專利名稱：用捕捉糖鏈的分子純化/濃縮糖鏈的方法和分析糖鏈結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
—般而言，本發(fā)明涉及可用于分離、濃縮、純化和分析糖鏈或含糖鏈物質(zhì)(例如糖蛋白和糖脂)的物質(zhì)。本發(fā)明還涉及使用這類物質(zhì)分離、濃縮、純化和分析(例如通過質(zhì)譜法)糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的方法、設(shè)備和系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及使用通過本發(fā)明的方法純化的糖鏈組合物的藥物(例如疫苗)、試劑、糖鏈陣列(sugar chain array)。本發(fā)明還涉及使用通過本發(fā)明的方法純化的糖鏈組合物的診斷、治療、區(qū)分方法。
背景技術(shù)：
糖鏈?zhǔn)且环N總稱，包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖、N-乙?；咸前贰-乙?；肴樘前贰⑼僖核岷推渲袉翁?為其衍生物)通過糖苷鍵連接的分子。糖鏈包括各種物質(zhì)并且與活生物體的各種功能有關(guān)。通過電泳分析糖鏈?zhǔn)菑V泛公知的用于研究糖鏈的功能或分析其結(jié)構(gòu)等的技術(shù)(例如，參見日本國家階段PCT未審公開號(hào)5-500563)。該方法使所分析的糖鏈的遷移方式變得直觀。 使用半干印跡轉(zhuǎn)移裝置將糖鏈從電泳凝膠上轉(zhuǎn)移至薄膜上的方法也是公知的(例如，參見日本國家階段PCT未審公開號(hào)5-503146)。在該方法中，在熒光檢測后將通過電泳分離的糖鏈再轉(zhuǎn)移至PVDF (聚偏氟乙烯)的帶負(fù)電荷的衍生物等的薄膜上以便分析膜上的糖鏈。根據(jù)這種方式，通過使糖鏈與不受蛋白質(zhì)或脂質(zhì)影響的凝集素或抗體反應(yīng)、將糖鏈轉(zhuǎn)至薄膜上可以對糖鏈進(jìn)行檢測，這些糖鏈僅在與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)結(jié)合時(shí)才與凝集素或抗體反應(yīng)。還可以從薄膜上釋放糖鏈帶并對糖鏈應(yīng)用質(zhì)譜。然而，在這種方法中，轉(zhuǎn)移是通過電泳轉(zhuǎn)移進(jìn)行的。因此，帶電荷的糖鏈易于通過薄膜且結(jié)果是轉(zhuǎn)移的糖鏈量很少。因此，該方法不適合于精確的定量測定和分析。 自然界中廣泛存在的復(fù)雜碳水化合物的糖鏈?zhǔn)巧矬w的重要組分，它們在細(xì)胞間的相互作用中發(fā)揮重要作用這一點(diǎn)正變得越來越明顯。因此，已經(jīng)研發(fā)了用于分析少量糖鏈結(jié)構(gòu)的各種技術(shù)。在這些技術(shù)中，將釋放糖鏈、分離和純化糖鏈、標(biāo)記糖鏈等的步驟酌情進(jìn)行組合。然而，這類步驟需要繁瑣的過程。特別是在釋放后用于分離和純化混合物中所包含的少量糖鏈的方法是困難的且需要大量經(jīng)驗(yàn)。通常使用的方法包括離子交換樹脂、反相色譜法、活性炭、凝膠過濾色譜法等。然而，這些分離方法并非特異性識(shí)別糖的方法。因此，其它組分(如肽或蛋白質(zhì))的污染相當(dāng)嚴(yán)重。此外，回收率隨糖鏈結(jié)構(gòu)的不同而改變。最后，需要通過NMR光譜或MS光譜進(jìn)行鑒定以獲得有關(guān)得到的糖的可靠信息。特別地，使用MS光譜的方法是一種用于糖鏈分析的有效方法，因?yàn)槭褂眉{克-微克級的少量即可確定分子量。還提出了可以不使用MS而便利地確定糖鏈結(jié)構(gòu)的方法。 用于分析糖蛋白等的糖鏈結(jié)構(gòu)的方法包括通過使用如下原理分析未知樣品的糖鏈結(jié)構(gòu)的方法當(dāng)糖蛋白的糖鏈被釋放、然后被分離并用液相色譜法進(jìn)行分析時(shí)，通過將其洗脫特性與已知糖鏈的洗脫特性進(jìn)行比較可觀察到該糖鏈結(jié)構(gòu)的洗脫特性。通常使用的方法包括離子交換樹脂、反相色譜法、活性炭、凝膠過濾色譜法等。然而，這些分離方法并非特異性識(shí)別糖的方法。因此，其它組分(如肽或蛋白質(zhì))的污染相當(dāng)嚴(yán)重。此外，回收率隨糖
鏈結(jié)構(gòu)的不同而改變。此外，需要通過NMR光譜或MS光譜進(jìn)行鑒定以證實(shí)結(jié)構(gòu)。特別地，使用MS光譜的方法是一種用于糖鏈分析的有效方法，因?yàn)槭褂眉{克-微克級的少量即可確定分子量。還提出了可以不使用MS而便利地確定糖鏈結(jié)構(gòu)的方法。 還存在應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)的方法。這類方法包括使用二維HPLC的方法(例如，參見Anal. Biochem. ， 171， 73 (1988) Tomitani等)，其中將兩類模式的HPLC進(jìn)行了組合；和其中預(yù)先用混合酶系列如外切糖苷酶等處理樣品并通過HPLC分析處理的樣品以測定糖鏈結(jié)構(gòu)的方法(例如，參見Chemistry and Living Organism 32(10)661(1994)，Konishi等)。在這些方法中，可以通過進(jìn)行糖鏈選擇性化學(xué)反應(yīng)和將糖鏈進(jìn)行熒光素標(biāo)記來檢測糖鏈。在兩種方法中，均根據(jù)HPLC色譜圖中所示的保留時(shí)間來確定糖鏈結(jié)構(gòu)。另一方面，還報(bào)導(dǎo)了使用固定有具備糖識(shí)別能力的凝集素的柱的分析方法(例如，參見Anal.Biochem. ，164， 374(1987)Harada等)。 然而，使用HPLC法的分析方法存在下列問題(1) 一次只能分析一個(gè)樣品，因此不能同時(shí)分析多個(gè)樣品；(2)HPLC的條件設(shè)定非常靈敏并且保留時(shí)間可能有偏差且可能不正確；(3)當(dāng)與柱后反應(yīng)器或柱前反應(yīng)器組合時(shí)HPLC會(huì)消耗大量試劑；(4)當(dāng)使用固定有凝集素的柱時(shí)，吸附糖肽可能會(huì)被凝集素與糖的親和性改變所影響；和(5)糖鏈必須用熒光素、放射性同位素等標(biāo)記，因此耗時(shí)耗力。 此外，已經(jīng)嘗試了通過使糖鏈固定在固相上而進(jìn)行分析的方法。然而，固定具有高親水性的糖鏈在技術(shù)上是困難的。因此，提出了直接固定糖鏈的方法。這類方包括例如通過利用糖鏈的還原末端的酰胺鍵固定在氨基板(amino plate)上的方法(例如，參見0' Shannessy等，Anal. Chemistry, 1990,91， 1-8);使糖鏈高度聚合以使糖鏈本身具有疏水性并吸附在板上的方法(例如，參見日本未審公開No. 62-212568);和其中糖鏈被生物素化并利用抗生物素蛋白與生物素之間的強(qiáng)親和性將糖鏈固定在結(jié)合有抗生物素蛋白的固相上的方法。 然而，將糖鏈固定在固相如板上的方法存在問題，固定率降低、操作繁瑣且因預(yù)處理糖鏈和使用縮合劑固定而需要較長時(shí)間，并且由于同時(shí)存在污染物而傾向于發(fā)生非特異性吸附。近來，提出了通過使用表面等離振子共振的分析方法來分析糖鏈的方法。然而，由于使用昂貴的特定設(shè)備而難以得到廣泛應(yīng)用。 關(guān)于將用糖鏈用酶如半乳糖氧化酶氧化、然后偶聯(lián)在引入了酰肼基的固體基質(zhì)如纖維素、凝膠等上的方法的報(bào)導(dǎo)有許多實(shí)例(例如，參見O'Shannessy等，Anal. Chemistry,1990,91， 1-8)。在該方法中，存在一個(gè)需要額外費(fèi)力的氧化糖鏈的過程。此外，如果不氧化糖鏈，則引入了酰肼基的纖維素或凝膠就無法充分反應(yīng)。該反應(yīng)因糖鏈的不同而異。有時(shí)，該反應(yīng)根本不發(fā)生，這取決于糖鏈的種類。 已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了用于糖肽有機(jī)合成的便利方法(例如，參見Stefano E.Cervigni，Pascal Dumy，Manfred Mutter Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ， 1996,35， 1230—1232)。然而，該方法中所用的利用對糖鏈的特異性的化學(xué)反應(yīng)旨在獲得新的糖鏈共聯(lián)體產(chǎn)物。關(guān)于對未知糖鏈樣品的糖鏈靶向分離、純化和分析的特異性載體物質(zhì)尚無報(bào)導(dǎo)實(shí)例。此外，該方法中所用的肽可以與固體支持物等結(jié)合，但反應(yīng)形式是吸附且不發(fā)生相轉(zhuǎn)變。這意味著該實(shí)例中所結(jié)合的肽未與固體支持物相結(jié)合。因此，當(dāng)結(jié)合的肽類與大量過量溶劑接觸時(shí)，它們被釋放。因此，即使使用該方法中所用的肽，也基本上不可能進(jìn)行純化、分離、分析等。制備需要與支持物的穩(wěn)固結(jié)合的裝置如糖鏈芯片(chip)也是不可能的。 如上所述，能夠直接分離和分析糖鏈而不考慮其類型的技術(shù)尚不存在。這類技術(shù)
在后基因組時(shí)代和后蛋白質(zhì)組(post-proteomics)時(shí)代極為重要和需要。 本發(fā)明的目的是提供可以與糖鏈特異性結(jié)合而與糖鏈類型無關(guān)的物質(zhì)。本發(fā)明的
另一個(gè)目的是提供有效地和/或忠實(shí)于其實(shí)際狀態(tài)地分離、純化、濃縮或分析糖鏈或含糖
鏈物質(zhì)的方法及其所用的系統(tǒng)和設(shè)備。本發(fā)明的另一個(gè)目的是以反映出內(nèi)含物比例的形式
利用樣品中天然存在的糖鏈組分。

發(fā)明內(nèi)容
通過提供可以與糖鏈特異性地結(jié)合的物質(zhì)已經(jīng)解決了與本發(fā)明相關(guān)的上述問題。
該物質(zhì)基本上解決了所有上述問題，因?yàn)樗鼉?yōu)選地對糖鏈而言沒有差異。 因此，本發(fā)明提供了在一步或兩步中有效地將來源于生物樣品的復(fù)雜碳水化合物
的糖鏈在水性溶液中固定在高分子載體上、便利地對糖鏈組合物進(jìn)行分級分離并有效地測
定糖鏈結(jié)構(gòu)的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，分析所需的一系列反應(yīng)可以用常規(guī)檢測設(shè)備有效
地進(jìn)行。可根據(jù)本發(fā)明的方法分級分離的糖鏈可以是存在于細(xì)胞膜最外表面上的糖鏈、組
織塊或其節(jié)段的糖鏈和細(xì)菌、病毒的糖鏈等。根據(jù)本發(fā)明的方法，這類分析所需的預(yù)處理可
以有效進(jìn)行。此外，可以無需技巧而處理很多少量樣品。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是糖鏈分離方法和/或純化方法和/或濃縮方法，其包括下列新步驟a)在水和/或含水的有機(jī)溶劑和/或有機(jī)溶劑中使糖鏈與活性載體結(jié)合；b)從液相中分離步驟a)中結(jié)合的糖鏈和載體；和c)通過以化學(xué)或物理方式裂解步驟b)中分離的化合物或通過使用酶從液相中基本上分離出糖鏈，其中活性載體的官能團(tuán)為羥基氨基、N-烷基羥基氨基、酰肼基、氨基硫脲基和半胱氨酸殘基。
如上所述，本發(fā)明提供了 (1)可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)。 (2) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其中該物質(zhì)具有的與糖鏈的相互作用水平大大高于不包括糖鏈的所有物質(zhì)的相互作用水平。
(3) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其以預(yù)定水平或更高水平與任意糖鏈特異性地發(fā)生相互作用。
(4) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其中當(dāng)該物質(zhì)接觸使與非糖鏈物質(zhì)的非特異性相互作用解離的條件時(shí)，該物質(zhì)保持與至少一定量糖鏈的特異性相互作用。 (5) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其中該物質(zhì)與糖鏈之間的相互作用水平使得在MALDI-TOF中進(jìn)行激光照射時(shí)的必需解離能為至少5eV。 (6) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其可以以處于最大值小于或等于IO倍最小值的范圍內(nèi)的水平與任意糖鏈特異性地發(fā)生相互作用。
(7) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其中糖鏈包括氧化的糖鏈和未氧化的糖鏈。
(8) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其可以與支持物結(jié)合。
5
(9) (8)項(xiàng)的物質(zhì)，其中至少一部分支持物和物質(zhì)可發(fā)生相轉(zhuǎn)變。
(10) (8)項(xiàng)的物質(zhì)，其中所述支持物在室溫下為固體。
(11) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其可以用作支持物。
(12) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其中該物質(zhì)包含可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)。
(13) (12)項(xiàng)的物質(zhì)，其中所述流體基本上不包括含有酮基的物質(zhì)。
(14) (12)項(xiàng)的物質(zhì)，其中所述流體選自水性溶液、有機(jī)溶劑和它們的混合物。
(15) (12)項(xiàng)的物質(zhì)，其中所述流體相包括水性溶液。 (16) (12)項(xiàng)的物質(zhì)，其中所述官能團(tuán)選自羥基氨基、N-烷基羥基氨基、酰肼基、氨 基硫脲基和半胱氨酸殘基。
(17) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其中所述的相互作用包括共價(jià)鍵。
(18) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其中所述的相互作用包括肟鍵、腙鍵、硫代半腙
(thiosemihydrazone)鍵、全氫化噻嗪環(huán)形成或噻唑烷環(huán)形成。 (19) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其由式(I) :X-Y-Z(I)表示[此處，X為下式所示的基團(tuán)
<formula>formula see original document page 6</formula>(此處，X1為可以被取代的亞烷基或可以被取代的亞鏈烯基，X2為氧原子或硫原 子，X3為氧原子或硫原子，X4為亞甲基或亞乙基，R1為氫原子或烷基，且R2和R3獨(dú)立地為氫 原子或烷基)；
Y為單鍵；任選地被取代的亞烷基，其中可以插入至少一個(gè)選 自-0-、 -S-、 -S-S-、 -N(Ra)-C( = O)-、 -C( = O)-N(Rb)-和可以被取代的亞苯基的基團(tuán); 或任選地被取代的亞鏈烯基，其中可以插入至少一個(gè)選自-0-、 -S-、 -S-S-、 -N(Ra)-C(= 0)-、-C( = O)-N(Rb)-和可以被取代的亞苯基的基團(tuán)(此處，Ra和Rb獨(dú)立地為氫原子或烷 基)； Z為下式所示的基團(tuán)
R4 I
,N
""N-^ 、C三C—C三C——73
Z1
R4
N\ /《人Z
1 R5(此處，Z1為氧原子或硫原子，Z2和Z3獨(dú)立地為任選地被取代的亞烷基，其中可以 插入亞苯基；或任選地被取代的亞鏈烯基，其中可以插入亞苯基，f為氧原子或硫原子，R4 和R5獨(dú)立地為氫原子或烷基)]。
(20)通過使(19)項(xiàng)的物質(zhì)聚合而獲得的物質(zhì)。 (21) (20)項(xiàng)的物質(zhì)，其中所述的聚合通過UV-照射引發(fā)。 (22) (20)項(xiàng)的物質(zhì)，其通過使式(I)所示化合物的Z位置物理吸附在支持物上獲 得的單分子層聚合而得到。
(23) (1)項(xiàng)的物質(zhì)，其為通過使下述化合物聚合而獲得的共聚物，
式(I) :X-Y-Z(I)所示的化合物
[此處，X為下式所示的基團(tuán)
<formula>formula see original document page 8</formula>(此處，X1為可以被取代的亞烷基或可以被取代的亞鏈烯基，X2為氧原子或硫原 子，X3為氧原子或硫原子，X4為亞甲基或亞乙基，R1為氫原子或烷基，且R2和R3獨(dú)立地為氫 原子或烷基)； Y為單鍵；任選地被取代的亞烷基，其中可以插入至少一個(gè)選 自-0-、 -S-、 -S-S-、 -N(Ra)-C( = O)-、 -C( = O)-N(Rb)-和可以被取代的亞苯基的基團(tuán); 或任選地被取代的亞鏈烯基，其中可以插入至少一個(gè)選自-0-、 -S-、 -S-S-、 _N(Ra)-C(= 0)-、-C( = O)-N(Rb)-和可以被取代的亞苯基的基團(tuán)(此處，Ra和Rb獨(dú)立地為氫原子或烷 基)； Z為下式所示的基團(tuán)
<formula>formula see original document page 9</formula>(此處，Z1為氧原子或硫原子，Z2和Z3獨(dú)立地為任選地被取代的亞烷基，其中可以 插入亞苯基；或任選地被取代的亞鏈烯基，其中可以插入亞苯基，f為氧原子或硫原子，R4 和RS獨(dú)立地為氫原子或烷基)];禾口
式(II) :A142(11)所示的化合物


<formula>formula see original document page 9</formula>
(此處，A3為亞烷基，且R6為烷基)；且
A2為下式所示的基團(tuán)
<formula>formula see original document page 9</formula>

Y 、v ,
(此處，A4為亞烷基，且A5為下式所示的基團(tuán)
<formula>formula see original document page 9</formula>

(A6為亞烷基，A7為氧原子或硫原子，且R7為氫原子或烷基))] (24) (23)項(xiàng)的物質(zhì)，其中所述的聚合通過UV-照射引發(fā)。
(25) (23)項(xiàng)的物質(zhì)，其中式(II)所示的化合物的摩爾分?jǐn)?shù)為0. 1_0. 9。 (26) (23)項(xiàng)的物質(zhì)，其通過使式(I)所示化合物的Z位置和式(II)所示化合物的
A2位置物理吸附在支持物上獲得的單分子層聚合而得到。 (27) (23)項(xiàng)的物質(zhì)，其通過使包含式(I)所示的化合物和式(II)所示的化合物的
混合物的水分散體或流延薄膜聚合而得到。 (28)包含可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)的脂質(zhì)。 (29)捕捉糖鏈的載體，其包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)。 (30) (29)項(xiàng)的捕捉糖鏈的載體，其還包括支持物。 (31)捕捉糖鏈的載體，其中(20)或(23)項(xiàng)的物質(zhì)被轉(zhuǎn)移至支持物上。 (32) (30)項(xiàng)的捕捉糖鏈的載體，其中所述的支持物為交聯(lián)聚合物或脂質(zhì)膜。 (33) (30)項(xiàng)的捕捉糖鏈的載體，其中所述的支持物包含可光聚合的脂質(zhì)衍生物。 (34) (30)項(xiàng)的捕捉糖鏈的載體，其中所述的支持物不溶于有機(jī)溶劑。 (35) (30)項(xiàng)的捕捉糖鏈的載體，其中所述的支持物為自閉性脂質(zhì)膜。 (36) (33)項(xiàng)的捕捉糖鏈的載體，其中可光聚合的脂質(zhì)衍生物含有式
I-C e c-c e c-所示的聯(lián)乙炔。 (37) (36)項(xiàng)的捕捉糖鏈的載體，其中可光聚合的脂質(zhì)衍生物通過紫外線聚合。 (38) (30)項(xiàng)的捕捉糖鏈的載體，其中所述的支持物為二維延伸的。 (39) (38)項(xiàng)的捕捉糖鏈的載體，其中所述的支持物為流延薄膜或單分子層。 (40)合成可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的方法，其包括以下步驟 A)提供可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)；禾口 B)使所述官能團(tuán)與所需物質(zhì)結(jié)合。 (41) (40)項(xiàng)的方法，其中通過酯鍵或酰胺鍵實(shí)現(xiàn)對所需物質(zhì)的結(jié)合。 (42)分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的方法，其包括以下步驟 a)在捕捉糖鏈的載體可以與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)反應(yīng)的條件下，使包含可以與糖鏈
特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體在流體相中與樣品接觸； b)從流體相中離析捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的復(fù)合物；禾口 c)使所述復(fù)合物接觸捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)之間的相互作用至少
部分被消除的條件。 (43) (42)項(xiàng)的方法，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。 (44) (42)項(xiàng)的方法，其中步驟a) 、b)和c)在相同容器中進(jìn)行。 (45) (42)項(xiàng)的方法，其中步驟b)包括進(jìn)行離心分離。 (46) (42)項(xiàng)的方法，其還包括在步驟a)之前釋放樣品中的醛基的步驟。 (47) (46)項(xiàng)的方法，其中釋放醛基的步驟包括通過酶處理和/或化學(xué)方法進(jìn)行給
質(zhì)子反應(yīng)。 (48) (46)項(xiàng)的方法，其中釋放醛基的步驟包括用糖苷酶處理和/或肼解。 (49) (42)項(xiàng)的方法，其還包括以下步驟 d)使樣品接觸將含糖鏈物質(zhì)分離成糖鏈和剩余部分的條件。 (50)用于分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的設(shè)備，其包括 a)樣品導(dǎo)入部分；
10
