專利名稱：一種從葉下珠中分離純化葉下珠素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木脂素類化合物“葉下珠素”的制備方法，具體是涉及從大戟科植 物葉下珠全草中提取葉下珠素的方法，屬于藥用植物的綜合利用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葉下珠(Phyllanthus urinaria L.)為大戟科葉下珠屬植物，別名珍珠草、夜合 草、陰陽(yáng)草，一年生草本，全草入藥，是傳統(tǒng)的中草藥。最早收載于《生草藥性備要》中，具有 平肝清熱、利水解毒之功效，我國(guó)民間主要用來(lái)治療小兒疳積、黃疸、肝炎、腸炎、痢疾、腎炎 水腫、蛇咬傷等癥[1]。葉下珠屬植物全世界有600多種，我國(guó)有6亞屬、33種、4個(gè)變種，葉下 珠屬植物可為草本、灌木或喬木，主要分布于長(zhǎng)江流域和南方諸省[2]，生于山坡、路旁、田邊 等草叢濕地[1]。自印度學(xué)者Thyagarajan報(bào)告用苦味葉下珠(Phyllanthus amarus L.), 治療乙肝病毒攜帶者，可使59%患者的乙肝表面抗原(HBsAg)轉(zhuǎn)陰[3]，有關(guān)葉下珠的功效 引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。木脂素類化合物是葉下珠的主要成分之一，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，葉下珠素對(duì)KB細(xì)胞的糖 蛋白有作用，因而對(duì)KB細(xì)胞有細(xì)胞素活性，這一活性可因加入長(zhǎng)春花堿而增強(qiáng)。加入長(zhǎng)春 花堿時(shí)，次葉下珠素也對(duì)KB細(xì)胞有細(xì)胞素活性M。并且這兩個(gè)木脂素對(duì)小鼠CCl4和半乳 糖胺誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷均有顯著的保護(hù)作用[5]。二節(jié)基_ 丁內(nèi)酯diben-zylbutyrolactone 有抗腫瘤活性[6]。葉下珠素屬于芳基丁烷類，此類木脂素是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一類木脂素。在植物生 物合成過(guò)程中，此類木脂素是合成其它各類木脂素的基石，由它可以轉(zhuǎn)化為其它各類木脂 素。KadaliS. Sagar等通過(guò)葉下珠素為前體成功地合成了化合物2_28，并對(duì)該類木脂素的 抗HIV活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明化合物2、22、23、28表現(xiàn)了很好的抗HIV活性，IC5tl值分 別為 0. 25,0. 07,0. 01 和 0. 32 μ Μ, CC50 值分別為 74. 8,63. 5,60. 5 和 12. 8 μ Μ,化合物 23 對(duì) HIV的抑制活性最強(qiáng)，治療指數(shù)值(CC5CI/IC5CI)高達(dá)60000，具有開(kāi)發(fā)新型的抗HIV藥物的潛 力，是一個(gè)很有價(jià)值的化合物。目前有關(guān)于葉下珠素提取的報(bào)道，還沒(méi)有關(guān)于大量提取葉下珠素工藝方法的文獻(xiàn) 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括新鮮的葉下珠經(jīng)洗凈去雜，曬干，粉碎，用乙醇溶液 提取、過(guò)濾、減壓濃縮，然后用樹(shù)脂吸附、乙酸乙酯洗脫、將洗脫液濃縮，結(jié)晶而制得葉下珠
素純品。因此，本發(fā)明提供一種從葉下珠提取分離葉下珠素的方法，步驟包括1)原料處理將采集到的原料洗凈，在50°C的烘箱種烘干至恒重或在戶外曬干， 粉碎，干粉粒徑在20目 200目之間；2)常溫提取把葉下珠原料放入三角瓶，加入25倍原料重量的95%的乙醇溶液，需常溫提取2次，提取時(shí)間為40min左右；3)過(guò)濾、濃縮將上述浸提液過(guò)濾經(jīng)減壓濃縮；4)離心分離將濃縮液進(jìn)行離心分離，取出雜質(zhì)；5)大孔樹(shù)脂吸附精制將離心好的濃縮物倒入裝有處理好的大孔樹(shù)脂吸附樹(shù)脂 柱中進(jìn)行柱層吸附，用80%乙醇溶液洗脫；6)濃縮并回收乙醇這些洗脫下來(lái)的溶液分別減壓濃縮(乙醇回收)；7)硅膠柱吸附精制濃縮過(guò)的混合物用乙酸乙酯溶解，上硅膠柱用石油醚乙酸 乙酯梯度洗脫(乙酸乙酯的體積百分含量為5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 % )，每個(gè) 梯度洗脫體積為500mL，約50mL收集一次洗脫液，洗脫液濃縮后得葉下珠素粗品；8)重結(jié)晶用石油醚重結(jié)晶，得高純度的葉下珠素。