圍內(nèi)流出。最后，合并相同組分并濃縮，析出田薊苷，再用50vol %甲醇-水溶液重結(jié)晶，得到淡黃色粉末狀結(jié)晶。 按照實(shí)施例1中方法對(duì)所得組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和純度分析，可確定實(shí)施例3所提純的樣品為田薊苷，其純度為98%，得率為75. 5% 。
實(shí)施例4 首先，取2kg香青蘭干燥的地上部分粉碎，用60重量倍數(shù)的20 % vol的乙醇提取1次，提取時(shí)間為7h。然后，將提取液減壓濃縮成膏狀，再真空干燥成浸膏粉，用醋酸乙酯萃取6次。隨后，將萃取液濃縮拌硅膠，所用提取物樣品與層析用200目硅膠H按重量比1 : 40
上樣，進(jìn)行柱層析，流動(dòng)相采用乙酸乙酯-丙酮，以濃度梯度配比15 : l-8 : l-3 : i進(jìn)行梯度洗脫，其中，田薊苷組分在8 : i濃度范圍內(nèi)流出。最后，合并相同組分并濃縮，析出田
薊苷，再用50vol %的甲醇-水溶液重結(jié)晶，得到淡黃色粉末狀結(jié)晶。 按照實(shí)施例1中方法對(duì)所得組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和純度分析，可確定實(shí)施例4所提純的樣品為田薊苷，其純度為99%，得率為76. 3% 。 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
權(quán)利要求
一種田薊苷的制備方法，具體包括以下步驟(a)將香青蘭地上部分，用10～40重量倍數(shù)的20～60vol％的醇溶液提取，得到提取液；(b)濃縮、干燥所述提取液，得到浸膏粉；(c)使用有機(jī)溶劑萃取所述浸膏粉，得到萃取液；(d)濃縮所述萃取液后，進(jìn)行硅膠柱層析，流動(dòng)相采用復(fù)合洗脫劑，所述復(fù)合洗脫劑由A組分和B組分構(gòu)成，所述A組分選自下述組中的至少一種甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮或丁醇，所述B組分選自下述組中的至少一種氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷，所述A組分與B組分的體積比為90∶10～10∶90，進(jìn)行梯度洗脫得到洗脫液；以及(e)合并相同組分洗脫液，濃縮，得到所述田薊苷。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟a所述醇溶液選自下述組中的至少一種甲 醇、乙醇或丙醇，提取時(shí)間為1 7h。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟b所述濃縮為減壓濃縮，所述干燥為真空干燥。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，步驟c所述有機(jī)溶劑選自下述組中的至少一種乙 酸乙酯、甲苯、四氯化碳、乙醚、氯仿、溴苯或二氯甲烷，萃取次數(shù)為2 6次。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，步驟d中采用的硅膠為100 200目的層析用硅膠H。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中，濃縮后的所述萃取液與所述層析用硅膠H的重量比 為1 : 30 70。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，當(dāng)步驟d中所述復(fù)合洗脫劑中A組分為甲醇且B組分為氯仿時(shí)，氯仿和甲醇的體積比依次為95 : 5、9 : 1、8 : 2。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，步驟e中所述相同組分洗脫液為氯仿和甲醇的溶劑體積比在9:i時(shí)流出的洗脫液。
9. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，步驟e進(jìn)一步包括用醇溶液對(duì)田薊苷進(jìn)行重結(jié)晶的 步驟。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述醇溶液為40 60vol%甲醇-水溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種田薊苷的制備方法，具體包括以下步驟將香青蘭地上部分，用10～40重量倍數(shù)的20～60vol％的醇溶液提取，得到提取液；濃縮、干燥所述提取液，得到浸膏粉；使用有機(jī)溶劑萃取所述浸膏粉，得到萃取液；濃縮所述萃取液后，進(jìn)行硅膠柱層析，流動(dòng)相采用復(fù)合洗脫劑，所述復(fù)合洗脫劑由A組分和B組分構(gòu)成，所述A組分選自下述組中的至少一種甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮或丁醇，所述B組分選自下述組中的至少一種氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷，所述A組分與B組分的體積比為90∶10～10∶90，進(jìn)行梯度洗脫得到洗脫液；以及合并相同組分洗脫液，濃縮，得到所述田薊苷。根據(jù)本發(fā)明所提供的方法制備的田薊苷純度高，同時(shí)田薊苷的得率也較高。
文檔編號(hào)C07H1/08GK101781345SQ20101011237
公開(kāi)日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者王新春, 王魯妹, 袁勇, 邢建國(guó) 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院