b)具有可以容納流體相的空間的容器；禾口 c)包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體； 所述容器與樣品導(dǎo)入部分可進(jìn)行流體交換。 (51) (50)項(xiàng)的設(shè)備，其中可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)與支持物結(jié)合 且該支持物與容器結(jié)合。 (52)用于分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的系統(tǒng)，其包括 A)—種設(shè)備，其包括 a)樣品導(dǎo)入部分； b)具有可以容納流體相的空間的容器；禾口 c)包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體； 所述容器與樣品導(dǎo)入部分可進(jìn)行流體交換； B)離析流體相中捕捉糖鏈的載體與糖鏈的復(fù)合物的手段；禾口 C)使所述復(fù)合物接觸捕捉糖鏈的載體與糖鏈之間的相互作用至少部分被消除的 條件的手段。 (53) (52)項(xiàng)的系統(tǒng)，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。 (54) (52)項(xiàng)的系統(tǒng)，其中手段C)為釋放醛基的手段。 (55) (52)項(xiàng)的系統(tǒng)，其中手段C)為釋放醛的酶或化學(xué)物質(zhì)。 (56) (52)項(xiàng)的系統(tǒng)，其還包括 D)使樣品接觸將含糖鏈物質(zhì)分離成糖鏈和剩余部分的條件。 (57)制備用于分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的設(shè)備的方法，其包 括以下步驟 a)提供可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)； b)使可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)與支持物發(fā)生相互作用而產(chǎn)生捕 捉糖鏈的載體；禾口 c)將捕捉糖鏈的載體固定在容器上。 (58) (57)項(xiàng)的方法，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。 (59)分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的方法，其包括以下步驟 a)在捕捉糖鏈的載體可以與糖鏈反應(yīng)的條件下，使包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生
相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體在流體相中與樣品接觸； b)使捕捉糖鏈的載體和樣品接觸所需的嚴(yán)格條件；禾口 c)鑒定與捕捉糖鏈的載體相互作用的物質(zhì)。 (60) (59)項(xiàng)的方法，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。 (61) (59)項(xiàng)的方法，其中所述的樣品來源于患病或預(yù)計(jì)患病的受試者。 (62) (59)項(xiàng)的方法，其中步驟a)-c)在支持捕捉糖鏈的載體的芯片上進(jìn)行。 (63) (59)項(xiàng)的方法，其中捕捉糖鏈的載體在芯片上排列成陣列。 (64) (59)項(xiàng)的方法，其中鑒定步驟c)包括質(zhì)譜分析。 (65)制備包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品的糖鏈復(fù)制物的方法，其包括以下步驟 a)將可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)定位在二維延伸的支持物的表面 上并使未定位有所述物質(zhì)的表面與固體箔接觸；禾口
b)使包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品與固體箔接觸。
(66) (65)項(xiàng)的方法，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。
(67) (65)項(xiàng)的方法，其中固體箔為透明的。 (68) (65)項(xiàng)的方法，其包括在固體箔上標(biāo)記樣品的所需特性的步驟。 (69) (68)項(xiàng)的方法，其中所需特性為損傷。 (70)包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品的糖鏈復(fù)制物，其包括 a)固體箔; b)定位有可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的二維延伸的支持物，該支持 物用于與固體箔發(fā)生相互作用；禾口 c)來源于包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品的組分，該組分被可以與糖鏈特異性地發(fā)生 相互作用的物質(zhì)捕捉。
(71) (70)項(xiàng)的糖鏈復(fù)制物，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。
(72) (70)項(xiàng)的糖鏈復(fù)制物，其中用與樣品的所需特性相關(guān)的標(biāo)記來標(biāo)記固體箔。
(73)分析包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品上的糖鏈的方法，其包括以下步驟 a)將可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)定位在二維延伸的支持物上的表
面上并使未定位有所述物質(zhì)的表面與固體箔接觸； b)使包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品與固體箔接觸；禾口 c)分析存在于固體箔表面上的糖鏈。
(74) (73)項(xiàng)的方法，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。 (75) (73)項(xiàng)的方法，其中分析步驟包括使固體箔表面離子化、然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。
(76) (73)項(xiàng)的方法，其還包括在固體箔上標(biāo)記樣品的所需特性并使該標(biāo)記與通過 質(zhì)譜分析鑒定的糖鏈相關(guān)聯(lián)的步驟。 (77)用于分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的設(shè)備，其包括 a)包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體；禾口 b)鑒定糖鏈的手段。 (78) (77)項(xiàng)的設(shè)備，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。 (79)用于分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的裝置，其包括定位有可以與糖鏈特異 性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的支持物。 (80) (79)項(xiàng)的裝置，其中可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)以陣列方式排 列在支持物上。 (81) (79)項(xiàng)的裝置，其具有芯片形狀。 (82)診斷或區(qū)分受試者的方法，其包括以下步驟 a)使用(79)項(xiàng)的裝置分析來源于受試者的樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)。 (83) (82)項(xiàng)的方法，其中分析步驟包括檢測針對糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的抗體和/或
凝集素的存在。 (84)用于分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的系統(tǒng)，其包括 a)包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體； b)使捕捉糖鏈的載體和樣品接觸所需的嚴(yán)格條件的手段；禾口 c)鑒定糖鏈的手段。
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(85) (84)項(xiàng)的系統(tǒng)，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。
(86) (84)項(xiàng)的系統(tǒng)，其中鑒定糖鏈的手段為質(zhì)譜分析儀。 (87)制備用于分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的設(shè)備的方法，其包括以下步驟
a)提供可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)；禾口 b)使可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)與支持物發(fā)生相互作用而產(chǎn)生捕 捉糖鏈的載體。
(88) (87)項(xiàng)的方法，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。
(89)制備糖鏈陣列的方法，其包括以下步驟
a)提供支持物； b)將可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)以所需的排列方式進(jìn)行定位。
(90)分析與樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的方法，其包括以下步 驟 a)使包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體在流體相 中與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)發(fā)生相互作用以便固定； b)在與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)可以與糖鏈反應(yīng)的條件下，使捕捉糖 鏈的載體與樣品接觸； c)使捕捉糖鏈的載體與樣品的混合物接觸所需的嚴(yán)格條件；禾口 d)鑒定與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)。
(91) (90)項(xiàng)的方法，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。
(92) (90)項(xiàng)的方法，其中與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)為抗體或凝集素。 (93) (90)項(xiàng)的方法，其中所述的樣品來源于預(yù)計(jì)具有損傷的受試者。
(94) (90)項(xiàng)的方法，其還包括以下步驟 e)將抗體或凝集素與和其存在有關(guān)的疾病、病癥、疾病損害或疾患相關(guān)聯(lián)。
(95)用于分析與樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的裝置，其包括
a)包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的捕捉糖鏈的載體，其中糖鏈或含糖鏈 物質(zhì)通過特異性相互作用固定在載體上。 (96) (95)項(xiàng)的裝置，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。
(97)用于分析與樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的系統(tǒng)，其包括
a)包括捕捉糖鏈的載體的裝置，所述的捕捉糖鏈的載體包含可以與糖鏈特異性地 發(fā)生相互作用的物質(zhì)，其中糖鏈或含糖鏈物質(zhì)通過特異性相互作用固定在載體上；
b)樣品導(dǎo)入部分； c)使捕捉糖鏈的載體與樣品的混合物接觸所需的嚴(yán)格條件的手段；禾口
d)鑒定與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的手段。
(98) (97)項(xiàng)的系統(tǒng)，其中捕捉糖鏈的載體還包括支持物。
(99)具有增加的糖鏈含量的糖鏈組合物，其通過使包含糖鏈的樣品與可以與糖鏈 特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)接觸、然后分離相互作用的樣品中的糖鏈而得到。
(100) (99)項(xiàng)的糖鏈組合物，其中可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)可以 以一定水平或更高水平與任意糖鏈特異性地發(fā)生相互作用。
(101)包含(99)項(xiàng)的糖鏈組合物的藥物。
(102)包含(99)項(xiàng)的糖鏈組合物的食品。
(103)包含(99)項(xiàng)的糖鏈組合物的化妝品。
(104)包含(99)項(xiàng)的糖鏈組合物的聚合物材料。
(105)包含(99)項(xiàng)的糖鏈組合物的農(nóng)藥。
(106)包含(99)項(xiàng)的糖鏈組合物的檢測試劑盒。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的示意圖。
圖2是表示本發(fā)明的可光聚合的羥基氨基脂質(zhì)的合成途徑的示意圖。
圖3是表示本發(fā)明的捕捉糖鏈的聚合物的制備方法的示意圖。
圖4是本發(fā)明的捕捉糖鏈的聚合物納米粒的電子顯微鏡照片。
圖5是使用捕捉糖鏈的聚合物的分離和純化過程的示意圖。 圖6是表示通過反相系統(tǒng)高效液相色譜法(HPLC)得到的關(guān)于純化的來源于人的 免疫球蛋白的分析結(jié)果圖。 圖7是表示由圖6的HPLC峰強(qiáng)度計(jì)算得到的糖鏈結(jié)構(gòu)比例圖。 圖8是表示通過質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS)和HPLC法得到的純化的來源于人的免疫
球蛋白的每一種糖鏈的標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度比較的示意圖。 圖9是表示用捕捉糖鏈的納米粒純化的卵清蛋白的糖鏈圖譜的示意圖。圖9的 主峰的m/z根據(jù)升序排列為1543. 6、 1705. 6、 1746. 5、 1908. 6、 1949. 3、2111. 7、2152. 8和 2313. 8。 圖10是表示圖9的樣品用Girard T試劑處理后MALDI-TOF光譜的示意圖。圖 10的主峰的m/z根據(jù)升序排列為1024. 612、 1227. 744、 1348. 818、 1389. 828、 1430. 862、 1510. 877U592. 932、1633. 932U754. 925、1837. 016、1958. 005、1999. 046、2040. 081、 2153. 026、2203. 083、2244. 126、2406. 169和2568.221。 圖11是表示用捕捉糖鏈的納米粒純化的運(yùn)鐵蛋白的糖鏈圖譜的示意圖。圖11的 主峰的m/z根據(jù)升序排列為1665. 3和1955. 4。 圖12是表示圖11的樣品用Girard T試劑處理后MALDI-TOF光譜的示意圖。圖 12的主峰的m/z根據(jù)升序排列為1754. 491和2120. 397。 圖13是表示通過用捕捉糖鏈的納米粒純化人血清獲得的糖鏈圖譜的示意圖。圖 13的主峰的m/z為1664. 689。 圖14是表示顯示圖13的樣品用Girard T試劑處理后捕捉糖鏈的聚合物可以特異 性地結(jié)合糖鏈的MALDI-TOF光譜的示意圖。圖14的主峰的m/z根據(jù)升序排列為1755. 011、 1900.783、2120. 005、2305. 785和2483. 654。 圖15表示顯示捕捉糖鏈的聚合物可以與糖鏈特異性結(jié)合的質(zhì)譜結(jié)果。
圖16是表示通過澆鑄法使糖鏈分離和純化過程縮短的示意圖。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式 在下文中描述了本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解除非另有說明，否則在整個(gè)說明書中單數(shù)形式 的表達(dá)方式也包括復(fù)數(shù)形式的概念。此外，應(yīng)當(dāng)理解除非另有說明，否則本文中所用的術(shù)語 具有本領(lǐng)域中一般涉及的含義。
(術(shù)語) 下文列出了本文中所用的術(shù)語的定義。 本文中所用的"糖鏈"指的是通過串連的一個(gè)或多個(gè)單元糖(單糖和/或其衍生 物)形成的化合物。當(dāng)存在串連的兩個(gè)或多個(gè)單元糖時(shí)，單元糖彼此通過脫氫縮合而經(jīng)糖 苷鍵結(jié)合。這類糖鏈包括生物體內(nèi)包括的各種糖鏈，例如多糖(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、 巖藻糖、木糖、^乙?；咸前稪-乙?；肴樘前贰⑼僖核嵋约八鼈兊膹?fù)合物和衍生物)、 分解的多糖、從復(fù)合的生物體分子分解得到的或來源于它們的糖鏈，如糖蛋白、蛋白聚糖、 糖胺聚糖和糖脂等，但不限于這些。因此，本文中所用的術(shù)語糖鏈與"多糖"、"糖類"和"碳 水化合物"可以互換使用。此外，除非特別說明，否則本文中所用的"糖鏈"可以包括糖鏈和 含糖鏈物質(zhì)。 本文中所用的"單糖"指的是不能水解成多個(gè)簡單分子且由式CnH2n0n表示的化合 物。其中n = 2、3、4、5、6、7、8、9和10的化合物分別指的是二糖、丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚 糖、辛糖、壬糖和癸糖。 一般來說，這些化合物相當(dāng)于直鏈多元醇的醛或酮。前者稱作醛糖， 而后者稱作酮糖。 本文中所用的"單糖衍生物"指的是作為單糖上的一個(gè)或多個(gè)羥基被另一個(gè)取代 基取代的結(jié)果產(chǎn)生的不屬于單糖范圍的物質(zhì)。這類單糖衍生物包括含有羧基的糖(例如 含有被氧化的C-l位且成為羧酸的醛糖酸(例如含有被氧化的D-葡萄糖的D-葡糖酸)； 含有末端上的C原子且變成羧酸的糖醛酸(例如含有被氧化的D-葡萄糖的D-葡糖醛酸)； 含有氨基或氨基衍生物(例如乙?；被?的糖(例如N-乙?；?D-葡糖胺、N-乙酰 基-D-半乳糖胺等)；含有氨基和羧基的糖(例如N-乙?；窠?jīng)氨酸(唾液酸)、N-乙酰 基胞壁酸等)；脫氧化的糖(例如2_脫氧-D-核糖)；包含硫酸基團(tuán)的硫酸化糖；包括磷酸 根基團(tuán)的磷酸化糖等，但不限于這些。含有通過與可形成半縮醛結(jié)構(gòu)的糖上的醇反應(yīng)形成 的縮醛結(jié)構(gòu)的糖苷也屬于單糖衍生物的范圍。 本文中所用的"含糖鏈物質(zhì)"指的是包含糖鏈和非糖鏈物質(zhì)的物質(zhì)。在生物體內(nèi) 發(fā)現(xiàn)了大量這類含糖鏈物質(zhì)，包括例如生物體內(nèi)包括的各種多糖；分解的多糖類；從復(fù)合 的生物體分子分解得到的或來源于它們的糖鏈，如糖蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和糖脂等， 但不限于這些。 本文中所用的"糖蛋白"包括例如酶、激素、細(xì)胞因子、抗體、疫苗、受體、血清蛋白 等，但不限于這些。 本文中所用的"不包含糖鏈的物質(zhì)"指的是根本不包含糖鏈或不包含可檢出量的 糖鏈的物質(zhì)。這類不包含糖鏈的物質(zhì)包括例如非糖鏈有機(jī)化合物，如單純蛋白質(zhì)、單純脂質(zhì) 等，但不限于這些。 本文中所用的對糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的"特異性"或"特異性的"指的是某一物質(zhì)的 特性。它意指該物質(zhì)可以與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)發(fā)生相互作用，但與糖鏈和含糖鏈物質(zhì)以外 的物質(zhì)發(fā)生相互作用的活性較小。 本文中所用的"與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用"指的是與不包含糖鏈的物質(zhì)相比 以更高的特異性與糖鏈發(fā)生相互作用的能力。優(yōu)選地，不包含糖鏈的這類物質(zhì)可以包括生 物體內(nèi)的物質(zhì)?？梢酝ㄟ^確定以下現(xiàn)象來證實(shí)該能力當(dāng)接觸使與非糖鏈物質(zhì)的非特異性 相互作用解離的條件時(shí)，與至少恒定量的糖鏈的特異性相互作用被保留。更具體地說，在以
15下情況下可以證實(shí)該能力在MALDI-TOF中用激光照射時(shí)糖鏈與對象物質(zhì)的結(jié)合復(fù)合物的 必需解離能為至少約5eV、優(yōu)選為至少約10eV且更優(yōu)選為至少約15eV，且當(dāng)在相似條件下 照射不包含糖鏈的物質(zhì)與對象物質(zhì)的復(fù)合物時(shí)，所述的相互作用受到顯著量和較大百分比 的破壞。 如本文中所用，當(dāng)"相互作用"用于描述兩種物質(zhì)時(shí)，它意指兩種物質(zhì)彼此產(chǎn)生作 用力。這類相互作用包括例如共價(jià)鍵、氫鍵、范德華力、離子相互作用、非離子相互作用、疏 水作用、靜電作用等，但不限于這些。優(yōu)選地，所述的相互作用為共價(jià)鍵。本文中所用的"共 價(jià)鍵"用于具有本領(lǐng)域中通常的含義，指的是當(dāng)兩個(gè)原子共有一對電子時(shí)形成的化學(xué)鍵。這 類共價(jià)鍵包括但不限于例如肟鍵、腙鍵、硫代半腙鍵、全氫化噻嗪環(huán)形成、噻唑烷環(huán)形成等。