其重結(jié)晶方法是采用有機(jī)化 合物常用的精制方法進(jìn)行操作。用本發(fā)明所說(shuō)的方法制備的葉下珠素用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定含量可達(dá) 98. 1%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明能從葉下珠中提取出高純度葉下珠素，制備工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，能夠適 用于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1 葉下珠素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜曲線圖，其中縱坐標(biāo)表示峰面積，橫坐標(biāo)表示分離時(shí)間。 圖2 從葉下珠中提取葉下珠素的質(zhì)譜曲線圖，其中縱坐標(biāo)表示峰面積，橫坐標(biāo)表示分 離時(shí)間。
具體實(shí)施例方式下面，本發(fā)明將用實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，但是它并不限于這些實(shí)施例的 任一個(gè)或類似實(shí)例。實(shí)施例1 稱取50g生藥，加入95 %乙醇6升，常溫提取60min，過(guò)濾，藥渣按上述方法重復(fù) 一次，合并提取液，減壓濃縮至IOOmL,濃縮溶液上型號(hào)為HPD100大孔樹(shù)脂柱，上樣流速 為lBV/h，上樣量為6. 5BV,用80 %乙醇解析，流速為2BV/h，解析液用量為9BV，解析率為 76. 7%，葉下珠素解析液濃縮干后，所得浸膏約為lg。浸膏用200mL 98%乙酸乙酯溶解，靜 置取上清液，在上清液中加入5g干硅膠，合并后減壓濃縮至干后，上裝好的硅膠柱，用石油 醚乙酸乙酯梯度洗脫，每個(gè)洗脫體積為500mL，約50mL收集一次洗脫液，合并葉下珠素含 量高的流份，濃縮后放入0-4°C冰箱中冷藏，24h后出現(xiàn)白色絮狀沉淀，過(guò)濾得到葉下珠素 的晶體。濾液減壓濃縮后繼續(xù)放入冰箱冷藏24h，過(guò)濾，合并晶體。將得到的晶體用石油醚加 熱溶解，再放入冰箱冷凍至析出白色針狀結(jié)晶，濾出，真空干燥24h，得葉下珠素約為40mg， 純度為98. 2%。(樣品純度見(jiàn)圖2，圖1為葉下珠素的標(biāo)準(zhǔn)HPLC圖譜)實(shí)施例2 稱取50Kg生藥，加入95%乙醇5000升，常溫提取80min，過(guò)濾，藥渣按上述方法 重復(fù)一次，合并提取液，減壓濃縮至50L，濃縮溶液上型號(hào)為HPD100大孔樹(shù)脂柱，上樣流速 為lBV/h，上樣量為6. 5BV,用80 %乙醇解析，流速為2BV/h，解析液用量為9BV，解析率為75. 4%，葉下珠素解析液濃縮干后，所得浸膏約為0.9Kg。浸膏用200L 98%乙酸乙酯溶解， 靜置取上清液，在上清液中加入5kg干硅膠，合并后減壓濃縮至干后，上裝好的硅膠柱，用 石油醚乙酸乙酯梯度洗脫，每個(gè)洗脫體積為50L，約5L收集一次洗脫液，合并葉下珠素含 量高的流份，濃縮后放入0-4°C冰箱中冷藏，24h后出現(xiàn)白色絮狀沉淀，過(guò)濾得到葉下珠素 的晶體。濾液減壓濃縮后繼續(xù)放入冰箱冷藏24h，過(guò)濾，合并晶體。將得到的晶體用石油醚加 熱溶解，再放入冰箱冷凍至析出白色針狀結(jié)晶，濾出，真空干燥24h，得葉下珠素約為30g， 純度為98.8%。實(shí)施例3 稱取20Kg生藥，加入95%乙醇2000升，常溫提取50min，過(guò)濾，藥渣按上述方法 重復(fù)一次，合并提取液，減壓濃縮至20L，濃縮溶液上型號(hào)為HPD100大孔樹(shù)脂柱，上樣流速 為lBV/h，上樣量為6. 5BV,用80 %乙醇解析，流速為2BV/h，解析液用量為9BV，解析率為 77.5%，葉下珠素解析液濃縮干后，所得浸膏約為0.21^。浸膏用50L 98%乙酸乙酯溶解， 靜置取上清液，在上清液中加入5kg干硅膠，合并后減壓濃縮至干后，上裝好的硅膠柱，用 石油醚乙酸乙酯梯度洗脫，每個(gè)洗脫體積為10L，約IL收集一次洗脫液，合并葉下珠素含 量高的流份，濃縮后放入0-4°C冰箱中冷藏，24h后出現(xiàn)白色絮狀沉淀，過(guò)濾得到葉下珠素 的晶體。濾液減壓濃縮后繼續(xù)放入冰箱冷藏24h，過(guò)濾，合并晶體。將得到的晶體用石油醚加 熱溶解，再放入冰箱冷凍至析出白色針狀結(jié)晶，濾出，真空干燥24h，得葉下珠素約為18g， 純度為99. 1%0參考文獻(xiàn)[1]全國(guó)中草藥匯編編寫組編.全國(guó)中草藥匯編[M](上冊(cè))，北京人民衛(wèi)生出版 社，1978，263[2]李秉滔.中國(guó)葉下珠屬植物的修訂[J].