本文中所用的相互作用等的"水平"指的是相互作用強(qiáng)度等的程度，也稱作"強(qiáng) 度"。它可用于測定對糖鏈的特異性。照此，例如當(dāng)在MALDI-TOF中進(jìn)行激光照射時(shí)，相互 作用水平為必需解離能。 本文中所用的"預(yù)定水平"指的是根據(jù)一定目標(biāo)設(shè)定的與糖鏈的特異性相互作用 的程度，可以是可用于測定對糖鏈特異性的任意水平。這類預(yù)定水平隨測定條件的不同而 改變，但是，例如可以為這樣的水平當(dāng)在MALDI-TOF中進(jìn)行激光照射時(shí)，必需解離能至少 為約5eV，優(yōu)選約10eV且更優(yōu)選約15eV。然而，所述水平并不限于這樣的水平。優(yōu)選地，這 類預(yù)定水平可以具有下限和上限。因此，例如可以優(yōu)選當(dāng)在MALDI-TOF中進(jìn)行激光照射時(shí) 必需解離能在約5-500eV、約10-100eV、約15_50eV等的范圍內(nèi)?；蛘?，如果以相關(guān)方式表 示，則最高水平與最低水平之差可以優(yōu)選在100倍、50倍、20倍、10倍、5倍、4倍、3倍、2倍 或1.5倍范圍內(nèi)。 本文中所用的最高至最低的相互作用水平"范圍"指的是用上述方法測定的相互 作用水平的最大值至最小值的范圍。最大值可以以最小值的倍數(shù)表示。數(shù)值越小，則特異 性越均一。 本文中所用的"MALDI-T0F(MS)"指的是基質(zhì)輔助激光解吸附電離_飛行時(shí)間(質(zhì) 譜儀)的縮寫。MALDI是由Tanaka等發(fā)現(xiàn)并由Hillenkamp等研發(fā)的一種方法(Karas M.， Hillenkamp， F. ， Anal. Chem. 1988， 60， 2299-2301)。在該方法中，在將樣品和基質(zhì)溶液混合 至(10—2-5X10—4) : l摩爾比后，使混合溶液在靶標(biāo)上干燥至結(jié)晶狀態(tài)。通過脈沖激光照射 給予基質(zhì)大量能量，從而使來源于樣品的離子如(M+H)+、 (M+Na)+等和來源于基質(zhì)的離子彼 此解離。甚至當(dāng)有少量磷酸緩沖液、Tris緩沖液、胍等污染時(shí)也能進(jìn)行分析。MALDI-TOF(MS) 使用MALDI基于飛行時(shí)間測定質(zhì)量。當(dāng)離子以一定加速電壓V被加速時(shí)，其中離子質(zhì)量為 m，離子速度為v，離子電荷數(shù)為z，基本電荷為e且離子飛行時(shí)間為t，可以通過公式m/z = 2eVt7L2表示離子的m/z。對于這類MALDI-T0F測定，可以使用Shimazu/Kratos的K0MPACT MALDI n/III等。當(dāng)進(jìn)行這類測定時(shí)，可以參照制造商提供的小冊子。MALDI-T0F測定所 用的激光照射的照射能在本文中稱作"解離能"。 本文中所用的"未氧化的糖鏈"指的是不包含氧化的單糖或氧化的單糖衍生物的 糖鏈。就單糖衍生物而言，未氧化的單糖衍生物優(yōu)選為其中來源于單糖的部分未被氧化的 單糖衍生物。 本文中所用的"氧化的糖鏈"指的是包含氧化的單糖和氧化的單糖衍生物的糖鏈。 氧化的單糖如上所述且可以為例如D-葡糖酸等，但不限于此。就單糖衍生物而言，氧化的糖鏈衍生物優(yōu)選為其中來源于單糖的部分被氧化的糖鏈。 當(dāng)指物質(zhì)的性質(zhì)時(shí)，本文中所用的"可以與支持物結(jié)合的"指的是物質(zhì)與支持物結(jié) 合的能力。 除非另有說明，否則本文中所用的"支持物"和"基質(zhì)"可以互換使用，當(dāng)用于支持 物質(zhì)時(shí)，它指的是可以在流體(特別是溶劑，如液體)存在下支持另一種物質(zhì)的材料(優(yōu)選 固體)。用于支持物的材料包括任何這樣的固體材料，它具有或衍生為具有通過共價(jià)鍵或非 共價(jià)鍵與本發(fā)明的物質(zhì)結(jié)合的性質(zhì)，但不限于此。優(yōu)選地，支持物在室溫(0°C -30°C )下為 固體。更優(yōu)選地，支持物在純化、濃縮、分離或分析的環(huán)境中保持固態(tài)。這類環(huán)境可以是在
低于ot:或3(rc或更高的溫度下。高溫可以優(yōu)選低于IO(TC。當(dāng)推定支持物與本發(fā)明的物
質(zhì)發(fā)生相互作用時(shí)，有利的是支持物與本發(fā)明的物質(zhì)的相互作用在有強(qiáng)酸存在下被維持，
至少部分相互作用、優(yōu)選一半或一半以上相互作用被維持，更優(yōu)選大部分相互作用被維持。
本文中所用的"基質(zhì)"可以指具有適宜形狀的支持物，如在用于糖鏈芯片時(shí)為薄片。 用作支持物的材料可以是能夠形成固體表面的任意材料，例如玻璃、硅石、硅、陶
瓷、二氧化硅、塑料、金屬(包括合金)、天然和合成的聚合物(例如聚苯乙烯、纖維素、脫乙
酰殼多糖、葡聚糖和尼龍)、脂質(zhì)等，但不限于這些材料。優(yōu)選地，支持物具有疏水性表面。支
持物可以通過多種不同類型的材料層形成。例如，可以使用多種無機(jī)絕緣材料，如玻璃、石
英玻璃、氧化鋁、藍(lán)寶石、鎂橄欖石、碳化硅、氧化硅、四氮化三硅等，但不限于這些材料。還
可以使用其它材料作為支持物，如有機(jī)材料，如聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、聚對苯二
甲酸乙二酯、不飽和聚酯、含氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏1，1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯
醇、聚乙烯醇縮乙醛、丙烯酰樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚樹
脂、尿素樹脂、環(huán)氧樹脂、蜜胺樹脂、苯乙烯_丙烯腈共聚物、丙烯腈丁二烯_苯乙烯共聚物、
有機(jī)硅樹脂、聚苯醚、聚砜等。在本發(fā)明中，還可以使用用于印跡的薄膜，如尼龍薄膜、硝酸
纖維素薄膜、PVDF薄膜等。當(dāng)使用尼龍薄膜時(shí)，可以使用便利的分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析。
為了分析具有高密度的物質(zhì)，優(yōu)選使用具有一定硬度的材料，如玻璃。例如，在一個(gè)實(shí)施方
案中，可以使用交聯(lián)脂質(zhì)體、交聯(lián)聚合物或非交聯(lián)聚合物作為支持物，但不限于此。支持物
可以是磁性的。如果支持物是磁性的，則易于利用磁性進(jìn)行純化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，
本發(fā)明所用的支持物可以是交聯(lián)脂質(zhì)體、交聯(lián)聚合物或非交聯(lián)聚合物且可以是能夠分散在
水或有機(jī)溶劑中、具有0. 001微米或更大且小于數(shù)百微米平均粒徑的微粒。 本發(fā)明的物質(zhì)可以與上述用作支持物的另一種物質(zhì)結(jié)合或者本發(fā)明的物質(zhì)自身
可以用作支持物。 本文中所用的"可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)"指的是具有在流體如水性溶 液中與醛基反應(yīng)并形成處于由糖鏈形成的環(huán)狀半縮醛型和非環(huán)狀醛型之間的平衡中的特 異性且穩(wěn)定的鍵的性質(zhì)的官能團(tuán)。這類官能團(tuán)可以為羥基氨基、N-烷基羥基氨基、酰肼基、 氨基硫脲基和半胱氨酸殘基，但不限于這些。優(yōu)選地，這類官能團(tuán)是羥基氨基。羥基氨基與 糖之間的連接模式(肟鍵)對酸而言特別弱。因此，有利的是易于進(jìn)行從捕捉糖鏈的載體 上裂解糖鏈的步驟。 本文中所用的"流體"可以為任意類型的流體，條件是它能提供本發(fā)明的物質(zhì)可以 與糖鏈發(fā)生相互作用的環(huán)境。優(yōu)選地，這類流體基本上不包括含酮基的物質(zhì)。因?yàn)槿绻?體包含含有大量酮基的物質(zhì)，則流體中的醛基與本發(fā)明的物質(zhì)就無法充分反應(yīng)。因此，不包括含酮基的物質(zhì)的實(shí)施方案并非必要的，但卻是優(yōu)選的。 因此，本文中所用的流體優(yōu)選是使糖達(dá)到環(huán)狀半縮醛型與非環(huán)狀醛型之間的平衡 的流體。這類流體可以是例如水性溶液、有機(jī)溶劑及其混合物，但不限于這些。優(yōu)選地，所 述的流體為水性溶液。 本文中所用的"交聯(lián)聚合物"指的是具有交聯(lián)鍵的聚合物?？梢酝ㄟ^使用例如交 聯(lián)劑、紫外線、電子束或放射線的方法產(chǎn)生交聯(lián)鍵。這類交聯(lián)聚合物可以是例如酚樹脂、尿 素樹脂、蜜胺樹脂、環(huán)氧樹脂、聚氨基甲酸酯、乙烯基酯樹脂、交聯(lián)聚苯乙烯、交聯(lián)橡膠、丙烯 酰胺聚合物等，但不限于這些。 本文中所用的"脂質(zhì)膜"指的是薄膜形式的脂質(zhì)。本文中所用的"脂質(zhì)"指的是極 不易溶于水而易溶于有機(jī)溶劑的形成生物體的一組物質(zhì)。脂質(zhì)包括各種有機(jī)化合物。通常， 脂質(zhì)包括長鏈脂肪酸及其衍生物或類似物。然而，在本說明書中，還包括生物體內(nèi)不溶于水 而易溶于有機(jī)溶劑的有機(jī)化合物類，如類固醇、類胡蘿卜素、萜類化合物、類異戊二烯、脂溶 性維生素等。脂質(zhì)為例如1)單純脂質(zhì)(其為脂肪酸和醇的酯且也可以稱作中性脂質(zhì)；例如 脂肪和油(三?；视?、蠟(高級醇的脂肪酸酯)、甾醇酯、維生素的脂肪酸酯等)；2)復(fù) 合脂質(zhì)(具有酯鍵或酰胺鍵且具有極性基團(tuán)的化合物，所述的極性基團(tuán)除了脂肪酸和醇之 外還有如磷酸、糖、硫酸、胺等，包括甘油磷脂、神經(jīng)磷脂、甘油磷脂、神經(jīng)鞘氨糖脂、具有c-p 鍵的脂質(zhì)、硫脂等)；3)衍生的脂質(zhì)(通過水解脂溶性的單純脂質(zhì)和復(fù)合脂質(zhì)所產(chǎn)生的化合 物，包括脂肪酸、高級醇、脂溶性維生素、類固醇、烴等)，但不限于這些。在本發(fā)明中，任意脂 質(zhì)自身均可以用作支持物，條件是該脂質(zhì)不會(huì)抑制與糖鏈的特異性相互作用。
本文中所用的"可光聚合的脂質(zhì)衍生物"指的是在接觸光(例如可見光、紫外 線等)時(shí)具有引發(fā)聚合反應(yīng)的特性的脂質(zhì)或其衍生物。這類脂質(zhì)可以是例如具有式 (III) :-C e C-C e C-所示的聯(lián)乙炔結(jié)構(gòu)的化合物；可光聚合的非聯(lián)乙炔單體，如丙烯酸 酯、環(huán)氧化物、乙烯醚等，但不限于這些。可以優(yōu)選通過紫外線聚合這類可光聚合的脂質(zhì)衍 生物。 本文中所用的"二維延伸"就本發(fā)明的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì) 而言指的是薄膜形式或形成薄膜形式。照此通過二維延伸所獲得的形狀的形式可以為例如 流延薄膜、單分子層、水分散體(與本說明書中的脂質(zhì)體同義)，但不限于這些。本文中所 用的"流延薄膜"是通過使用澆鑄法制備的薄膜，可以通過澆鑄和干燥包含本發(fā)明的可以與 糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的溶液來制備這類流延薄膜。本文中所用的"單分子層" 指的是nm級的在氣_液界面或固_液界面上形成的單分子層薄膜。在本發(fā)明中，為了制備 下文所示的"捕捉糖鏈的載體"或"糖鏈復(fù)制物"，使用一種其中將包含本發(fā)明的可以與糖鏈 特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的單分子層轉(zhuǎn)移至支持物上的方法。在本發(fā)明中，在以上所 述的廣義的"單分子層"中，優(yōu)選使用Langmuir-Blodgett膜(通常稱作LB膜)，其通過以 下方法獲得在水表面上形成可以與在水表面上形成的本發(fā)明的糖鏈特異性地發(fā)生相互作 用的物質(zhì)的單分子層并且通過任意方法轉(zhuǎn)移至并沉積在固體基質(zhì)上。形成LB膜的最普遍 方式是在恒定的表面壓力下橫切水表面上的單分子層而使固體支持物(或固體基質(zhì))垂直 移動(dòng)的技術(shù)，但不限于此。其它技術(shù)包括僅將一層單分子層轉(zhuǎn)移至固體支持物上的水平附 著法。該方法也可用于本發(fā)明。在本發(fā)明中，"沉積"意指將單分子層轉(zhuǎn)移至固體支持物上。 可以將單分子層一次轉(zhuǎn)移至固體支持物上或者可以轉(zhuǎn)移多次。為了使單分子層沉積在固體在水表面上的膜狀態(tài)或膜秩序，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以嘗試使用所有手 段。然而，必需使本發(fā)明的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)以二維方式在水表面 上延伸并形成單分子層。因此，優(yōu)選形成薄膜的、可以與本發(fā)明的糖鏈發(fā)生相互作用的物質(zhì) 為兩性的。在這類情況中，作為本發(fā)明的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的組分 的捕捉糖鏈的官能團(tuán)為親水性的且捕捉糖鏈的官能團(tuán)以外的部分為疏水性的。上述方法非 常適用于構(gòu)建如下所示的"捕捉糖鏈的載體"或"糖鏈復(fù)制物"。 本文中所用的"基質(zhì)分子"意指不具有捕捉糖鏈的能力、但被引入以進(jìn)一步穩(wěn)定由 本發(fā)明的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)形成的薄膜的分子。此外，通過引入這 類基質(zhì)分子，可以在薄膜平面上在捕捉糖鏈的官能團(tuán)之間形成橫向空間。此外，通過改變形 成薄膜的所有分子中的基質(zhì)分子的摩爾分?jǐn)?shù)，可以不受任何限制地產(chǎn)生具有各種二維分布 的捕捉糖鏈的官能團(tuán)的薄膜。作為本發(fā)明的"基質(zhì)分子"，給出了式(II)所示的化合物。
本文中所用的"捕捉糖鏈的載體"包括用于捕捉糖鏈的載體。這類載體包含用于 捕捉糖鏈的部分和用作載體的部分。就捕捉糖鏈的部分而言，可以使用本發(fā)明的與糖鏈特 異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)，就載體而言，可以使用支持物。或者，本發(fā)明的與糖鏈特異性 地發(fā)生相互作用的物質(zhì)自身可以用作載體。這類載體可以是具有上述式(I)中的"x"的載 體。更具體地說，可以是其中"X"、"X-Y"和"X-Y-Z"與支持物結(jié)合的載體和其中式(I)和 (II)所示的化合物被聚合的載體。 本文中所用的"不溶于有機(jī)溶劑的"指的是一種物質(zhì)在包含有機(jī)化合物的溶劑中 不溶解或基本上不溶解的特性。這類有機(jī)溶劑可以是例如醇(甲醇、乙醇等)、丙酮、烷烴 (例如己烷)等，但不限于此。不溶(性)的意指當(dāng)將所述物質(zhì)(溶質(zhì))放入有機(jī)溶劑時(shí)溶 解lg或lml溶質(zhì)所需的溶劑量為1L，優(yōu)選10L或更多。 本文中所用的"自閉性的"薄膜指的是以環(huán)形閉合的薄膜，如脂質(zhì)體、單層或多層。 因此，這類自閉性薄膜(例如脂質(zhì)膜)可以是例如脂質(zhì)體，但不限于此。
本文中所用的"分離"樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)指的是將糖鏈或含糖鏈物質(zhì)從 其分離前存在于樣品中的狀態(tài)取出或純化。因此，在從樣品中分離出的糖鏈或含糖鏈物質(zhì) 中，至少分離前包含在其中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)以外的物質(zhì)含量減少。 本文中所用的物質(zhì)(生物物質(zhì)，例如糖鏈、核酸、蛋白質(zhì)等)的"離析"指的是從生 物物質(zhì)天然存在的生物體細(xì)胞內(nèi)的其它物質(zhì)中基本上分離或純化(例如當(dāng)所述物質(zhì)為糖 鏈或含糖鏈物質(zhì)時(shí)，其它物質(zhì)是指糖鏈或含糖鏈物質(zhì)以外的物質(zhì)或靶標(biāo)糖鏈或含糖鏈物質(zhì) 以外的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)；當(dāng)所述物質(zhì)為核酸時(shí)，其它物質(zhì)是指核酸以外的物質(zhì)和包含靶 標(biāo)核酸以外的核酸序列的核酸；當(dāng)所述物質(zhì)為蛋白質(zhì)時(shí)，其它物質(zhì)脂質(zhì)蛋白質(zhì)以外的物質(zhì) 和包含靶標(biāo)蛋白質(zhì)以外的氨基酸序列的蛋白質(zhì))。"離析的"糖鏈或含糖鏈物質(zhì)包括通過本 發(fā)明的純化方法純化的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)。因此，離析的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)包括化學(xué)合成 的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)。 本文中所用的物質(zhì)(生物物質(zhì)，例如糖鏈、核酸、蛋白質(zhì)等)的"純化"指的是將至 少一部分與天然物質(zhì)聯(lián)合在一起的物質(zhì)取出。因此，純化和分離在其形式上部分重疊。通 常，純化的物質(zhì)(例如生物物質(zhì)，如糖鏈或含糖鏈物質(zhì))的純度高于物質(zhì)在其通常存在狀態(tài) 下的純度(即濃縮的)，然而，只要天然聯(lián)合在一起的物質(zhì)減少，物質(zhì)未被濃縮的狀態(tài)也包 括在"純化"的概念內(nèi)。
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本文中所用的物質(zhì)(例如生物物質(zhì)，如糖鏈或含糖鏈物質(zhì))的"濃縮"指的是將該 物質(zhì)的濃度升高至高于濃縮前樣品中所包含的該物質(zhì)的含量的活動(dòng)。因此，濃縮的概念也 與純化和分離的概念重疊。通常，濃縮的物質(zhì)(例如生物物質(zhì)，如糖鏈或含糖鏈物質(zhì))具有 比該物質(zhì)在其通常存在狀態(tài)下減少的雜質(zhì)含量。然而，只要靶標(biāo)物質(zhì)的含量增加，某些雜質(zhì) 也可以增加且未"純化的"狀態(tài)也包括在"濃縮"的概念中。 本文中所用的"捕捉糖鏈的載體可以與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)反應(yīng)的條件"指的是足 以使捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)反應(yīng)(優(yōu)選形成共價(jià)鍵)的條件(例如緩沖液、 溶劑的極性、溫度、pH、鹽濃度、壓力等)。設(shè)定這類條件所必需的參數(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的 能力范圍內(nèi)。通過考慮與相互作用相關(guān)的各種參數(shù)，如相互作用的類型、糖鏈或含糖鏈物 質(zhì)的類型、捕捉糖鏈的載體的類型(例如可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán))，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)設(shè)定條件以進(jìn)行相互作用反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案 中，這類條件可以為如下條件其中糖鏈與醛基在流體如水性溶液中反應(yīng)，形成處于由糖鏈 形成的環(huán)狀半縮醛型與非環(huán)狀醛型之間的平衡中的特定且穩(wěn)定的鍵，但不限于這些條件。 或者，為反應(yīng)提供的流體基本上不含酮基可能是優(yōu)選的條件。這類條件可以是例如在室溫 和大氣壓(例如2(TC和1個(gè)大氣壓)下使用pH 5. 6的乙酸緩沖液。 本文中所用的"捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的復(fù)合物〃 指的是彼此發(fā)生 相互作用而成為復(fù)合物的本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)。優(yōu)選地，在這類 復(fù)合物中，捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)彼此共價(jià)結(jié)合。因此，在本說明書中，具有 兩個(gè)或多個(gè)彼此通過共價(jià)鍵結(jié)合的部分的物質(zhì)也包括在復(fù)合物的概念范圍內(nèi)。
本文中所用的"捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)之間的相互作用至少部分被 消除的條件"指的是本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)之間形成的相互作用 (例如共價(jià)鍵)至少部分被減少的條件。因此，當(dāng)上述相互作用為共價(jià)鍵時(shí)，"捕捉糖鏈的載 體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)之間的相互作用至少部分被消除的條件"指的是捕捉糖鏈的載體與 糖鏈或含糖鏈物質(zhì)之間形成的共價(jià)鍵至少部分被釋放且優(yōu)選全部被釋放的條件。這類條件 可以是例如使用物理手段(例如激光等)、化學(xué)手段(酸性條件)或生化手段(例如酶)， 但不限于此。所述條件可以是任意條件，只要所需糖鏈和含糖鏈物質(zhì)以可識(shí)別的形式得到 分離。可以使所需的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)變性，但有利的是優(yōu)選使所需的糖鏈或含糖鏈物質(zhì) 在不變性的情況下得到分離，且更優(yōu)選以天然存在的狀態(tài)得到分離。特別地，這類條件可以 是例如接觸酸性條件，便利和有利的是優(yōu)選將其與質(zhì)子型離子交換樹脂和強(qiáng)陽離子交換樹 脂混合且然后分離。就分離糖鏈的方法而言，對根據(jù)本發(fā)明分離的以物理方式斷開的結(jié)合 物質(zhì)沒有限制。然而，主要指的是通過適當(dāng)調(diào)節(jié)激光照射能量的強(qiáng)度使聚合物與糖鏈斷開。
本文中所用的"含糖鏈物質(zhì)被分離成糖鏈和剩余部分的條件"指的是除去含糖鏈 物質(zhì)中糖鏈與該物質(zhì)的剩余部分(例如肽、脂質(zhì)等)之間形成的鍵(例如共價(jià)鍵)的條件。 可以使用物理手段(例如激光等)、化學(xué)手段(酸性條件)或生化手段(例如酶，如糖苷酶) 提供這類條件，但不限于此。所述條件可以為任意條件，只要所需糖鏈和含糖鏈物質(zhì)以可識(shí) 別的形式得到分離?？梢允顾璧奶擎溩冃裕欣氖莾?yōu)選使所需的糖鏈或含糖鏈物質(zhì) 在不變性的情況下得到分離，且更優(yōu)選以天然存在的狀態(tài)得到分離。特別地，這類條件可以 是例如接觸酸性條件，便利和有利的是優(yōu)選將其與質(zhì)子型離子交換樹脂和強(qiáng)陽離子交換樹 脂混合且然后分離。就分離糖鏈的方法而言，對根據(jù)本發(fā)明分離的以物理方式斷開的結(jié)合
20物質(zhì)沒有限制。然而，主要指的是通過適當(dāng)調(diào)節(jié)激光照射能量的強(qiáng)度使聚合物與糖鏈斷開。 因此，"含糖鏈物質(zhì)被分離成糖鏈和剩余部分的條件"可以與"捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含 糖鏈物質(zhì)之間的相互作用至少部分被消除的條件"重疊。此外，"含糖鏈物質(zhì)被分離成糖鏈 和剩余部分的條件"也可以與用于釋放醛基的條件重疊。 本文中所用的"容器"指的是任意類型的容器，只要它具有容納流體的形狀。容器 的材料也可以為任意材料，只要它可以容納流體、可以耐受本發(fā)明中所反應(yīng)的發(fā)生或可以 照此進(jìn)行處理。這類材料優(yōu)選在常溫(0°C -301:的溫度)下為固體。更優(yōu)選地，它可以在
進(jìn)行純化、濃縮、分離或分析的環(huán)境中維持固態(tài)。這類環(huán)境可以是在低于ot:的溫度下或在
3(TC或更高的溫度下。優(yōu)選地，高溫可以是例如IO(TC或以下。這類材料可以為能夠形成
固體表面的任意材料。然而，所述材料可以是例如玻璃、硅石、硅、陶瓷、二氧化硅、塑料、金
屬(包括合金)、天然和合成的聚合物(例如聚苯乙烯、纖維素、脫乙酰殼多糖、葡聚糖和尼
龍)、紙等，但不限于這些。這類材料可以具有涂層或者可以不具有涂層。 本文中所用的"涂層"指的是對表面進(jìn)行處理以使容器獲得某種特性或指的是用
于表面處理的物質(zhì)。這類涂層可以用于獲得例如抗水性、抗油性、耐有機(jī)溶劑性、耐酸性等。
這類涂層材料可以是例如氟樹脂、硅烷水基漆樹脂等，但不限于這些。 本文中所用的"離心分離"可以通過任意技術(shù)進(jìn)行，只要是可以進(jìn)行通過施用加速 的分離。這類離心分離包括其中組合有濾器如Microcon(可由Millipore獲得)的離心過 濾技術(shù)。當(dāng)在一個(gè)容器中進(jìn)行本發(fā)明的方法時(shí)，該容器可以為用于離心過濾技術(shù)的容器。
本文中所用的"釋放樣品中的醛基"指的是暴露樣品中包含或預(yù)計(jì)包含的糖鏈或 含糖鏈物質(zhì)中的醛。此外，還包括通過半乳糖氧化酶產(chǎn)生半乳糖殘基和通過對6-醛和二醇 基進(jìn)行高碘酸酸解產(chǎn)生醛基。通過釋放樣品中的醛基，易于進(jìn)行此后的本發(fā)明的與糖鏈特 異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)之間的相互作用?；蛘?，通過使樣品接觸 釋放樣品中的醛基的條件，僅含糖鏈物質(zhì)中的糖鏈可以得到分離和濃縮、純化或分析。當(dāng)需 要這類狀態(tài)時(shí)，它可能是有利的。 用于釋放樣品中的醛基的條件可以是例如通過酶處理和/或化學(xué)方法的給質(zhì)子 反應(yīng)，但不限于這些。這類酶處理可以是例如用糖鏈釋放酶如N-糖苷酶(例如來源于在大 腸桿菌中表達(dá)的腦膜膿毒性黃桿菌的酶)、糖肽酶A(杏仁)等處理，但不限于此。本發(fā)明中 所用的這類酶包括來源于植物、酵母或霉菌的糖苷酶，優(yōu)選來源于黃桿菌屬的N-糖苷酶， 但不限于這些。化學(xué)方法可以是例如肼解(液相或氣相)，但不限于此。在肼解中，例如將 樣品(例如200-1000yg包含糖蛋白的樣品)凍干(使用螺旋帽小瓶或螺旋帽試管)并加 入無水肼(例如100-200 iU)以便在IO(TC下加熱數(shù)小時(shí)至10小時(shí)和數(shù)小時(shí)(例如使用干 燥加熱塊或烘箱)。此后，加入幾滴甲苯，將樣品瓶放入干燥器中。通過帶有冷阱的真空泵 進(jìn)行減壓以共沸蒸餾肼。將這類共沸蒸餾重復(fù)幾次并完全蒸餾肼以完成肼解，分離所需的 糖鏈。 本文中所用的本發(fā)明的設(shè)備中所用的"導(dǎo)入樣品"指的是將樣品移至本發(fā)明的 反應(yīng)應(yīng)發(fā)生的位置。樣品導(dǎo)入部分可以具有任意形狀，只要它適合于導(dǎo)入樣品。此外，作 為導(dǎo)入樣品的方法，可以是例如使用注射器的方法、使用柱的方法、注射樣品和通過流動(dòng) 相流入柱的方法以及使用進(jìn)樣閥的方法等，但不限于這些。用于導(dǎo)入樣品的手段可以是 進(jìn)樣器、自動(dòng)采樣器、微量加料器等，但不限于這些。例如關(guān)于使用色譜法，參見"Kosokuekitaikuromatoguraf i (高效液相色譜法)，，，Hiroyuki Hatano編車茸，Kagaku noRyoiki， 增干lj， 102期，Nankodo Co. ， Ltd. ;"Kosoku ekitai kuromatogurafino sochi and fuzoku sochi (用于高效液相色譜法的設(shè)備和輔助裝備)"，Norio 0kuyama， Kazuo Seta， 11-40頁。
本文中所用的"可以容納流體相"意指容納足以進(jìn)行本發(fā)明反應(yīng)的本發(fā)明反應(yīng)中 所用的流體相體積。優(yōu)選地，具有可以容納流體相的空間的容器具有保持流體相基本上不 損失和不變性的能力。 本文中所用的"流體交換"也稱作"流動(dòng)連接"，意指兩個(gè)容器內(nèi)容納的流體在兩個(gè) 容器之間至少在一個(gè)方向上、優(yōu)選在兩個(gè)方向上是可以移動(dòng)的。因此，當(dāng)容器和樣品導(dǎo)入部 分可進(jìn)行流體交換時(shí)，如果將樣品在樣品導(dǎo)入部分被導(dǎo)入，則至少部分樣品可以被導(dǎo)入容 器中。流體可交換的狀態(tài)可以始終持續(xù)或可以是暫時(shí)的。為了進(jìn)行暫時(shí)的流體交換，優(yōu)選 提供控制器用于控制裝置中的這類條件，但也可以手動(dòng)控制。 本文中所用的支持物與容器之間的"結(jié)合"可以是任意形式，只要本發(fā)明所用的反 應(yīng)過程中支持物是固定的。優(yōu)選地，這種結(jié)合為共價(jià)鍵，但也可以單獨(dú)或結(jié)合使用其它相互 作用，如疏水相互作用。 本文中所用的"離析捕捉糖鏈的載體與糖鏈的復(fù)合物的手段"可以為任意類型的 手段，只要它可以離析捕捉糖鏈的載體與糖鏈的復(fù)合物。這類手段可以是離心分離儀、濾 器、色譜儀等，但不限于這些。當(dāng)載體是磁性的時(shí)，可以使用應(yīng)用磁性的分離方法。在這類 情況中，離析捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的復(fù)合物的手段可以是磁鐵?；蛘?，可以 通過使載體接觸載體與糖鏈之間的相互作用不被分離的嚴(yán)格條件而離析捕捉糖鏈的載體 與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的復(fù)合物。 本文中所用的"所需的嚴(yán)格(條件)"指的是與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì) 與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)之間的相互作用不被解離的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域眾 所周知的技術(shù)并考慮到各種參數(shù)而對這類條件進(jìn)行適當(dāng)選擇，所述的參數(shù)如所用的試劑、 載體、糖鏈或含糖鏈物質(zhì)、與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)、形成的相互作用。例如，當(dāng) 所述的相互作用為共價(jià)鍵時(shí)，所需的嚴(yán)格條件可以是用水(例如超純水)或緩沖液(例如 乙酸緩沖液)洗滌。 本文中所用的"鑒定與捕捉糖鏈的載體相互作用的物質(zhì)"指的是揭示相互作用的 物質(zhì)的特性。通常，它指的是確定該物質(zhì)是否為糖鏈和確定它們是何種類型的糖鏈。為了 進(jìn)行這類鑒定，可以使用各種測定方法，例如可以使用物理分析，如質(zhì)譜分析、NMR、 X-射線 分析、元素分析等；通過觀察化學(xué)特異性反應(yīng)等而進(jìn)行的化學(xué)分析；通過測定酶的底物特 異性等的生化學(xué)分析；或通過測定活生物體(例如微生物，如細(xì)菌)的反應(yīng)的生物學(xué)分析， 但不限于這些。 本文中所用的"病因?qū)W"指的是與受試者的疾病、病癥或疾患(在本說明書中，其 也可以總稱為"損傷"，并且就植物而言也可以稱為病害)有關(guān)的因素，包括例如可以作為 病因的致病物質(zhì)(致病因素)、病原體、損傷細(xì)胞、致病病毒等，但不限于這些。
這類疾病、病癥或疾患可以是例如循環(huán)系統(tǒng)疾病(貧血(例如再生障礙性貧血 (特別是重度再生障礙性貧血)、腎性貧血、癌性貧血、繼發(fā)性貧血、難治性貧血等)、癌癥或 腫瘤(例如白血病、多發(fā)性骨髓瘤)等)；神經(jīng)系統(tǒng)疾病(癡呆、腦栓塞及其后遺癥、后遺 效應(yīng)、腦腫瘤、脊髓損傷等)；免疫系統(tǒng)疾病(T細(xì)胞缺陷、白血病等)；運(yùn)動(dòng)器官骨骼系統(tǒng)
22疾病(骨折、骨質(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)脫位、不全脫位、扭傷、韌帶損傷、骨關(guān)節(jié)炎、骨肉瘤、尤因肉 瘤、骨發(fā)育不全、軟骨發(fā)育不全等)；皮膚系統(tǒng)疾病(無毛癥、黑素瘤、皮膚惡性淋巴瘤、血 管肉瘤、組織細(xì)胞增多病、水皰、膿皰病、皮炎、濕疹等)；內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病(下丘腦-垂體 疾病、甲狀腺疾病、副甲狀腺(甲狀旁腺)疾病、腎上腺皮質(zhì)/髓質(zhì)疾病、糖代謝紊亂、脂質(zhì) 代謝紊亂、蛋白質(zhì)代謝紊亂、核酸代謝紊亂、先天性代謝紊亂(苯丙酮酸尿、半乳糖血癥、高 胱氨酸尿癥、槭糖尿病)、血白蛋白缺乏癥、抗壞血酸合成能力缺失、高膽紅素血、高膽紅素 尿(hyperbilirubi皿rea)、激肽釋放酶缺乏、肥大細(xì)胞缺陷、尿崩癥、加壓素分泌障礙、侏儒 癥、沃爾曼病(酸性脂肪酶缺乏)、粘多糖貯積病VI等)；呼吸系統(tǒng)疾病(肺病(例如肺炎、 肺癌等)、支氣管疾病、肺癌、支氣管癌等)；消化系統(tǒng)疾病(食道疾病(例如食道癌)、胃/ 十二指腸疾病(例如胃癌、十二指腸癌)、小腸疾病/大腸疾病(例如結(jié)腸息肉、結(jié)腸癌、直 腸癌等)、膽管疾病、肝病(例如肝硬化、肝炎(A、 B、 C、 D、 E等)、暴發(fā)型肝炎、慢性肝炎、原 發(fā)性肝癌、酒精性肝病、藥物誘發(fā)的肝炎)、胰腺疾病(急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、膽 囊胰腺疾病)、腹膜/腹壁/膈肌疾病(疝氣等)、希施斯普龍病等)；泌尿系統(tǒng)疾病(腎 病(腎衰竭、原發(fā)性腎小球疾病、腎血管疾病、腎小管功能異常、間質(zhì)性腎病、全面性疾病誘 發(fā)的腎病、腎癌等)、膀胱疾病(膀胱炎、膀胱癌等)等)；生殖器官疾病(男性生殖器疾病 (男性不育、前列腺肥大、前列腺癌、睪丸癌等)、女性生殖器疾病(女性不孕、卵巢功能障 礙、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位、子宮癌、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢癌、絨膜疾病等)等)；循環(huán)系 統(tǒng)疾病(心力衰竭、心絞痛、心肌梗死、心律失常、心瓣膜病、心肌/心包疾病、先天性心臟病 (例如房間隔缺損、房間隔缺損、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、法洛四聯(lián)癥)、動(dòng)脈疾病(例如動(dòng)脈硬化、動(dòng) 脈瘤)、靜脈疾病(例如靜脈曲張)、淋巴管疾病(例如淋巴水腫)等)；等，但不限于這些。
本文中所用的"樣品"可以來源于任意來源，只要目的在于分離、濃縮、純化或分析 其中所包含的至少一種組分(優(yōu)選糖鏈或含糖鏈物質(zhì))。因此，樣品可以取自完整或部分活 生物體，但不限于這些。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用合成技術(shù)來合成樣品。
本文中所用的術(shù)語"生物分子"指的是與生物體相關(guān)的分子。在本說明書中包含 這類生物分子的樣品可以稱作生物樣品。本文中所用的"生物體"指的是生物有機(jī)體，包括 動(dòng)物、植物、真菌、病毒等，但不限于這些。因此，生物分子包括提取自生物體的分子。然而， 并不限于此，且任意分子均包括在生物分子的定義范圍內(nèi)，只要它可以影響生物體。這類 生物分子包括蛋白質(zhì)、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸(包括例如DNA，如 cDNA、基因組DNA ;RNA，如mRNA)、多糖、寡糖、脂質(zhì)、小分子(例如激素、配體、信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)、 有機(jī)小分子等)、其復(fù)合分子等，但不限于這些。本文中所用的生物分子可以優(yōu)選為包含糖 鏈的復(fù)合分子或糖鏈(例如糖蛋白、糖脂等)。 對這類生物分子的來源沒有特別限定，條件是它是來源于活生物體的糖鏈所結(jié)合 或連接的物質(zhì)。所述來源可以是動(dòng)物、植物、細(xì)菌或病毒。優(yōu)選來源于動(dòng)物的生物樣品。例 如，優(yōu)選全血、血漿、血清、汗、唾液、尿、胰液、羊水、腦脊液等。更優(yōu)選地，它可以是血漿、血 清或尿。生物樣品包括預(yù)先未從受試者中離析的生物樣品。該生物樣品可以包括例如可 在外部附著樣品的粘膜組織或腺體組織且優(yōu)選附著在乳腺、前列腺或胰腺上的導(dǎo)管組織上 皮。(糖鏈陣列和糖鏈芯片) 本文中所用的術(shù)語"陣列"指的是將物質(zhì)固定在基質(zhì)或薄膜上的固定模式或模式化的基質(zhì)本身。在陣列中，在小基質(zhì)(例如具有10X10mm等大小)上模式化的那些陣列稱 作微陣列。然而，在本說明書中，微陣列與陣列可以互換使用。此外，可以將陣列分成大陣列 和微陣列，這取決于基質(zhì)的大小或置于其上的生物分子的密度。因此，甚至可以將在較上述 基質(zhì)更大的基質(zhì)上模式化的生物分子稱作微陣列。例如，陣列由一組固定在固相表面或薄 膜上的所需生物分子(例如糖鏈)形成。陣列包括至少102、優(yōu)選至少103、更優(yōu)選至少104、 且更優(yōu)選至少105個(gè)不同的所需生物分子(例如糖鏈)。將這些所需的生物分子(例如糖 鏈)置于具有優(yōu)選125X80mm、更優(yōu)選10X 10mm的面積的表面上。預(yù)期形式為96孔板、384 孔板等大小至約載玻片大小。 因此，也可以將"陣列"或"微陣列"解釋為通過將生物分子(例如糖鏈、蛋白質(zhì)、 核酸等)排列和固定在基質(zhì)上而獲得的裝置。在本說明書中，除非另有說明，否則陣列與微 陣列可以互換使用。對大陣列與微陣列之間的界線沒有具體限定。然而，一般來說，"大陣 列"指的是具有點(diǎn)在膜上的生物分子的高密度濾器，而"微陣列"指的是置于基質(zhì)如玻璃、硅 等的表面上的生物分子排列。 本文中所用的"芯片"指的是通過應(yīng)用用于半導(dǎo)體集成電路的技術(shù)同時(shí)在基質(zhì) 上合成多類生物分子如糖鏈而產(chǎn)生的陣列。根據(jù)半導(dǎo)體芯片進(jìn)行命名，如果生物分子為 糖鏈，則芯片特別稱作"糖鏈芯片"。如果生物分子為DNA，則芯片可以稱作DNA芯片。這 類芯片可以是GeneChip(TR) (Affimetrix， CA， USA)(參見Marshall A等，(1998)Nat. Biotechnol. 16 :27-31和Ramsay G等，(1998)Nat. Biotechnol. 1640-44)，在使用芯片中所 涉及的技術(shù)可以應(yīng)用于糖鏈芯片。在狹義上，糖鏈芯片的定義如上所述，但是它還可以表示 全部的糖鏈陣列或糖鏈微陣列。因此，以高密度放置糖鏈的芯片也可以稱作糖鏈芯片。
在陣列上，可以放置生物分子"斑點(diǎn)"。本文中所用的"斑點(diǎn)"指的是某組生物分 子。本文中所用的"產(chǎn)生斑點(diǎn)(spotting)"指的是在某種支持物上產(chǎn)生一定的生物分子斑 點(diǎn)。產(chǎn)生斑點(diǎn)可以通過任意類型的方法進(jìn)行且這類方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。
本文中所用的術(shù)語"地址(address)"指的是基質(zhì)上的獨(dú)特位置，它可以與其它獨(dú) 特位置相區(qū)分。地址可以具有任意形狀，該形狀適于結(jié)合具有所述地址的斑點(diǎn)并使得可以 區(qū)分每個(gè)所述地址上的物質(zhì)與其它地址上的物質(zhì)(例如任選地)。用于定義地址的形狀可 以是例如圓形、橢圓形、正方形、矩形或不規(guī)則形狀。因此，盡管"地址"可用于表示抽象概 念且"斑點(diǎn)"可用于表示具體概念，但是當(dāng)不需要將它們彼此進(jìn)行區(qū)分時(shí)，在本說明書中"地 址"和"斑點(diǎn)"可以互換使用。 定義地址的大小取決于基質(zhì)的大小、特定基質(zhì)上地址的數(shù)量、分析物的量和/或 可利用的試劑、微粒的大小和使用陣列的任意方法所需的分辨率。所述大小的范圍可以是 例如l-2nm至幾cm，然而，可以使用與應(yīng)用陣列相匹配的任意大小。 定義地址的空間排列和形狀被涉及為與微陣列所應(yīng)用的具體應(yīng)用相匹配?？梢詫?地址緊密設(shè)置、廣泛分散或再分成適合于特定類型分析物的所需模式。 在使用糖鏈陣列的分析中，能夠通過熒光檢測器等檢測與糖鏈陣列雜交的熒光信 號(hào)。作為這類檢測器，到目前為止可以利用各種類型的檢測器。例如，斯坦福大學(xué)的一個(gè)小 組已經(jīng)研發(fā)了獨(dú)創(chuàng)性的掃描器。該掃描器是熒光顯微鏡與可移動(dòng)臺(tái)的組合，用于DNA陣列， 也可以用于糖鏈陣列(參見http:〃cm咖.Stanford, edu/pbrown)。如果斑點(diǎn)密度不是很 高，也可以使用常規(guī)類型的凝膠熒光影像分析器，如FMBI0 (Hitachi SoftwareEngineeringCo. ， Ltd. )、 Storm (Molecular Dynamics)等來讀取糖鏈陣列。其它可利用的檢測器可以 是ScanArray 4000、 ScanArray 5000 (GeneralScanning ;掃描類型(共焦型))、GMS418 Array Scanner (TakaraShuzo Co. ， Ltd.;掃描類型(共焦型))、Gene Tip Scanner (Nihon LaserDenshi KK ;掃描類型(非-共焦型))、Gene Tac 2000 (Genomic Solutions ;CCD照 相機(jī)型))。 由陣列獲得的數(shù)據(jù)量極大。因此，對克隆和斑點(diǎn)與數(shù)據(jù)分析之間的相應(yīng)性進(jìn)行處 理的數(shù)據(jù)分析軟件是重要的。作為這類軟件，可以使用與為DNA陣列研發(fā)的各種類型的檢 測系統(tǒng)所連接的軟件(Ermolaeva O等.(1998)Nat. Genet. 20 :19-23)。此外，作為數(shù)據(jù)庫 格式，例如，可以修改為DNA芯片研發(fā)的格式以便用于糖鏈。
(糖鏈復(fù)制物) 本文中所用的"糖鏈復(fù)制物"指的是在反映其天然存在的狀態(tài)、含量、場所等的條 件下將靶標(biāo)受試者上的糖鏈復(fù)制至某些物質(zhì)(例如薄膜、固體箔)上和照此獲得的復(fù)制的 物質(zhì)(例如薄膜、固體箔)。在糖鏈復(fù)制物中，由于反映出了糖鏈天然存在的狀態(tài)、含量、場 所等，所以可以通過檢測糖鏈復(fù)制物來可靠和便利地評價(jià)糖鏈復(fù)制物所來源于的受試者的 情況。 本文中所用的"固體箔"指的是固體的薄箔。形成固體箔的材料應(yīng)能產(chǎn)生糖鏈復(fù) 制物，可以具有任意形狀且可以由任意材料形成，只要它可以耐受檢查。這類固體箔可以是 例如玻璃、硅石、硅、陶瓷、二氧化硅、塑料、金屬(包括合金)、天然和合成的聚合物(例如聚 苯乙烯、纖維素、脫乙酰殼多糖、葡聚糖和尼龍)，但不限于這些。優(yōu)選地，有利的是使用透明 材料以方便檢查。優(yōu)選的是固體箔由可以與通過某種傳感器檢測的標(biāo)記結(jié)合的材料制成。
(診斷) 本文中所用的"檢測"指的是鑒定與受試者的疾病、病癥或疾患相關(guān)的各種參數(shù)。
本文中所用的"診斷"指的是鑒定與受試者的疾病、病癥或疾患相關(guān)的各種參數(shù) 并確定這類疾病、病癥或疾患的目前狀態(tài)。通過使用本發(fā)明的方法、設(shè)備和系統(tǒng)，可以鑒定 糖鏈且可以將有關(guān)鑒定的糖鏈的信息用于選擇與受試者的疾病、病癥或疾患相關(guān)的各種參 數(shù)。 本文中所用的"區(qū)分"指的是識(shí)別與受試者的疾病、病癥或疾患相關(guān)的各種參數(shù)。
因此，在本說明書中，"診斷"與"區(qū)分"的概念部分重疊。(有機(jī)化學(xué)) 本文中所用的"烷基"指的是當(dāng)一個(gè)氫原子從脂族烴(烷烴)如甲烷、乙烷、丙烷 等中失去時(shí)產(chǎn)生的一價(jià)基團(tuán)，其一般由(;11211+1-表示(此處n為正整數(shù))。烷基可以為直鏈 或支鏈。本文中所用的"取代的烷基"指的是烷基的H被以下所定義的取代基取代的烷基。 這類烷基的具體實(shí)例可以為Cl-C2烷基、C1-C3烷基、C1-C4烷基、C1-C5烷基、C1-C6烷基、 Cl-C7烷基、Cl-C8烷基、Cl-C9烷基、C1-C10烷基、C1-C11烷基或C1-C12烷基、Cl-C2取 代的烷基、Cl-C3取代的烷基、Cl-C4取代的烷基、Cl-C5取代的烷基、Cl-C6取代的烷基、 Cl-C7取代的烷基、Cl-C8取代的烷基、Cl-C9取代的烷基、C1-C10取代的烷基、Cl-Cll取 代的烷基或C1-C12取代的烷基。此處，例如C1-C10烷基表示含有l(wèi)-10個(gè)碳原子的直鏈或 支鏈烷基，實(shí)例可以為甲基(CHf)、乙基((:2115-)、正丙基((^3(^2(^2-)、異丙基((CH3)2CH_)、 正丁基(CH3CH2CH2CH2_)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2_)、正己基(CH3CH2CH2CH2CH2CH2_)、正庚基(CH3CH2CH2CH2CH2—CH2CH2—)、正辛基(CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2—)、正壬基 (CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2_)、正癸基(CH3CH2CH2CH2CH2_CH2CH2CH2CH2CH2-) 、 _C (CH3) 2CH2CH2 CH (CH3) 2、-CH2CH (CH3) 2 。此外，例如C1-C10取代的烷基指的是一個(gè)或多個(gè)氫原子被取代基取 代的C1-C10烷基。 本文中所用的"任選地被取代的烷基"意指可以使用以上所定義的"烷基"或"取 代的烷基"。 本文中所用的"亞烷基"指的是當(dāng)兩個(gè)氫原子從脂族烴(烷烴)中失去時(shí)產(chǎn)生的 二價(jià)基團(tuán)，如亞甲基、亞乙基、亞丙基，其一般由-(;H^-表示(此處n為正整數(shù))。亞烷基 可以為直鏈或支鏈。本文中所用的"取代的亞烷基"指的是亞烷基的H被以下所定義的取 代基取代的亞烷基。這類亞烷基的具體實(shí)例可以為Cl-C2亞烷基、C1-C3亞烷基、C1-C4亞 烷基、Cl-C5亞烷基、Cl-C6亞烷基、Cl-C7亞烷基、Cl-C8亞烷基、Cl-C9亞烷基、C1-C10亞 烷基、Cl-Cll亞烷基或C1-C12亞烷基、Cl-C2取代的亞烷基、Cl-C3取代的亞烷基、C1-C4 取代的亞烷基、Cl-C5取代的亞烷基、Cl-C6取代的亞烷基、Cl-C7取代的亞烷基、Cl-C8取 代的亞烷基、Cl-C9取代的亞烷基、C1-C10取代的亞烷基、Cl-Cll取代的亞烷基或C1-C12 取代的亞烷基。此處，例如C1-C10亞烷基指的是含有l(wèi)-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈亞烷 基，這類亞烷基的實(shí)例可以為亞甲基(-CH廠)、亞乙基(-(^4-)、正亞丙基(_CH2CH2CH2_)、 異亞丙基(_ (CH3) 2C_)、正亞丁基(_CH2CH2CH2CH2_)、正亞戊基(_CH2CH2CH2CH2CH2_)、 正亞己基(_CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)、正亞庚基(_CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)、正亞辛基 (-CH2CH2CH2CH2-CH2CH2CH2CH2_)、正亞壬基(_CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)、正亞癸基(_CH2C H2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2_) 、_CH2C (CH3) 2_等。此外，例如，Cl-C10取代的亞烷基指的是一個(gè) 或多個(gè)氫原子被取代基取代的C1-C10亞烷基。本文中所用的"亞烷基"可以包含一個(gè)或多 個(gè)選自氧原子和硫原子的原子。 本文中所用的"任選地被取代的亞烷基"指的是可以使用以上所定義的"亞烷基" 或"取代的亞烷基"。 本文中所用的"環(huán)烷基"指的是具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的烷基。術(shù)語"取代的環(huán)烷基"指的 是環(huán)烷基的H被以下所定義的取代基取代的環(huán)烷基。環(huán)烷基的具體實(shí)例可以為C3-C4環(huán)烷 基、C3-C5環(huán)烷基、C3-C6環(huán)烷基、C3-C7環(huán)烷基、C3-C8環(huán)烷基、C3-C9環(huán)烷基、C3-C10環(huán)烷 基、C3-C11環(huán)烷基、C3-C12環(huán)烷基、C3-C4取代的環(huán)烷基、C3-C5取代的環(huán)烷基、C3-C6取代 的環(huán)烷基、C3-C7取代的環(huán)烷基、C3-C8取代的環(huán)烷基、C3-C9取代的環(huán)烷基、C3-C10取代的