植物分類學(xué)報(bào)，1987，25 (5) 371 375[3] Thyagarajan S P, Thiruneelakantan K, Subramanian S, et al. In vitroinactivation of HBsAg by Eclipla alba Hassk and Phllanthus uiruri linn[J]. Indian J Med Res，1982，76 (Suppl) :124 130[4]任麗娟，張嵐，趙天德，等.葉下珠對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用[J].中日 友好醫(yī)院學(xué)報(bào)，1996，10 (3) 193 196[5]仲英，左春旭，李風(fēng)琴，等.葉下珠化學(xué)成分及其抗乙肝病毒活性的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，1998，23 (6) :363 364[6]鄭步平，鄭菲菲，濮偉.傣藥葉下珠肝片對(duì)脂肪肝患者血脂的影響[J].中國(guó)中 藥雜志，1998，23 (6) :363 36權(quán)利要求
一種從植物提取葉下珠素的制備方法，其特征在于采用大戟科植物葉下珠為原料，用95％乙醇常溫提取，減壓濃縮干后用60％乙醇復(fù)溶后用型號(hào)為HPD100大孔樹(shù)脂充分吸附，再用80％乙醇解析收集洗脫液，濃縮至干用乙酸乙酯溶解后上硅膠柱，用石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫得葉下珠素粗品，葉下珠素粗品再用石油醚重結(jié)晶得到高純度的葉下珠素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的提取葉下珠素的制備方法，其特征在于所說(shuō)的原料為大戟科 植物葉下珠全草，也可以是葉片、根、莖和果實(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的提取葉下珠素的制備方法，其特征在于所說(shuō)的由葉下珠的干 粉，用乙醇常溫提取用95%乙醇作溶劑常溫提取2 3次，每次40min左右。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的提取葉下珠素的制備方法，用乙醇提取后在50°C下減壓濃縮 干后，用60%的乙醇溶液復(fù)溶后，定容得到葉下珠素濃度為0. 149mg/mL的樣品溶液，溶液 上型號(hào)為HPD100的大孔樹(shù)脂柱，用80%乙醇解析，收集解析液濃縮后即為富集葉下珠素的 混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的提取葉下珠素的制備方法，其特征在于所說(shuō)葉下珠素粗品 (3)的制備是將混合物(2)溶于3 5倍的乙酸乙酯溶液中，上硅膠柱用石油醚乙酸乙酯 (乙酸乙酯的體積百分含量為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35% )進(jìn)行梯度洗脫，得葉 下珠素粗品，葉下珠素粗品再用石油醚重結(jié)晶得到高純度的葉下珠素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所說(shuō)的重結(jié)晶中所用石油醚濃度為98%，結(jié)晶溫度為0-4°C，結(jié)晶時(shí) 間為24h左右。
全文摘要
一種從葉下珠中分離純化葉下珠素的方法，它是采用含水率80％左右的葉下珠全株，曬干，粉碎，加入乙醇常溫提取，過(guò)濾，重復(fù)一次，合并提取液，減壓濃縮，濃縮溶液上型號(hào)為HPD100大孔樹(shù)脂柱，上樣流速為1BV/h，上樣量為6.5BV，用80％乙醇解析，流速為2BV/h，解析液用量為9BV，解析率為76.7％，葉下珠素解析液濃縮干后，浸膏用乙酸乙酯溶解，在上清液中加入5g干硅膠，合并后減壓濃縮至干后，上裝好的硅膠柱，用石油醚乙酸乙酯梯度洗脫，合并葉下珠素含量高的流份，濃縮后放入0-4℃冰箱中冷藏，24h后出現(xiàn)白色絮狀沉淀，過(guò)濾得到葉下珠素的晶體。濾液減壓濃縮后繼續(xù)放入冰箱冷藏24h，過(guò)濾，合并晶體。將得到的晶體用石油醚加熱溶解，再放入冰箱冷凍至析出白色針狀結(jié)晶，濾出，真空干燥，得葉下珠素樣品。本操作工藝的主要特點(diǎn)為能從葉下珠中提取出高純度的葉下珠素，制備工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，能夠適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07C41/34GK101898940SQ20101011680
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者饒力群 申請(qǐng)人:饒力群