環(huán)烷基、C3-C11取代的環(huán)烷基或C3-C12取代的環(huán)烷基。例如環(huán)烷基可以為環(huán)丙基、環(huán)己基等。 本文中所用的"任選地被取代的環(huán)烷基"意指可以使用以上所定義的"環(huán)烷基"或 "取代的環(huán)烷基"。 本文中所用的"鏈烯基"指的是當(dāng)一個(gè)氫原子從分子中含有一個(gè)雙鍵的脂族烴中 失去時(shí)產(chǎn)生的一價(jià)基團(tuán)，其一般由CnH^「表示(此處n為2或更大的正整數(shù))。術(shù)語"取 代的鏈烯基"指的是鏈烯基的H被以下所定義的取代基取代的鏈烯基。鏈烯基的具體實(shí)例 可以為C2-C3鏈烯基、C2-C4鏈烯基、C2-C5鏈烯基、C2-C6鏈烯基、C2-C7鏈烯基、C2-C8鏈 烯基、C2-C9鏈烯基、C2-C10鏈烯基、C2-C11鏈烯基或C2-C12鏈烯基、C2-C3取代的鏈烯 基、C2-C4取代的鏈烯基、C2-C5取代的鏈烯基、C2-C6取代的鏈烯基、C2-C7取代的鏈烯基、C2-C8取代的鏈烯基、C2-C9取代的鏈烯基、C2-C10取代的鏈烯基、C2-C11取代的鏈烯基或 C2-C12取代的鏈烯基。此處，例如C2-C10鏈烯基指的是含有2-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈 的鏈烯基，鏈烯基的實(shí)例包括乙烯基(CH2 = CH-)、烯丙基(CH2 = CHCH2_) 、CH3CH = CH-等。 此外，例如C2-C10取代的鏈烯基指的是一個(gè)或多個(gè)氫原子被取代基取代的C2-C10鏈烯基。
本文中所用的"任選地被取代的鏈烯基"意指可以使用以上所定義的"鏈烯基"或 "取代的鏈烯基"。 本文中所用的"亞鏈烯基"指的是當(dāng)兩個(gè)氫原子從分子中含有一個(gè)雙鍵的脂族烴 中失去時(shí)產(chǎn)生的二價(jià)基團(tuán)，其一般由-(;H2n—2_表示(此處n為2或更大的正整數(shù))。術(shù)語"取 代的亞鏈烯基"指的是亞鏈烯基的H被以下所定義的取代基取代的亞鏈烯基。具體實(shí)例可 以為C2-C25亞鏈烯基或C2-C25取代的亞鏈烯基。特別地，優(yōu)選C2-C3亞鏈烯基、C2-C4亞 鏈烯基、C2-C5亞鏈烯基、C2-C6亞鏈烯基、C2-C7亞鏈烯基、C2-C8亞鏈烯基、C2-C9亞鏈烯 基、C2-C10亞鏈烯基、C2-C11亞鏈烯基或C2-C12亞鏈烯基、C2-C3取代的亞鏈烯基、C2-C4 取代的亞鏈烯基、C2-C5取代的亞鏈烯基、C2-C6取代的亞鏈烯基、C2-C7取代的亞鏈烯基、 C2-C8取代的亞鏈烯基、C2-C9取代的亞鏈烯基、C2-C10取代的亞鏈烯基、C2-C11取代的亞 鏈烯基和C2-C12取代的亞鏈烯基。此處，例如C2-C10亞鏈烯基指的是含有2-10個(gè)碳原 子的直鏈或支鏈的亞鏈烯基，亞鏈烯基的實(shí)例可以為-CH = CH-、-CH = CHCH2-、-(CH3)C = CH-等。此外，例如C2-C10取代的亞鏈烯基為一個(gè)或多個(gè)氫原子被取代基取代的C2-C10亞 鏈烯基。本文中所用的"亞鏈烯基"可以包含一個(gè)或多個(gè)選自氧原子和硫原子的原子。
本文中所用的"任選地被取代的亞鏈烯基"意指可以使用以上所定義的"亞鏈烯 基"或"取代的亞鏈烯基"。 本文中所用的"環(huán)烯基"指的是具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的烯基。術(shù)語"取代的環(huán)烯基"指的 是環(huán)烯基的H被以下所定義的取代基取代的環(huán)烯基。環(huán)烯基的具體實(shí)例可以為C3-C4環(huán)烯 基、C3-C5環(huán)烯基、C3-C6環(huán)烯基、C3-C7環(huán)烯基、C3-C8環(huán)烯基、C3-C9環(huán)烯基、C3-C10環(huán)烯 基、C3-C11環(huán)烯基、C3-C12環(huán)烯基、C3-C4取代的環(huán)烯基、C3-C5取代的環(huán)烯基、C3-C6取代 的環(huán)烯基、C3-C7取代的環(huán)烯基、C3-C8取代的環(huán)烯基、C3-C9取代的環(huán)烯基、C3-C10取代的 環(huán)烯基、C3-C11取代的環(huán)烯基或C3-C12取代的環(huán)烯基。例如，環(huán)烯基的優(yōu)選實(shí)例包括l-環(huán) 戊烯基、2-環(huán)己烯基等。 本文中所用的"任選地被取代的環(huán)烯基"意指可以使用以上所定義的"環(huán)烯基"或 "取代的環(huán)烯基"。 本文中所用的"炔基"指的是當(dāng)一個(gè)氫原子從分子中含有一個(gè)三鍵的脂族烴如乙 炔中失去時(shí)產(chǎn)生的一價(jià)基團(tuán)，其一般由CnH^3_表示(此處n為2或更大的正整數(shù))。術(shù)語 "取代的炔基"指的是炔基的H被以下所定義的取代基取代的炔基。炔基的具體實(shí)例可以 為C2-C3炔基、C2-C4炔基、C2-C5炔基、C2-C6炔基、C2-C7炔基、C2-C8炔基、C2-C9炔基、 C2-C10炔基、C2-C11炔基、C2-C12炔基、C2-C3取代的炔基、C2-C4取代的炔基、C2-C5取 代的炔基、C2-C6取代的炔基、C2-C7取代的炔基、C2-C8取代的炔基、C2-C9取代的炔基、 C2-C10取代的炔基、C2-C11取代的炔基或C2-C12取代的炔基。此處，例如C2-C10炔基指 的是例如含有2-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的炔基，炔基的實(shí)例可以為乙炔基(CH e c-)、 1-丙炔基(CH3CeC-)等。此外，例如C2-C10取代的炔基指的是一個(gè)或多個(gè)氫原子被取代 基取代的C2-C10炔基。
本文中所用的"任選地被取代的炔基"意指可以使用以上所定義的"炔基"或"取 代的炔基"。 本文中所用的"烷氧基"指的是當(dāng)醇羥基的氫原子失去時(shí)產(chǎn)生的一價(jià)基團(tuán)，其一般 由CnH2n+10_表示(此處n為1或更大的整數(shù))。術(shù)語"取代的烷氧基"指的是烷氧基的H被 以下所定義的取代基取代的烷氧基。烷氧基的具體實(shí)例可以為Cl-C2烷氧基、Cl-C3烷氧 基、Cl-C4烷氧基、Cl-C5烷氧基、Cl-C6烷氧基、Cl-C7烷氧基、Cl-C8烷氧基、Cl-C9烷氧 基、C1-C10烷氧基、Cl-Cll烷氧基、C1-C12烷氧基、Cl-C2取代的烷氧基、Cl-C3取代的烷 氧基、Cl-C4取代的烷氧基、Cl-C5取代的烷氧基、Cl-C6取代的烷氧基、Cl-C7取代的烷氧 基、C1-C8取代的烷氧基、C1-C9取代的烷氧基、C1-C10取代的烷氧基、C1-C11取代的烷氧基 或C1-C12取代的烷氧基。此處，例如C1-C10烷氧基指的是含有l(wèi)-10個(gè)碳原子的直鏈或支
鏈的烷氧基，烷氧基的實(shí)例可以為甲氧基(CH30_)、乙氧基(C2H50_)、正丙氧基(CH3CH2CH20_)等。 本文中所用的"可以被取代的烷氧基"意指可以使用以上所定義的"烷氧基"或"取 代的烷氧基"。 本文中所用的"雜環(huán)(基")指的是具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)、包含碳原子和雜原子的基團(tuán)。 此處，雜原子可以選自0、S和N，可以彼此相同或不同且可以包含它們中的一個(gè)或多個(gè)。雜 環(huán)基可以為芳族的或非芳族的且可以為單環(huán)的或多環(huán)的。雜環(huán)基可以被取代。
本文中所用的"可以被取代的雜環(huán)(基)"指的是可以使用以上所定義的"雜環(huán) (基)"或"取代的雜環(huán)(基)"。 本文中所用的"醇"指的是脂族烴的一個(gè)或多個(gè)氫原子被羥基取代的有機(jī)化合物。 在本說明書中，它還可以表示為ROH。此處，R為烷基。優(yōu)選地，R可以為Cl-C6烷基。醇可 以是例如甲醇、乙醇、l-丙醇、2-丙醇等，但不限于這些。 本文中所用的"碳環(huán)基"指的是具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)、僅包含碳的基團(tuán)，它是上述"環(huán)烷 基"、"取代的環(huán)烷基"、"環(huán)烯基"和"取代的環(huán)烯基"以外的基團(tuán)。碳環(huán)基可以為芳族的或非 芳族的且可以為單環(huán)的或多環(huán)的。術(shù)語"取代的碳環(huán)基"指的是碳環(huán)基的H被以下所定義 的取代基取代的碳環(huán)基。碳環(huán)基的具體實(shí)例可以為C3-C4碳環(huán)基、C3-C5碳環(huán)基、C3-C6碳 環(huán)基、C3-C7碳環(huán)基、C3-C8碳環(huán)基、C3-C9碳環(huán)基、C3-C10碳環(huán)基、C3-C11碳環(huán)基、C3-C12 碳環(huán)基、C3-C4取代的碳環(huán)基、C3-C5取代的碳環(huán)基、C3-C6取代的碳環(huán)基、C3-C7取代的碳 環(huán)基、C3-C8取代的碳環(huán)基、C3-C9取代的碳環(huán)基、C3-C10取代的碳環(huán)基、C3-C11取代的碳 環(huán)基或C3-C12取代的碳環(huán)基。碳環(huán)基還可以為C4-C7碳環(huán)基或C4-C7取代的碳環(huán)基。碳 環(huán)基的實(shí)例可以為失去一個(gè)氫原子的苯基。氫的缺失位置可以為化學(xué)上可能的任意位置， 它可以位于芳族環(huán)上或非芳族環(huán)上。 本文中所用的"可以被取代的碳環(huán)基"意指可以使用以上所定義的"碳環(huán)基"或"取 代的碳環(huán)基"。 本文中所用的"雜環(huán)基"指的是具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)、包含碳原子和雜原子的基團(tuán)。此處， 雜原子可以選自0、S和N，可以彼此相同或不同且可以包含它們中的一個(gè)或多個(gè)。雜環(huán)基可 以為芳族的或非芳族的且可以為單環(huán)的或多環(huán)的。術(shù)語"取代的雜環(huán)基"指的是雜環(huán)基的H 被以下所定義的取代基取代的雜環(huán)基。雜環(huán)基的具體實(shí)例可以為一個(gè)或多個(gè)碳原子被雜原 子取代的C3-C4碳環(huán)基、C3-C5碳環(huán)基、C3-C6碳環(huán)基、C3-C7碳環(huán)基、C3-C8碳環(huán)基、C3-C9
28碳環(huán)基、C3-C10碳環(huán)基、C3-C11碳環(huán)基、C3-C12碳環(huán)基、C3-C4取代的碳環(huán)基、C3-C5取代 的碳環(huán)基、C3-C6取代的碳環(huán)基、C3-C7取代的碳環(huán)基、C3-C8取代的碳環(huán)基、C3-C9取代的 碳環(huán)基、C3-C10取代的碳環(huán)基、C3-C11取代的碳環(huán)基或C3-C12取代的碳環(huán)基。雜環(huán)基還可 以為一個(gè)或多個(gè)碳原子被雜原子取代的C4-C7碳環(huán)基或C4-C7取代的碳環(huán)基。雜環(huán)基的實(shí) 例可以為噻吩基、吡咯基、呋喃基、咪唑基、吡啶基等。氫的缺失位置可以為化學(xué)上可能的任 意位置，它可以位于芳族環(huán)上或非芳族環(huán)上。 本文中所用的碳環(huán)基或雜環(huán)基除了可以被以下所定義的一價(jià)取代基取代以外，還 可以被二價(jià)取代基取代。這類二價(jià)取代可以為氧代取代(=0)或硫代取代(=S)。
本文中所用的"鹵素"指的是屬于周期表7B族的元素如氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、
碘(I)等的一價(jià)基團(tuán)。 本文中所用的"羥基"指的是-OH表示的基團(tuán)。術(shù)語"取代的羥基"指的是羥基的 H被以下所定義的取代基取代的羥基。 本文中所用的"硫氫基"(巰基)是羥基的氧原子被硫原子取代的基團(tuán)，其由-SH 表示。術(shù)語"取代的硫氫基"指的是巰基的H被以下所定義的取代基取代的基團(tuán)。
本文中所用的"氰基"指的是由-CN表示的基團(tuán)，"硝基"指的是由^02表示的基 團(tuán)。術(shù)語"氨基"指的是由-叫表示的基團(tuán)。術(shù)語"取代的氨基"指的是H被以下所定義的 取代基取代的氨基。 本文中所用的"羧基"指的是由-COOH表示的基團(tuán)。術(shù)語"取代的羧基"是H被以 下所定義的取代基取代的羧基。 本文中所用的"硫代羧基"指的是羧基的氧原子被硫原子替代的基團(tuán)，其可以 由-C( = S)OH、 -C( = O)SH或-CSSH表示。術(shù)語"取代的硫代羧基"是H被以下所定義的 取代基取代的硫代羧基。 本文中所用的"?；?指的是從羧酸上除去OH產(chǎn)生的一價(jià)基團(tuán)。酰基的代表性實(shí) 例可以為乙?；?CH^0-)、苯甲酰基(C6H5C0_)等。術(shù)語"取代的酰基"指的是氫被以下所 定義的取代基取代的?；?本文中所用的"酰胺"指的是氨的氫被酸基(?；?取代且優(yōu)選由-0^112表示的 基團(tuán)。術(shù)語"取代的酰胺"指的是被以下所定義的取代基取代的酰胺。 本文中所用的"羰基"指的是包含-(C = O)-的物質(zhì)的總稱，它為醛類和酮類的特
定基團(tuán)。術(shù)語"取代的羰基"指的是被下述所選擇的取代基取代的羰基。 本文中所用的"硫代羰基"指的是羰基的氧原子被硫原子替代的基團(tuán)，其包含特性
基團(tuán)-(c二s)-。硫代羰基包括硫酮和硫醛。術(shù)語"取代的硫代羰基"指的是被下述所選擇
的取代基取代的硫代羰基。 本文中所用的"磺?；?是包含特定基團(tuán)_S02-的物質(zhì)的總稱。術(shù)語"取代的磺酰 基"指的是被下述所選擇的取代基取代的磺酰基。 本文中所用的"亞磺酰基"是包含特定基團(tuán)-SO-的物質(zhì)的總稱。術(shù)語"取代的亞 磺?；?指的是被下述所選擇的取代基取代的亞磺酰基。 本文中所用的"芳基"指的是當(dāng)與芳族烴的環(huán)連接的一個(gè)氫原子被釋放時(shí)產(chǎn)生的 基團(tuán)，其包括在本說明書中的碳環(huán)基中。 除非另有說明，否則本文中所用的術(shù)語"取代"指的是有機(jī)化合物或取代基上的一
29個(gè)或多個(gè)氫原子被另一個(gè)原子或原子團(tuán)取代。可能除去一個(gè)氫原子并用一價(jià)取代基取代和 除去兩個(gè)氫原子并用二價(jià)取代基取代。 除非另有說明，否則本文中所用的術(shù)語"取代"指的是有機(jī)化合物或取代基上的一 個(gè)或多個(gè)氫原子被另一個(gè)原子或原子團(tuán)取代。可能除去一個(gè)氫原子并用一價(jià)取代基取代和 除去兩個(gè)氫原子并用二價(jià)取代基取代。 本發(fā)明中的取代基可以為烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、烷氧基、碳環(huán)基、雜 環(huán)基、卣素、羥基、硫氫基、氰基、硝基、氨基、羧基、氨基甲?；?、酰基、?；被?、硫代羧基、 酰胺、取代的羰基、取代的硫代羰基、取代的磺酰基或取代的亞磺?；?，但不限于這些。
優(yōu)選地，當(dāng)存在多個(gè)取代基時(shí)，它們可以獨(dú)立地為氫原子或烷基，但并非所有的多 個(gè)取代基均為氫原子。更優(yōu)選地，當(dāng)存在多個(gè)取代基時(shí)，它們可以獨(dú)立地選自氫和C1-C6烷 基。取代基可以包括并非均為氫的取代基，但優(yōu)選可以包括至少一個(gè)氫，且更優(yōu)選可以包括 2-n(此處n為取代基數(shù))個(gè)氫?？梢詢?yōu)選含有大量氫的取代基。這是因?yàn)榭梢宰C實(shí)大取 代基或具有極性的取代基對本發(fā)明的作用(特別是與醛基的相互作用)構(gòu)成障礙。因此， 非氫取代基可以優(yōu)選為Cl-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基、甲基 等。然而，也還可以優(yōu)選含有大取代基，因?yàn)樗鼈冇袝r(shí)可以改善本發(fā)明的作用。
本文中所用的Cl， C2， . . . Cn表示碳數(shù)。因此，Cl用于表示含有一個(gè)碳的取代基。
本文中所用的"對映體"指的是由于它們的晶體或分子結(jié)構(gòu)彼此互為鏡像或?yàn)槠?配對化合物本身而不能重疊的一對化合物之一。對映體為立體異構(gòu)體中的一種類型，除了 旋光性以外，它們的所有特性均相同。 本文中所用的"保護(hù)反應(yīng)"指的是向需要被保護(hù)的官能團(tuán)上加上保護(hù)基如Boc的 反應(yīng)。通過用保護(hù)基保護(hù)官能團(tuán)，具有高度反應(yīng)性的官能團(tuán)的反應(yīng)可以被抑制并且僅具有 較低反應(yīng)性的官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。 本文中所用的"去保護(hù)反應(yīng)"指的是釋放保護(hù)基如Boc的反應(yīng)。去保護(hù)反應(yīng)可以 是使用Pd/C的反應(yīng)如還原反應(yīng)。 在本發(fā)明的方法中，可以通過使用本領(lǐng)域常用的方法(例如萃取、蒸餾、洗滌、濃 縮、沉淀、過濾、干燥等)且然后聯(lián)用本領(lǐng)域中常用的后處理方法(例如吸附、溶解、洗脫、蒸 餾、沉淀、沉積、色譜分離等)從反應(yīng)溶液中除去雜質(zhì)(未反應(yīng)的原料、副產(chǎn)物、溶劑等)來 離析期望的產(chǎn)物。(本說明書中所用的一般技術(shù)) 除非另有特別說明，否則本說明書中所用的技術(shù)為微觀流體學(xué)、微觀制造、有機(jī)化 學(xué)、生物化學(xué)、遺傳工程、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的相關(guān)領(lǐng)域中 眾所周知的常用技術(shù)。這類技術(shù)充分公開在例如下文所列出的文件和本說明書其它部分中 所引用的文件中。 微觀制造在下列文獻(xiàn)中有描述例如Campbell, S.A. (1996)TheScience and Engineering of Microelectronic Fabrication, OxfordUniversity Press ;Zaut， P.V. (1996)Micromicroarray Fabrication "Practical Guide to Semiconductor Processing, Semiconductor Services ;Madou， M.J. (1997)Fundamentals of Microfabrication， CRC1 5 Press ;Rai_Choudhury， P. (1997)Handbook of Microlithogr即hy， Micromachining, &Microfabrication :Microlithogr即hy等。將這些
30文件中的相關(guān)部分引入本文。 本說明書中所用的分子生物學(xué)方法、生物化學(xué)方法、微生物學(xué)方法為本領(lǐng)域 眾所周知和常用的，在下列文獻(xiàn)中有公開例如Maniatis， T.等(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and3rd Ed.Thereof(2001); Ausubel， F. M.，等編車茸，Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley&Sons Inc. ， NY， 10158 (2000) ;I皿is， M. A. (1990). PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, AcademicPress;Innis， M. A.等(1995)PCR Strategies, Academic Press ; Sninsky， J. J. 等 (1999)PCR Applications-Protocols for Functional Genomics, AcademicPress ;Gait， M. J. (1985)Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach, IRL Press ;Gait， M. J. (1990)01igonucleotide Synthesis :A PracticalApproach， IRL Press ;Eckstein， F. Q991)Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approach, IRL Press ;Adams， R丄等(1992)The Biochemistryof the Nucleic Acids， Chapman&Hall ;Shabarova， Z.等(1994)AdvancedOrganic Chemistry of Nucleic Acids， Weinheim ;Blackburn， G. M. 等 (1996)Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press ;Hermanson， G. T. (1996)Bioconjugate Techniques, Academic Press ;Method in Enzymology 230，242，247， Academic Press, 1994 ;BessatsuJikke皿 Igaku(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分冊)"Idenshidony禮atsugen Kaisekijikkenho (基因引入&表達(dá)分 析實(shí)驗(yàn)方法)，，，Yodosha Co. Ltd. ， 1997 ;Hatanaka， Nishimura等，"Toshitsu no Kagaku to Kogaku(糖族科學(xué)禾口工程學(xué))"，Kodansha Scientific KK， 1997 ;Tosab墜hi no Sekkei to Seirikino (糖鏈分子的設(shè)計(jì)和生理學(xué))，Chemical Society of J即an編輯， J即anScientific Societies Press，2001等。將這些文件中的相關(guān)部分(可以將其全文)
引入本文。
(篩選) 本文中所用的"篩選"指的是通過特定操作和/或評價(jià)方法從大量候選物中選擇 具有特定特性的為靶標(biāo)的物質(zhì)或活生物體。在本說明書中，篩選可以通過使用本發(fā)明的設(shè) 備、系統(tǒng)、糖鏈陣列等進(jìn)行。為了進(jìn)行篩選，可以使用利用確切物質(zhì)的系統(tǒng)，如體外系統(tǒng)、體 內(nèi)系統(tǒng)等，或者可以使用通過利用in silico系統(tǒng)(使用計(jì)算機(jī)的系統(tǒng))產(chǎn)生的文庫。應(yīng) 當(dāng)理解，在本發(fā)明中，通過篩選獲得的具有所需活性的化合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此 外，本發(fā)明的目的在于基于本發(fā)明的公開內(nèi)容提供通過計(jì)算機(jī)模型設(shè)計(jì)獲得的藥物。
(糖鏈的測定) 可以通過各種物理方法(質(zhì)譜分析、NMR、 X-射線分析、元素分析等)、化學(xué)方法 (觀察特性化學(xué)反應(yīng)等)、生物化學(xué)方法(測定酶的底物特異性等)或生物學(xué)方法(活生物 體(例如微生物，如細(xì)菌)的反應(yīng))來鑒定用本發(fā)明的方法、設(shè)備和系統(tǒng)分離、純化或濃縮 的糖鏈。 可以用作物理方法的質(zhì)譜分析、NMR分析的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且可 以參照例如Niwa， Saishin no Masusupekutorometori (最新的質(zhì)譜法)，Kagaku-dojin Publishing Company, Ltd. ，1995 ;Modern 畫RSpectroscopy :A guide for Chemists, J. K. M. Sanders和B.K. Hunter (第2版，Oxford University Press, 紐約，1993); Spectrometric Identification ofOrganic Compounds, R. M. Silverstein， G. Clayton
31Bassler和Terrence C. Morill (第5版，John Wiley&Sons，紐約，1991)等。
(用于糖鏈定量或定性分析的探針) 在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用生物化學(xué)方法分析用本發(fā)明的方法分離的糖鏈。
在這類生物化學(xué)方法中，用于本說明書中糖鏈分析的測試探針可以為任意類型的 測試探針，只要它們可以與糖鏈特異性地結(jié)合且被標(biāo)記以能夠檢測。這類探針可以是例如 被標(biāo)記的與本發(fā)明的糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)、凝集素、糖鏈識(shí)別抗體等，但不限 于這些。 糖鏈的定量測定可以為絕對的或相對的。絕對定量測定可以通過例如使用已知濃 度的一種或多種靶糖鏈作為標(biāo)準(zhǔn)物制備標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行?；蛘?，相對定量測定可以通過將 復(fù)制物質(zhì)的兩種或多種類型的糖鏈的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較來實(shí)現(xiàn)?？梢酝ㄟ^計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行 這類分析。進(jìn)行這類分析的軟件可以是例如ArrayGauge 1. 2版或ImageGauge 3. 45版(均 可由Fuji PhotoFilm Co. ， Ltd.獲得)，但不限于這些。 術(shù)語"標(biāo)記"和"標(biāo)志"在本說明書中具有相同含義且指的是用于將靶分子或物質(zhì) 與其它分子或物質(zhì)區(qū)別開來的實(shí)體(例如物質(zhì)、能量、電磁波等)。這類標(biāo)記方法可以是放 射性同位素(RI)法、熒光法、生物素法、化學(xué)發(fā)光法等。
(藥物、化妝品等和使用它們的治療、預(yù)防等) 另一方面，本發(fā)明還涉及藥物(例如藥品，如疫苗等，保健食品，具有降低的剩余 蛋白或脂質(zhì)抗原性的藥物)和化妝品。這些藥物和化妝品還可以包含藥學(xué)可接受的載體 等。本發(fā)明的藥物中所包含的藥學(xué)可接受的載體可以為本領(lǐng)域中公知的任意物質(zhì)。
這類合適的制劑物質(zhì)或藥學(xué)可接受的載體可以為抗氧化劑、防腐劑、著色劑、矯味 劑、稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填充劑、補(bǔ)充劑(extendingagent)、緩沖劑、遞送介質(zhì)、稀 釋劑、賦形劑和/或藥用輔劑，但不限于這些。通常，本發(fā)明的藥物以組合物形式施用，所述 組合物包含離析的多能干細(xì)胞或者其變體或衍生物以及一種或多種生理學(xué)可接受的載體、 賦形劑或稀釋劑。合適的介質(zhì)可以是例如注射用溶劑、生理溶液或人工腦脊液?？梢韵蚱?中補(bǔ)充用于胃腸外遞送的組合物中常用的其它物質(zhì)。 可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑對接受者而言是無毒性的，且優(yōu)選在所用劑量和 濃度下無活性。它們可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽或其它有機(jī)酸；抗壞血酸、a -生育酚；低分 子量多肽類；蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；親水性聚合物(例如聚乙烯 吡咯烷酮)；氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)；單糖、二糖和其 它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合劑(例如EDTA);糖醇類(例如甘露醇或 山梨醇)；成鹽的抗衡離子(例如鈉)；和/或非離子型表面活性劑(例如吐溫、泊洛沙姆或 聚乙二醇(PEG))。 舉例性的合適載體可以是中性緩沖鹽水或混合有血清白蛋白的鹽水。優(yōu)選地，使 用合適的賦形劑(例如蔗糖)將其產(chǎn)物制成凍干劑。如果需要，還可以包含其它常用載體、 稀釋劑和賦形劑。其它舉例性的組合物包含pH7. 0-8. 5的Tris緩沖液或pH 4. 0_5. 5的乙 酸緩沖液，并且還可以包含山梨醇或其合適的替代物。 可以通過口服或胃腸外施用本發(fā)明的藥物?；蛘撸梢酝ㄟ^靜脈內(nèi)或皮下施用本 發(fā)明的藥物。對于全身施用，本發(fā)明的藥物可以為不包含熱原物質(zhì)的藥學(xué)可接受的水溶液 形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮pH、等張性、穩(wěn)定性等可以容易地制備這類藥學(xué)可接受的組合物。在本說明書中，施用方法可以是口服施用、胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)施用、肌內(nèi)施 用、皮下施用、皮內(nèi)施用、粘膜施用、直腸內(nèi)施用、陰道內(nèi)施用、對受累部位局部施用、經(jīng)皮施 用等)。用于這些施用的制劑可以具有任意藥物形式。所述的藥物形式可以是例如液體制 劑、注射劑或緩釋制劑。 根據(jù)需要可以通過將生理學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(參見日本藥典，第 14片反或最新片反；Remington's Pharmaceutical Sciences,第18片反，A. R. Ge皿aro編輯，Mack Publishing Company, 1990等)與具有所需純度的糖鏈組合物混合而將本發(fā)明的藥物制備 成凍干餅或水溶液形式并以該形式進(jìn)行貯存。 本領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮使用目的、耙疾病(類型、嚴(yán)重程度等)、患者的年齡、體 重、性別、病史、細(xì)胞形式或類型等可容易地確定用于本發(fā)明治療方法的糖鏈組合物的量。 本領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮使用目的、耙疾病(類型、嚴(yán)重程度等)、患者的年齡、體重、性別、 病史和療期也可以容易地確定本發(fā)明治療方法對受試者(或患者)的應(yīng)用頻率。施用頻率 可以是例如每天一次至數(shù)月一次(例如每周一次至每月一次)。優(yōu)選提供每周一次至每月 一次的施用，同時(shí)觀察該過程。 當(dāng)將本發(fā)明應(yīng)用于化妝品時(shí)，可以按照管理機(jī)構(gòu)制定的規(guī)程制備化妝品。
(農(nóng)藥) 本發(fā)明的組合物可以用作農(nóng)藥的組分。當(dāng)將該組合物作為農(nóng)藥組合物開具時(shí)，如 果必要，它可以包含農(nóng)業(yè)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。 當(dāng)本發(fā)明的組合物用作農(nóng)藥時(shí)，如果必要，可以混合有除草劑(吡唑特等)、殺蟲 劑/殺螨劑(二嗪農(nóng)等)、殺菌劑(噻菌靈(probezanol)等)、植物生長調(diào)節(jié)劑(例如多效 唑等)、殺線蟲劑(例如苯菌靈等)、增效劑(例如胡椒基丁醚等)、引誘劑(例如丁子香酚 等)、排斥劑(rejectant)(例如雜酚油等)、著色劑(例如可食用染料Blue No. l等)、肥料 (例如尿素等)。
(保健/食品) 本發(fā)明還可以用于保健和食品領(lǐng)域。在這類情況中，如果必要，應(yīng)考慮上述制備口 服藥物時(shí)的注意事項(xiàng)。特別是當(dāng)用于功能性食品或保健食品如針對特定保健應(yīng)用的食品 時(shí)，優(yōu)選與用于藥物的操作相一致的操作。優(yōu)選地，本發(fā)明的糖鏈組合物也可以用于低變應(yīng) 原食品。 如上所述，除醫(yī)療應(yīng)用外，本發(fā)明還可以應(yīng)用于需要生物分子測試的食品檢查、檢 疫、藥物檢查、法醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、動(dòng)物工業(yè)、漁業(yè)、林業(yè)等領(lǐng)域中的任意情況。特別地，本發(fā)明旨 在用于確保食品安全(例如BSE檢查)。
(檢查) 本發(fā)明的方法、設(shè)備、系統(tǒng)可以用于檢測各種糖鏈且可以用于各種檢查、診斷、測 定和區(qū)分，因?yàn)椴⑽刺貏e限定待檢測的糖鏈類型。由此檢測的糖鏈可以是對以下物質(zhì)具有 特異性的糖鏈例如病毒致病體基因(包括例如肝炎病毒(A、B、C、D、E、F或G型)、HIV、流 感病毒、皰疹病毒、腺病毒、人多瘤病毒、人乳頭瘤病毒、人細(xì)小病毒、腮腺炎病毒、人輪狀病 毒、腸道病毒、日本腦炎病毒、登革病毒、風(fēng)疹病毒和HTLV，但不限于這些)；細(xì)菌致病體基 因(包括例如金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、大腸桿菌、副溶血弧菌、幽門螺旋桿菌、彎曲桿 菌屬、霍亂弧菌、痢疾桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、耶爾森氏菌屬、淋病奈瑟氏球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、鉤端螺旋體屬、軍團(tuán)桿菌屬、螺旋體屬、肺炎枝原體、立克次氏體屬和衣原體 屬，但不限于這些)、瘧疾、溶組織內(nèi)阿米巴、致病真菌、寄生蟲、真菌等。 另一方面，本發(fā)明還可用于檢測生物化學(xué)檢查數(shù)據(jù)。這類生物化學(xué)檢查的靶標(biāo)可 以為糖鏈，如涉及膽堿酯酶、堿性磷酸酶、亮氨酸氨肽酶、Y _谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶、肌酸磷酸激 酶(creatinine phoskinase)、乳酸脫氫酶、淀粉酶等，但不限于這些。
(聚合物材料) 本發(fā)明還可應(yīng)用于與生物分子無關(guān)的領(lǐng)域。在這類情況中，可以利用本發(fā)明已經(jīng) 獲得的特性，即與所有糖鏈相互作用至基本上相同的程度和能夠進(jìn)行分離、純化、濃縮和分 析來制備材料。特別地，在將糖鏈或含糖鏈物質(zhì)用作材料如生物可降解的聚合物的情況下， 如果需要在樣品中保持與初始時(shí)相同的糖鏈比例，則本發(fā)明可能是有利的。或者，在批量合 成糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的情況下，如果優(yōu)選純化糖鏈和含糖鏈物質(zhì)，同時(shí)保持與合成時(shí)相同 的復(fù)合物比例，則本發(fā)明的物質(zhì)、方法、設(shè)備和系統(tǒng)可能是有利的。 如上所述，本發(fā)明的方法、設(shè)備和系統(tǒng)可以用于例如診斷、法醫(yī)學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)(篩
選藥物)和研發(fā)、分子生物學(xué)分析(例如基于陣列的糖鏈分析)、糖鏈特性和功能分析、藥理
學(xué)、糖組學(xué)、環(huán)境評價(jià)和其它生物學(xué)和化學(xué)分析。(優(yōu)選實(shí)施方案描述) 下文中將描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。 —方面，本發(fā)明提供了可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)。該物質(zhì)優(yōu)選具 有如下特性它對糖鏈具有的特異性高于它對不包含糖鏈的基本上所有物質(zhì)的特異性。在 現(xiàn)有技術(shù)中，已知有優(yōu)選與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)結(jié)合的大量物質(zhì)。然而，這類物質(zhì)還對糖鏈和 含糖鏈物質(zhì)以外的物質(zhì)具有特異性。本發(fā)明具有改善這類特異性的作用。
本發(fā)明的與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)可以用示意圖(A)-(B)表示。此 處，(A)表示具有與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的官能團(tuán)的部分(例如包含可以在流體中 與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)的部分)，(B)表示與和糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的官能團(tuán)無關(guān)的 部分(例如脂質(zhì))。優(yōu)選地，(B)可以為能與支持物結(jié)合的部分或能用作支持物的部分。(A) 表示的部分的具體實(shí)例可以為式(I)所示的化合物，(B)表示的部分的具體實(shí)例為式(II) 所示的化合物。(A)-(B)可以進(jìn)一步被以上所定義的取代基取代。取代基的數(shù)量可以根據(jù) (A)-(B)結(jié)構(gòu)的不同而改變且可以與存在的氫數(shù)相同。 本發(fā)明的相互作用優(yōu)選包括共價(jià)鍵。這是因?yàn)楣矁r(jià)鍵使得本發(fā)明的特征如純化、 分離、濃縮和分析能夠更有利和便利地進(jìn)行。更優(yōu)選地，這類共價(jià)鍵包括選自肟鍵、腙鍵、硫 代半腙鍵、全氫化噻嗪環(huán)形成和噻唑烷環(huán)形成的鍵。這類鍵對糖鏈具有高度特異性。因此， 它們可以有利地發(fā)揮作用以確保特異性。 特別地，能夠與支持物(特別是固體支持物)結(jié)合或本身能用作支持物的可以與 糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)是現(xiàn)有技術(shù)中不知的，也沒有進(jìn)行任何嘗試來制備這類 物質(zhì)。因此，本發(fā)明在提供這類物質(zhì)方面顯示出了顯著作用。此處，本發(fā)明的可以與糖鏈特 異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)優(yōu)選具有至少一部分支持物和物質(zhì)可以發(fā)生相轉(zhuǎn)變的特性。優(yōu) 選地，這類支持物和物質(zhì)可以具有均發(fā)生相轉(zhuǎn)變的特性。在作為支持物的使用中，當(dāng)反應(yīng)在 流體中進(jìn)行時(shí)，不發(fā)生相轉(zhuǎn)變，恢復(fù)到平衡狀態(tài)并釋放鍵，由此不能進(jìn)行所需的反應(yīng)和/或 分析或變得無效。通常，這類支持物在常溫下為固體。然而，只要它可以用于濃縮、純化、分
34離或分析，它可以為流體如液體或氣體。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)可以以預(yù) 定水平或更高水平與任意糖鏈特異性地發(fā)生相互作用。此處，預(yù)定水平指的是足以測定物 質(zhì)是否進(jìn)行了對糖鏈特異性的相互作用的水平。以預(yù)定水平或更高水平與任意糖鏈特異性 地發(fā)生相互作用的特性與和特定糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的特性相比可以實(shí)現(xiàn)以下所 述的顯著作用。例如，通過無區(qū)別地與任意糖鏈發(fā)生相互作用，可以濃縮、純化或分離糖鏈 和含糖鏈物質(zhì)，同時(shí)保持其天然存在時(shí)的內(nèi)含物比例或可以分析內(nèi)含物比例。由于可以反 映出天然狀態(tài)，所以由取自受試者的樣品可以容易地確定可基于糖鏈進(jìn)行測定的受試者的 狀況。 特別地，可以通過在MALDI-T0F過程中進(jìn)行激光照射時(shí)所需的解離能來測定上述 物質(zhì)與糖鏈之間相互作用的水平。在這類情況中，必需解離能為至少約5eV，優(yōu)選至少約 10eV，且更優(yōu)選至少約15eV。 或者，可以通過其它物理方法來測定相互作用水平。物理方法的實(shí)例可以為通過 表面等離振子共振法估計(jì)糖鏈結(jié)合量的方法和基于來源于捕捉糖鏈的載體之間的肟鍵的 NMR質(zhì)子信號(hào)強(qiáng)度的水平測定法。 或者，可以通過化學(xué)方法測定相互作用水平?；瘜W(xué)方法的實(shí)例可以為基于薄層色 譜(TLC)分離模式估計(jì)相互作用水平。 或者，可以通過生物化學(xué)方法測定相互作用水平。生物化學(xué)方法的實(shí)例可以為通 過ELISA法使用糖鏈_特異性抗體測定相互作用水平。 優(yōu)選地，當(dāng)本發(fā)明的物質(zhì)接觸使與非糖鏈物質(zhì)的非特異性相互作用解離的條件 時(shí)，至少一定量的與糖鏈的特異性相互作用得到保留。由于至少一定量的與糖鏈的特異性 相互作用得到保留，所以本發(fā)明的物質(zhì)可以用于純化、濃縮、分離和分析糖鏈和含糖鏈物 質(zhì)。特別地，甚至當(dāng)所述物質(zhì)接觸使與非糖鏈物質(zhì)的非特異性相互作用解離的條件時(shí)，至少 一定量的與糖鏈的特異性相互作用得到保留這一特性使得非糖鏈物質(zhì)被減少或除去。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選本發(fā)明的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì) 對糖鏈具有在最大與最小之間的一定水平范圍內(nèi)的特異性。該物質(zhì)以在一定范圍內(nèi)的水平 特異性地發(fā)生相互作用，所述范圍的最大值例如通常是最小值的10倍，優(yōu)選約5倍，更優(yōu)選 約3倍，還優(yōu)選約2倍或約1. 5倍。上述范圍可以根據(jù)用于相互作用水平的測定方法的不 同而改變。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以根據(jù)在MALDI-TOF過程中進(jìn)行激光照射時(shí)所需的 解離能來測定。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，作為本發(fā)明的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì) 的靶標(biāo)的糖鏈可以包括氧化的糖鏈和未氧化的糖鏈。由于本發(fā)明的物質(zhì)具有這樣的特性， 所以它不僅能與氧化的糖鏈特異性地發(fā)生相互作用，而且還可以同樣與任意類型的糖鏈發(fā) 生相互作用，并且可以有利地用于純化、濃縮、分離和分析糖鏈和含糖鏈物質(zhì)。因此，可以濃 縮、純化或分離糖鏈和含糖鏈物質(zhì)，同時(shí)保持與天然狀態(tài)時(shí)相同的內(nèi)含物比例，或者可以分 析內(nèi)含物比例。在氧化的糖鏈與同組中未氧化的糖鏈的百分比特別地反映出特定狀態(tài)的情 況中，由于可以反映出天然狀態(tài)，所以由取自受試者的樣品可以容易地測定受試者的這類 狀況。用僅與氧化的糖鏈發(fā)生相互作用的物質(zhì)不能實(shí)現(xiàn)這類作用。 本發(fā)明的與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)通常包含可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)。此處，所述的流體優(yōu)選包括基本上不含酮基(羰基)的物質(zhì)。特別地，選自水性溶液、有機(jī)溶劑及其混合物的流體可能是有利的。更優(yōu)選地，所述流體為水性溶液。糖鏈一般含有羰基如醛類中的醛基或酮類中的酮基，并且其中確立了環(huán)狀半縮醛型與非環(huán)狀醛型之間的平衡關(guān)系。因此，通過在這類條件下具有特異性，與糖鏈的特異性相互作用成為可能。因此，只要能夠與醛基反應(yīng)，則流體可以為任意流體(有機(jī)溶劑、氣體等)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明中所用的官能團(tuán)可以選自羥基氨基、N-烷基羥基氨基、酰肼基、氨基硫脲基和半胱氨酸殘基，但不限于這些。羥基氨基與糖之間的鍵(肟鍵)對酸尤其弱。因此，具有易于從捕捉糖鏈的載體中裂解糖鏈的優(yōu)點(diǎn)。 可以通過使與糖鏈發(fā)生特異性相互作用的官能團(tuán)如可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)與另一種物質(zhì)結(jié)合而制備本發(fā)明的與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)。所述的另一種物質(zhì)可以為能與支持物結(jié)合(優(yōu)選可以發(fā)生相轉(zhuǎn)變)的物質(zhì)。 可以通過下列方法進(jìn)行這類物質(zhì)的合成例如產(chǎn)生具有可以與糖鏈特異性相互作用的官能團(tuán)、如可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)的反應(yīng)中間體且然后使其與另一種與所述特異性相互作用無關(guān)的物質(zhì)(例如10，12-二十五碳二炔酸(pentacosadiinoic acid)等)反應(yīng)的方法；或者將與所述特異性相互作用無關(guān)的另一種物質(zhì)與反應(yīng)中間體物質(zhì)(例如2，2'-亞乙二氧基)雙(乙胺))混合且然后將另一種上述反應(yīng)中間體物質(zhì)(例如1-乙基-3(3' -二乙基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)加入到該混合物中的方法，但不限于這些。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解具有可以與醛基反應(yīng)并形成特異性和穩(wěn)定的鍵的特性的官能團(tuán)且可以理解含有這類官能團(tuán)的物質(zhì)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過單獨(dú)或組合使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來制備這類含有官能團(tuán)的物質(zhì)。 另一方面，本發(fā)明提供了包含可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)的脂質(zhì)。在現(xiàn)有技術(shù)中，尚未嘗試制備具有脂質(zhì)特性且包含可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)的物質(zhì)。這是因?yàn)樯形窗l(fā)現(xiàn)制備這類物質(zhì)的目的。在本發(fā)明中，首次發(fā)現(xiàn)了可以與支持物結(jié)合或可以用作支持物且可以與糖鏈特異性結(jié)合(特別地，同樣地，即對任意糖鏈具有相似水平的特異性)的物質(zhì)的應(yīng)用，由此實(shí)現(xiàn)了以上所述的脂質(zhì)的制備。 這類脂質(zhì)可以由示意圖(A')-(B')表示。此處，(A')表示具有可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的官能團(tuán)的部分(例如包含可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)的部分)，(B')表示脂質(zhì)。(A')表示的部分的具體實(shí)例為上述式(I)所示的化合物，(B')表示的部分的具體實(shí)例為式(II)所示的化合物。(A' )-(B')可以進(jìn)一步被以上所定義的取代基取代。取代基的數(shù)量根據(jù)(A' )-(B')結(jié)構(gòu)的不同而改變且可以與存在的氫數(shù)相同。
(A')可以為包含例如羥基氨基、N-烷基羥基氨基、酰肼基、氨基硫脲基和半胱氨酸殘基的部分?？梢愿鼉?yōu)選包含羥基氨基的部分。這類部分可以為來源于例如以下化合物的部分 0- (4-氨基甲基_芐基)_羥基胺；
0- (3-氨基丙基)_羥基胺；
0- [2- (2-氨基乙氧基)_乙基]_羥基胺等，
但不限于這些。 (B')可以為任意類型的部分，只要它來源于一般的脂質(zhì)。例如，(B')可以為10， 12- 二十五碳二炔酸；10， 12- 二十五碳二炔酸{2-[2-(2_氨基乙氧基)_乙氧基]_乙基卜酰胺棕櫚酸；硬脂酸等，但不限于這些。 本發(fā)明的脂質(zhì)可以是例如十八酸(3-氨基氧基-丙基)-酰胺；十八酸[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-酰胺；十八酸4-氨基氧基甲基_芐基酰胺；10,12- 二十五碳二炔酸(2- {2- [2- (2-氨基氧基_乙酰基氨基)_乙氧基]_乙氧基} _乙基)_酰胺等，但不限于這些。 在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的物質(zhì)描述為具有如下結(jié)構(gòu)。[O404](捕捉糖鏈的官能團(tuán))_(間隔基)_(聚合物官能團(tuán)) 此處，可以將捕捉糖鏈的官能團(tuán)描述為例如可以在流體中與糖鏈的醛基反應(yīng)且具
有圖1中所示結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)。圖1中的R指的是以上所定義的取代基，然而，優(yōu)選對聚合反
應(yīng)和與糖鏈的相互作用沒有帶影響的那些取代基。更具體地說，本發(fā)明的可以與糖鏈特異
性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)為可以如下表示的化合物 式(I) :X-Y-Z， 且式中的X為下式所示的基團(tuán)<formula>formula see original document page 37</formula>(此處，X1為可以被取代的亞烷基或可以被取代的亞鏈烯基，X2為氧原子或硫原子，X3為氧原子或硫原子，X4為亞甲基或亞乙基，R1為氫原子或烷基，且R2和R3獨(dú)立地為氫原子或烷基)； Y(Y的長度相當(dāng)于C0-25)為單鍵；亞烷基，其中可以插入至少一個(gè)選自-0-、-S-、-S-S-、-N(Ra)-C( = 0)-、-C( = O)-N(Rb)-和可以被取代的亞苯基的基團(tuán)；或亞鏈烯基，其中可以插入至少一個(gè)選自-0_、-S-、-S-S-、-N(Ra)-C( = 0)-、-C(
可以被取代的亞苯基的基團(tuán)(此處，Ra和Rb獨(dú)立地為氫原子或烷基)； Z為下式所示的基團(tuán)
0) -N(Rb)-和
R4I
,N
72
c三c—c三c—(此處，Z1為氧原子或硫原子，Z2和Z3獨(dú)立地為其中可以插入亞苯基或可以被取代的亞烷基；或其中可以插入亞苯基或可以被取代的亞鏈烯基，^為氧原子或硫原子，R4和RS獨(dú)立地為氫原子或烷基)]。在本發(fā)明的式(I)化合物中，XM尤選為C1-C10亞烷基或C2-C10亞鏈烯基，且Y的鏈長度優(yōu)選為相當(dāng)于C1-C25烷基的鏈長度。Y的其它優(yōu)選實(shí)例可以為_(CH2CH2-0)n-CH2CH2-(此處，優(yōu)選n = 1-8，且特別優(yōu)選n = 1-6)。優(yōu)選Z2和Z3獨(dú)立地為C1-C10亞烷基或C2-C10亞鏈烯基。此外，可以被取代的亞苯基的具體實(shí)例如下
〇2N
一〇
〇_
OMe 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用通過聚合式(I)化合物獲得的聚合物。這產(chǎn)生了如下作用當(dāng)各種薄膜由本發(fā)明的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)形成時(shí)，薄膜自身的強(qiáng)度和穩(wěn)定性增加且可以固定在支持物如基質(zhì)上。為了將薄膜固定在支持物上，優(yōu)選聚合通過將式(I)所示化合物的z位置物理吸附在支持物上而獲得的單分子層的方法。在這種方式中，實(shí)際上可以將固定有薄膜的支持物用作本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體。上述聚合可以為熱聚合或可以為光聚合。然而，由于Z位置上聯(lián)乙炔基或乙烯基之間的自由基聚合可以平穩(wěn)進(jìn)行且聚合操作相對便利的優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)選使用在254nm左右波長處通過UV-照射進(jìn)行的光聚合，該波長是聯(lián)乙炔基或乙烯基的吸收波長。此外，使用其中式(I)中的"X"與支持物彼此直接結(jié)合的物質(zhì)和其中"X-Y"和"支持物"直接結(jié)合的物質(zhì)。X1上"可以被取代的亞烷基"和"可以被取代的亞鏈烯基"的取代基優(yōu)選不被取代。Y上"可以被取代的亞烷基"和"可以被取代的亞鏈烯基"的取代基優(yōu)選不被取代。Z2和Z3上"可以被取代的亞烷基"和"可以被取代的亞鏈烯基"的取代基優(yōu)選不被取代。
38
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)是
通過聚合下述化合物獲得的共聚物 式(I) :X-Y-Z(I)所示的化合物[此處，X為下式所示的基團(tuán)
X2 R2(此處，X1為可以被取代的亞烷基或可以被取代的亞鏈烯基，X2為氧原子或硫原子，X3為氧原子或硫原子，X4為亞甲基或亞乙基，R1為氫原子或烷基，且R2和R3獨(dú)立地為氫原子或烷基)； Y(Y的長度相當(dāng)于CO-25)為單鍵；亞烷基，其中可以插入至少一個(gè)選自-0-、 -S-、 -S-S-、 -N(Ra)-C( = O)-、 -C( = O)-N(Rb)-和可以被取代的亞苯基的基團(tuán)或者可以被取代；或亞鏈烯基，其中可以插入至少一個(gè)選自-0-、 -S-、 -S-S-、 _N(Ra)-C(=0)-、-C( = O)-N(Rb)-和可以被取代的亞苯基的基團(tuán)或者可以被取代(此處，If和Rb獨(dú)立
地為氫原子或烷基)； Z為下式所示的基團(tuán)
39<formula>formula see original document page 40</formula>(此處，Z1為氧原子或硫原子，Z2和Z3獨(dú)立地為其中可以插入亞苯基或可以被取
代的亞烷基；或其中可以插入亞苯基或可以被取代的亞鏈烯基，24為氧原子或硫原子，1 4和
Rs獨(dú)立地為氫原子或烷基)];禾口 式(II) :A142(11)所示的化合物
<formula>formula see original document page 40</formula>(此處，A3為亞烷基，且R6為烷基)；且
A2為下式所示的基團(tuán)
<formula>formula see original document page 40</formula>
<formula>formula see original document page 40</formula>(此處，A4為亞烷基，且A5為下式所示的基團(tuán)<formula>formula see original document page 40</formula>
(As為亞烷基，V為氧原子或硫原子，且f為氫原子或烷基))]。在本發(fā)明式(I)和(II)化合物的共聚物中，XM尤選為C1-C10亞烷基或C2-C10亞鏈烯基，且Y的鏈長度優(yōu)選為相當(dāng)于C1-C25烷基的鏈長度。Y的其它優(yōu)選實(shí)例可以為_(CH2CH2-0)n-CH2CH2-(此處， 優(yōu)選n = 1-8，且特別優(yōu)選n = 1-6)。優(yōu)選Z2和Z3獨(dú)立地為C1-C10亞烷基或C2-C10亞鏈 烯基。AM尤選為C1-C5亞烷基，且特別是C2亞烷基。優(yōu)選W和AS獨(dú)立地為C1-C10亞烷
基。此外，可以被取代的亞苯基的具體實(shí)例如下
<formula>formula see original document page 41</formula>
聚合可以為熱聚合或可以為光聚合。然而，如上所述，優(yōu)選在254nm左右波長處通 過uv-照射進(jìn)行的光聚合，該波長是聯(lián)乙炔基或乙烯基的吸收波長。 當(dāng)各種薄膜由本發(fā)明的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)形成時(shí)，無論薄 膜是何種形式(例如單分子層、LB膜、流延薄膜、脂質(zhì)體等)，可以通過組合為基質(zhì)分子的式 (II)所示的化合物與式(I)所示的化合物來提高薄膜的穩(wěn)定性。有利的是，如果薄膜是穩(wěn) 定的，則薄膜的聚合可以平穩(wěn)地進(jìn)行而與其形式無關(guān)，薄膜變得易于轉(zhuǎn)移(或固定)單分子 層等。由于要使薄膜穩(wěn)定，所以式(II)化合物與式(I)化合物和式(II)化合物的總混合 物之比的摩爾分?jǐn)?shù)為O. 1-0.9。為了將薄膜固定在支持物上，優(yōu)選聚合通過將式(I)所示的 化合物的z位置和式(II)所示的化合物的AM立置物理吸附在支持物上而獲得的單分子層 的方法。在這種方式中，實(shí)際上可以將固定有薄膜的支持物用作本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體。
另一方面，本發(fā)明提供了捕捉糖鏈的載體，它包括可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互 作用的物質(zhì)。捕捉糖鏈的載體還可以包括支持物。這類支持物可以用于例如分離、濃縮、純 化或分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)。由于本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體可以無區(qū)別地與任意 糖鏈發(fā)生相互作用，所以可以濃縮、純化或分離糖鏈和含糖鏈物質(zhì)，同時(shí)保持天然存在的內(nèi) 含物比例或可以分析內(nèi)含物比例。由于糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的狀態(tài)基本上反映出了天然狀 態(tài)，所以由取自受試者的樣品可以容易地確定可基于糖鏈進(jìn)行測定的受試者的狀況。
可以通過使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)使可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物 質(zhì)與支持物相互作用(優(yōu)選結(jié)合)來制備本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體。例如當(dāng)用脂質(zhì)膜作為 支持物、作為可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)時(shí)，通過在具有可以在流體中與醛 基反應(yīng)的官能團(tuán)的脂質(zhì)和不包括這類官能團(tuán)的脂質(zhì)中包含可光聚合的部分并將它們進(jìn)行 光聚合，可以制備作為薄膜支持物發(fā)揮作用的脂質(zhì)。 因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體中所用的支持物可以為 交聯(lián)聚合物或脂質(zhì)膜。通過使用交聯(lián)聚合物或脂質(zhì)膜，二維延伸成為可能。因此，它可以有 利地用于要求平面性的實(shí)施方案、如糖鏈芯片中。 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體中所用的支持物包含可光 聚合的脂質(zhì)衍生物。由于它包含可光聚合的脂質(zhì)衍生物，所以通過用光照射和聚合它 可以容易地形成所需的形狀，如薄膜。這類可光聚合的脂質(zhì)衍生物可以是例如含有式
(工n)-c e C-C e c-所示的聯(lián)乙炔和可光聚合的非聯(lián)乙炔單體的化合物，所述的非聯(lián)乙炔
單體如丙烯酸酯、環(huán)氧化物、乙烯醚等，但不限于這些。只要它具有這類結(jié)構(gòu)，對脂質(zhì)的長度 沒有特別地限定。然而，通常可以使用例如C = 20-30的長度。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 用紫外線聚合本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體的可光聚合的脂質(zhì)衍生物。
根據(jù)聚合前由單體成分形成的薄膜的形狀，可以將本發(fā)明中用于聚合式(I)所示 的化合物和式(II)所示的化合物的混合物的方法分為以下三組。 [O442] i)水分散體(或脂質(zhì)體)的聚合 首先，將式(I)所示的化合物和式(II)所示的化合物的混合物溶于合適的有機(jī)溶 劑(例如氯仿)。該有機(jī)溶劑可以為單一溶劑或溶劑混合物，只要它為可以完全溶解上述混 合物且可揮發(fā)的有機(jī)溶劑即可，對其沒有特別地限制。在減壓條件下通過蒸發(fā)完全除去溶 劑，向殘余物中加入超純水，然后例如進(jìn)行超聲分散達(dá)10-20分鐘。這類超聲分散形成上述 混合物在水性溶液中的水分散體(通常為脂質(zhì)體，如雙層膜，但不限于此)。然后，優(yōu)選將 水性溶液的溫度升高至高于晶體-液晶相變溫度(Tc)幾攝氏度的溫度并將該水性溶液保 持?jǐn)?shù)分鐘以老化水分散體。這類老化對通過超聲分散在水中形成的薄膜的穩(wěn)定性和秩序具 有增強(qiáng)作用。通過反復(fù)老化該作用可以被進(jìn)一步增強(qiáng)。之后，將水性溶液快速冷卻至足以 低于晶體-液晶相變溫度(Tc)的溫度，即薄膜變成晶體狀態(tài)的溫度，并用抽吸器等從水性 溶液中除去空氣。除去空氣是有效的，因?yàn)樗チ藶樽杂苫矣纱丝梢砸种凭酆系娜芙?的氧。將所述水性溶液保持在充分低于Tc的溫度下(即薄膜可以保持晶體狀態(tài)的溫度) 并使用紫外線燈(例如低壓汞燈等)照射，同時(shí)向該溶液中通入惰性氣體(例如氬氣或氮
氣)。通常使用uv-可見吸收光譜以光譜分析跟蹤聚合反應(yīng)過程并證實(shí)反應(yīng)飽和。使用幾
百微米濾膜對聚合薄膜進(jìn)行純化?？梢允褂秒娮语@微鏡等證實(shí)聚合薄膜的形狀。
ii)流延薄膜的聚合 首先，將式(I)所示的化合物和式(II)所示的化合物的混合物溶于相似的合適有 機(jī)溶劑(例如氯仿)。將該溶液傾倒在基質(zhì)上并充分干燥。然后，通過與部分i)中所述的 方法相似的方法在水中進(jìn)行老化并將薄膜快速冷卻至結(jié)晶溫度?？梢赃M(jìn)行流延薄膜的光聚 合，同時(shí)將其浸入充分保持在低于Tc的溫度的水中，或者可以用保溫箱在保持在充分低于 Tc溫度的空氣中進(jìn)行等。如部分i)中所述對聚合反應(yīng)過程進(jìn)行跟蹤并證實(shí)反應(yīng)飽和。
iii)單分子層或LB膜的聚合 首先，如下制備單分子層。將式(I)所示的化合物和式(II)所示的化合物的混合 物以合適的濃度(例如10mg/10ml)完全溶于合適的有機(jī)溶劑(水溶性和可揮發(fā)的有機(jī)溶 劑，例如氯仿)。將該溶液鋪展在恒溫槽(例如朗繆爾槽，但不限于此)中的水表面上以制 備(I)和(II)混合物的單分子層。可以通過如下方法獲得(I)和(II)的LB膜的聚合物 使單分子層接觸UV-照射，然后使其水平接觸支持物，如固體基質(zhì)并進(jìn)行物理吸附；或者使 單分子層水平接觸支持物并進(jìn)行物理吸附，然后接觸UV-照射。
優(yōu)選地，本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體中所用的支持物可以不溶于有機(jī)溶劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體中所用的支持物可以為自閉性脂 質(zhì)膜?；蛘?，該支持物可以為二維延伸的。當(dāng)該支持物為自閉性脂質(zhì)膜時(shí)，它可以有利地用 于使用濾器等分離和純化糖鏈。當(dāng)使用二維延伸的支持物時(shí)，它可以有利地用于糖鏈復(fù)制 物和糖鏈芯片。本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體可以與一般脂質(zhì)具有相似的特性。因此，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以應(yīng)用例如脂質(zhì)體、微球等的制備技術(shù)來制備具有自閉型形式的本發(fā)明的捕捉 糖鏈的載體。還可以通過使用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行二維延伸。 優(yōu)選地，有利的是本發(fā)明中所用的二維延伸的支持物是流延薄膜或單分子層。這 類薄膜可用于要求在平板上反應(yīng)的技術(shù)，如質(zhì)譜法、制備糖鏈復(fù)制物和制備糖鏈芯片的方法。在這類所列的技術(shù)中，有利或必需的是在具有薄膜形式的支持物上捕捉糖鏈。用于制 備流延薄膜和單分子層的技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知且可以是例如LB單分子層法、在模具 中澆鑄并進(jìn)行自然蒸發(fā)的方法以及使脂質(zhì)物質(zhì)浮在水表面上以使支持物成形的方法，但不 限于這些。特別地，當(dāng)在例如MALDI-TOF MS中使用這類方法時(shí)，根據(jù)需要，將糖鏈或含糖鏈 物質(zhì)或包括它們的樣品加入到捕捉糖鏈的載體的溶液(優(yōu)選緩沖液，如乙酸緩沖液)中，然 后加入醇如甲醇并傾倒在MALDI-TOF MS平板上且進(jìn)行自然蒸發(fā)以便發(fā)生相互作用。
另一方面，本發(fā)明提供了用于合成可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的方 法。該方法包括以下步驟A)提供可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)；和B)使該官能團(tuán)與 所需物質(zhì)結(jié)合。由于可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)自身為通常不存在的新物 質(zhì)，所以這類方法實(shí)現(xiàn)了提供制備這類新物質(zhì)的技術(shù)的重要作用。特別地，當(dāng)可以與糖鏈特 異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)具有上述優(yōu)選實(shí)施方案中地任意特性時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案的特性修改和使用該方法。例如當(dāng)可以在流體中與醛反應(yīng)的官能團(tuán)選自 羥基氨基、N-烷基羥基氨基、酰肼基、氨基硫脲基和半胱氨酸殘基時(shí)，該方法包括提供含有 這類官能團(tuán)的物質(zhì)(例如參見上述(A'))或提供其中這類官能團(tuán)被保護(hù)的物質(zhì)的步驟以及 使所述物質(zhì)與另一種物質(zhì)(例如可以與支持物發(fā)生相互作用的物質(zhì)或可以用作支持物的 物質(zhì)，如上述(B')中所述的脂質(zhì))結(jié)合的步驟。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過酯鍵或酰胺 鍵實(shí)現(xiàn)與所需物質(zhì)的結(jié)合。因此，優(yōu)選的是A)中所提供的物質(zhì)和B)中所提供的所需物質(zhì) 之一或兩者均具有羥基或氨基或者羧基(或反之亦然)。這類合成方法的實(shí)例可以是例如 圖10中所示的方案，但不限于此。 另一方面，本發(fā)明提供了分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的方法。該 方法包括a)在捕捉糖鏈的載體可以與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)反應(yīng)的條件下，使包含可以與糖 鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體在流體相中與樣品接觸；b)從流體相 中分離捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的復(fù)合物；和c)使該復(fù)合物接觸捕捉糖鏈的 載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)之間的相互作用至少部分被消除的條件。捕捉糖鏈的載體還可以 包含支持物。在該方法中，使用包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)和本發(fā)明的 支持物的捕捉糖鏈的載體，所述物質(zhì)無區(qū)別地與任意糖鏈發(fā)生相互作用。因此，可以實(shí)現(xiàn)如 下作用可以濃縮、純化或分離糖鏈和含糖鏈物質(zhì)，同時(shí)保持天然狀態(tài)的內(nèi)含物比例，這在 現(xiàn)有技術(shù)中是不可能的。或者，本發(fā)明的方法可以提供用于分析內(nèi)含物比例的樣品。由于 可以反映出天然狀態(tài)，所以由取自受試者的樣品可以容易地確定可基于糖鏈進(jìn)行測定的受 試者的狀況?；蛘?，由于反映出天然狀態(tài)的糖鏈被濃縮，所以能夠提供可以有利地用于涉及 生物分子的領(lǐng)域的糖鏈組合物，所述涉及生物分子的領(lǐng)域如醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、保健、食品、化妝品 等。這類糖鏈組合物可以與常規(guī)生物可降解產(chǎn)品相區(qū)別的點(diǎn)在于糖鏈組合物具有基本上與 原始糖鏈結(jié)合狀態(tài)相同的組成比且在必需反映原始糖鏈的各種方面具有重要作用。
可以通過將捕捉糖鏈的載體與樣品混合并使該混合物接觸捕捉糖鏈的載體可以 與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)反應(yīng)的條件來進(jìn)行步驟a)，即，在捕捉糖鏈的載體可以與本發(fā)明的糖 鏈或含糖鏈物質(zhì)反應(yīng)的條件下，使包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖 鏈的載體與樣品在流體相中相接觸。捕捉糖鏈的載體還可以包含支持物。可以用本領(lǐng)域眾 所周知的技術(shù)由所需的活生物體或合成材料制備樣品。當(dāng)需要評價(jià)疾病、病癥或疾患時(shí)，可 以通過從作為評價(jià)對象的生物體中獲得樣品(例如血液、尿等)來制備?？梢砸栽瓲钍褂眠@類樣品或者可以在進(jìn)行反應(yīng)以從含糖鏈物質(zhì)中釋放出糖鏈后使用這類樣品。捕捉糖鏈的 載體可以與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)反應(yīng)的條件如本說明書中所定義，且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員 考慮所述物質(zhì)的特性、量等并使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)酌情進(jìn)行調(diào)整。此處，優(yōu)選地，有 利的是在本發(fā)明的步驟b):從流體相中離析捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的復(fù)合 物中，流體選自水性溶液、有機(jī)溶劑及其混合物。更優(yōu)選地，所述流體為水性溶液。特別地， 優(yōu)選本文中所用的流體為不破壞復(fù)合物的緩沖液(例如具有中性左右PH值的緩沖液)。在 步驟b)中，優(yōu)選地，可以進(jìn)行離心分離。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過考慮所形成的復(fù)合物的特性(特別是相互作用的形式) 并使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)適當(dāng)?shù)倪M(jìn)行步驟C) :S卩，使復(fù)合物接觸捕捉糖鏈的載體與糖 鏈或含糖鏈物質(zhì)之間的相互作用至少部分被消除的條件。這類條件可以是例如存在強(qiáng)酸 等，但不限于這些。然而，在這類條件中，優(yōu)選糖鏈自身不受到破壞。當(dāng)需要使糖鏈保持其 天然狀態(tài)時(shí)，可以特別優(yōu)選這類條件。然而，也可以使用糖鏈可受到破壞的條件，這取決于 純化、分離或濃縮后的目的。優(yōu)選地，糖鏈可以被完全消除。 在上述方法中，可以優(yōu)選在同一容器內(nèi)進(jìn)行步驟a)、 b)和c)，而在另一個(gè)實(shí)施方 案中，可以優(yōu)選在不同容器內(nèi)進(jìn)行所述步驟。通過在同一容器內(nèi)進(jìn)行所述步驟，可以以流線 型方式對糖鏈和含糖鏈物質(zhì)進(jìn)行純化、濃縮和分離，且自動(dòng)化成為可能。然而，當(dāng)反應(yīng)條件、 所用流體等不同時(shí)，有利的是在不同容器內(nèi)進(jìn)行所述步驟。 在本發(fā)明的分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的方法中，可以優(yōu)選在 步驟a)之前進(jìn)行釋放樣品中醛基的步驟。這是因?yàn)槔?，?dāng)糖鏈的醛基被保護(hù)時(shí)，本發(fā)明 的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)可以有利地發(fā)生相互作用。這類釋放醛基的步 驟優(yōu)選包括通過酶處理和/或化學(xué)方法進(jìn)行的給質(zhì)子反應(yīng)。酶處理可以是例如用糖苷酶處 理，且通過化學(xué)方法的處理可以為肼解。在本發(fā)明的方法中，可以單獨(dú)或以組合方式使用酶 處理和化學(xué)方法。可以使用一類酶或多類酶。所述的酶可以為任意的酶，例如來源于植物、 酵母、霉菌等的糖苷酶。所述的酶可以優(yōu)選為來源于黃桿菌屬的N-糖苷酶，但不限于此。 優(yōu)選肼解。當(dāng)使用酶時(shí)，僅分離N-型糖鏈，而在肼解中，可以分離和分析N-型糖鏈和0-型 糖鏈。肼解可以在氣相或液相中進(jìn)行。在液相中進(jìn)行肼解易于操作，但對處理大量樣品而 言并不好，并且因存在接觸試劑的可能性而有安全性的問題。另一個(gè)缺陷在于需要耗時(shí)除 去肼。必要的裝置可以為塊加熱器、螺旋帽小瓶、真空泵等。當(dāng)含糖鏈物質(zhì)為糖肽時(shí)，肽自 身被分解成氨基酸酰肼。氣相肼解易于使用且可以同時(shí)處理大量樣品。必要的裝置可以為 氣相肼解儀、真空泵等。氣相肼解適合于高通量處理，如從大量樣本中搜索疾病標(biāo)記物、蛋 白質(zhì)組分析(翻譯后修飾)等。因此，在本發(fā)明中，能夠單獨(dú)或以組合方式使用這類分離技 術(shù)。 可以優(yōu)選本發(fā)明的分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的方法還包括步 驟d):使樣品接觸含糖鏈物質(zhì)被分離成糖鏈和剩余部分的條件。通過離析包含在樣品中的 含糖鏈物質(zhì)的糖鏈部分，其變得有利，因?yàn)樘擎湹姆治鲎兊萌菀浊铱梢詫⑻擎溩陨碛糜谄?它目的。 含糖鏈物質(zhì)被分離成糖鏈和剩余部分的條件如本說明書中所定義。這類條件可以 使用例如物理手段(例如激光等)、化學(xué)手段(酸性條件)或生物化學(xué)手段(例如酶，如糖 苷酶)，但不限于這些。優(yōu)選地，可以使用通過肼解或糖苷酶的酶處理，但不限于這些。
另一方面，本發(fā)明提供了用于分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的設(shè) 備。該設(shè)備包括a)樣品導(dǎo)入部分；b)具有可以容納流體相的空間的容器；和C)包含可以 與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體，所述容器與樣品導(dǎo)入部分之間可 進(jìn)行流體交換。捕捉糖鏈的載體還可以包含支持物。該設(shè)備利用包含本發(fā)明的可以與糖鏈 特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體以分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖 鏈物質(zhì)。因此，例如，由于捕捉糖鏈的載體無區(qū)別地與任意糖鏈發(fā)生相互作用的特性，所以 該設(shè)備可以濃縮、純化或分離糖鏈和含糖鏈物質(zhì)，同時(shí)保持天然狀態(tài)的內(nèi)含物比例。此外， 可以提供可對反映出天然狀態(tài)的內(nèi)含物比例進(jìn)行分析的樣品。通過使用本發(fā)明的設(shè)備，可 以反映出天然狀態(tài)。因此，由取自受試者的樣品可以容易地確定可以通過糖鏈進(jìn)行測定的 受試者狀況。具有這類優(yōu)點(diǎn)的設(shè)備可以用于提供糖鏈組合物，該糖鏈組合物可以有效地用 于涉及生物分子的領(lǐng)域，如醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、保健、食品、化妝品等。本發(fā)明的設(shè)備提供了在常規(guī) 設(shè)備上無法觀察到的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗軌蛱峁┬碌奶擎溄M合物，它是基本上與原始糖鏈結(jié)合 狀態(tài)相同而非糖鏈物質(zhì)被減少的糖鏈組合物。 本發(fā)明的設(shè)備中所用的a)樣品導(dǎo)入部分可以具有任意形式，只要它是可使樣品 被導(dǎo)入的部分。由于目的在于分離、濃縮或純化，所以優(yōu)選樣品導(dǎo)入部分不被污染。然而， 只要它不被糖鏈或含糖鏈物質(zhì)污染即可，它可以被其它物質(zhì)(單純蛋白質(zhì)等)污染。
本發(fā)明的設(shè)備中所用的b)具有可以容納流體相的空間的容器可以為任意類型的 容器，只要它不會(huì)完全除去糖鏈與本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體之間的相互作用。優(yōu)選地，該容 器可以為不影響這類相互作用的容器。更優(yōu)選地，有利的是捕捉糖鏈的載體被結(jié)合。優(yōu)選該 類與載體的結(jié)合通過載體中的支持物進(jìn)行。此外，在捕捉糖鏈的載體中，優(yōu)選可以與糖鏈特 異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)與支持物彼此結(jié)合(優(yōu)選通過共價(jià)鍵)。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過 考慮預(yù)期反應(yīng)和設(shè)備的應(yīng)用目的并使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)可以容易地制造這類容器。
本發(fā)明的設(shè)備中所用的c)包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉 糖鏈的載體可以為本發(fā)明的任意的捕捉糖鏈的載體。捕捉糖鏈的載體還可以包含支持物。 因此，這類捕捉糖鏈的載體可以為任意類型的載體，只要它與本說明書中所述的實(shí)施方案 相關(guān)，并且為了將其應(yīng)用于所述設(shè)備，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要改變該載體。當(dāng)然，這 類改變也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這類改變的實(shí)例可以是改變本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體以 便適合于固定在容器上，但不限于此。這類改變可以為例如進(jìn)一步添加反應(yīng)性官能團(tuán)、將可 以與這類反應(yīng)性官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)定位在容器上和使它們發(fā)生反應(yīng)，但不限于這些。
另一方面，本發(fā)明提供了用于分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的系 統(tǒng)。該系統(tǒng)包括A) —種設(shè)備，其包括a)樣品導(dǎo)入部分；b)具有可以容納流體相的空間的 容器；和C)包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體，所述容器可 以與樣品導(dǎo)入部分進(jìn)行流體交換；B)離析流體相中捕捉糖鏈的載體與糖鏈的復(fù)合物的手 段；和C)使所述復(fù)合物接觸捕捉糖鏈的載體與糖鏈之間的相互作用至少部分被消除的條 件的手段。捕捉糖鏈的載體還可以包含支持物。通過提供這類系統(tǒng)，本發(fā)明可用于提供糖 鏈組合物，該糖鏈組合物可以有利地用于涉及生物分子的領(lǐng)域，如醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、保健、食品、 化妝品等。 本發(fā)明的系統(tǒng)中所用的A) —種設(shè)備可以是以上所述的本發(fā)明的設(shè)備。然而，優(yōu)選 將該設(shè)備改進(jìn)成一種形狀，該形狀可容納或連接B)離析流體相中捕捉糖鏈的載體與糖鏈
45的復(fù)合物的手段和C)使所述復(fù)合物接觸捕捉糖鏈的載體與糖鏈之間的相互作用至少部分 被消除的條件的手段，或者提供這些手段。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述手段C)是釋放醛的手段。優(yōu)選地，該手段C)可以為釋 放醛的酶(酶如糖苷酶)或化學(xué)物質(zhì)(例如用于腙分解的試劑)。 本發(fā)明的系統(tǒng)中所用的B)離析流體相中捕捉糖鏈的載體與糖鏈的復(fù)合物的手段 可以為任意類型的手段，只要它能夠離析該復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過考慮各種參 數(shù)如復(fù)合物的特性、設(shè)備的結(jié)構(gòu)等和考慮本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來選擇合適的復(fù)合物離析 手段。這類裝置的優(yōu)選實(shí)例可以是離心分離器、濾器和色譜儀，但不限于這些。更優(yōu)選地， 可以使用濾器。這類濾器可以優(yōu)選具有截留復(fù)合物而使未成為復(fù)合物的組分通過的結(jié)構(gòu)。 作為具有這類結(jié)構(gòu)的濾器，例如，計(jì)算復(fù)合物的粒徑和預(yù)計(jì)存在的組分的粒徑，可以使用具 有介于所述粒徑之間的中間值的孔徑的濾器。 本發(fā)明的系統(tǒng)中所用的C)使復(fù)合物接觸捕捉糖鏈的載體與糖鏈之間的相互作用 至少部分被消除的條件的手段可以為任意類型的手段，只要它能夠提供這類條件。如果可 以通過交換溶液提供這類條件，則容納溶液的容器可以是合適的。如果可以通過添加新組 分(固體或液體)實(shí)現(xiàn)這類條件，則該手段可以為容納附加溶液的容器。本領(lǐng)域技術(shù)人員 通過考慮提供的條件并使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)可以容易地制造和處理這類手段或這 類容器。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)還包括D)使樣品接觸含糖鏈物質(zhì)被分離 成糖鏈和剩余部分的條件。這類手段可以為任意類型的手段，只要它可以提供實(shí)現(xiàn)這類分 離的條件。如果可以通過交換溶液提供這類條件，則容納該溶液的容器可以是合適的。如 果可以通過添加新組分(固體或液體)來實(shí)現(xiàn)這類條件，則該手段可以為容納附加溶液的 容器。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮提供的條件并使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)可以容易地制造 和處理這類手段或這類容器。 另一方面，本發(fā)明提供了制備用于分離、濃縮或純化樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì) 的設(shè)備的方法。該方法包括以下步驟a)提供可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)和 支持物；b)使可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)與支持物發(fā)生相互作用而產(chǎn)生捕 捉糖鏈的載體；和c)將捕捉糖鏈的載體固定在容器上。該方法使用了本發(fā)明的捕捉糖鏈的 載體。由于捕捉糖鏈的載體無區(qū)別地與任意鏈發(fā)生相互作用，所以可以通過上述方法制備 可以濃縮、純化和分離糖鏈和含糖鏈物質(zhì)、同時(shí)保持天然狀態(tài)的內(nèi)含物比例的設(shè)備。
在本發(fā)明方法中進(jìn)行的步驟a)提供可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)和 支持物中，可以使用本說明書中所述的可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)。支持物 也可以是本說明書中所述的支持物。本說明書中還描述了作為可以與糖鏈特異性地發(fā)生相 互作用的物質(zhì)的優(yōu)選實(shí)施方案且在上述方法中也可以使用該優(yōu)選實(shí)施方案。本說明書中還 描述了作為支持物的優(yōu)選實(shí)施方案且在上述方法中也可以使用該優(yōu)選實(shí)施方案。
本發(fā)明的方法中進(jìn)行的步驟b)使可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)與支 持物發(fā)生相互作用而產(chǎn)生捕捉糖鏈的載體也可以通過組合本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來進(jìn)行。 可以通過使可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)與支持物接觸足以進(jìn)行相互作用的 條件(例如緩沖液、溶劑的極性、溫度、PH、鹽濃度、壓力等)來實(shí)現(xiàn)這類捕捉糖鏈的載體的 制備。設(shè)定這類條件所需的參數(shù)的設(shè)定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員
46可以通過使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)設(shè)定這類條件并考慮與相互作用相關(guān)的各種參數(shù)來 進(jìn)行相互作用反應(yīng)，所述的與相互作用相關(guān)的各種參數(shù)如相互作用類型、糖鏈的類型、可以 與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)(例如具有可以在流體中與醛基反應(yīng)的官能團(tuán)的物 質(zhì))和支持物的類型(脂質(zhì))。 本發(fā)明的方法中進(jìn)行的步驟c)將捕捉糖鏈的載體固定在容器上也可以通過組合 本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來進(jìn)行?？梢酝ㄟ^使捕捉糖鏈的載體和容器接觸足以進(jìn)行相互作用 的條件(例如緩沖液、溶劑的極性、溫度、PH、鹽濃度、壓力等)來實(shí)現(xiàn)這類固定。設(shè)定這類 條件所需的參數(shù)的設(shè)定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過使用本 領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)設(shè)定這類條件并考慮與相互作用相關(guān)的各種參數(shù)來進(jìn)行固定，所述的 與相互作用相關(guān)的各種參數(shù)如相互作用的類型、捕捉糖鏈的載體的類型和容器的材料。
另一方面，本發(fā)明提供了用于分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的方法。該方法包 括以下步驟a)在捕捉糖鏈的載體可以與糖鏈反應(yīng)的條件下，使包含可以與糖鏈特異性地 發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體在流體相中與樣品接觸；b)使捕捉糖鏈的載體和 樣品接觸所需的嚴(yán)格條件；和c)鑒定與捕捉糖鏈的載體發(fā)生相互作用的物質(zhì)。捕捉糖鏈的 載體還可以包含支持物。在該方法中，使用了本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體。由于捕捉糖鏈的 載體無區(qū)別地與任意糖鏈發(fā)生相互作用的特性，所以可以分析糖鏈和含糖鏈物質(zhì)的內(nèi)含物 比例，同時(shí)保持天然狀態(tài)的內(nèi)含物比例。照此，可以反映出天然狀態(tài)。因此，例如，由取自受 試者的樣品可以容易地確定可以用糖鏈進(jìn)行測定的受試者狀況?；蛘撸瑵饪s反映出天然狀 態(tài)的糖鏈。因此，能夠提供分析值，該分析值可以有效地用于涉及生物分子的領(lǐng)域，如醫(yī)藥、 農(nóng)業(yè)、保健、食品、化妝品等。這類分析值在需要可靠地反映出原始糖鏈的類型的各方面具 有重要作用，因?yàn)樾纬蓴?shù)據(jù)基礎(chǔ)的樣品中的糖鏈組成具有與原始糖鏈結(jié)合狀態(tài)基本上相同 的組成比例。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法的分析對象可以為來源于包括或預(yù)計(jì)包括 病因的受試者的樣品。可以直接使用這類樣品或者可以進(jìn)行不影響糖鏈分析的處理。用本 發(fā)明的方法分析的樣品可以來源于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒、真菌等且優(yōu)選來源于人或與人 生命相關(guān)的活生物體(例如致病體、家畜、農(nóng)作物等)。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在本發(fā)明的分析方法中，在支持捕捉糖鏈的載體的芯片
上進(jìn)行步驟a)-c)。芯片如本說明書不同部分中所述且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過組合本領(lǐng)
域眾所周知的技術(shù)適當(dāng)構(gòu)建適合于進(jìn)行本說明書公開的上述步驟的結(jié)構(gòu)。 優(yōu)選地，本發(fā)明的分析方法中所用的捕捉糖鏈的載體以陣列方式排列在芯片上。
以陣列形狀排列的分析設(shè)備(裝置)在本說明書中也稱作糖鏈陣列。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分析方法中的鑒定步驟c)可以包括物理方法(質(zhì) 譜分析、順1 ^-射線分析、元素分析等)、化學(xué)方法(觀察化學(xué)特異性反應(yīng))、生物化學(xué)方法 (測定酶的底物特異性等)或生物學(xué)方法(活生物體(例如微生物，如細(xì)菌)的反應(yīng))。在 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的分析方法中的鑒定步驟c)包括質(zhì)譜分析。這類質(zhì)譜分析可 以是例如MALDI-T0F MS，但不限于此?；蛘?，可以使用NMR。 另一方面，本發(fā)明提供了制備包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品的糖鏈復(fù)制物的方法。 該方法包括以下步驟a)使可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)在二維延伸的支持 物表面上定位并使未定位有該物質(zhì)的表面與固體箔接觸；和b)使包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的
47樣品與固體箔接觸。由于這類糖鏈復(fù)制物反映出糖鏈天然存在時(shí)的狀態(tài)、內(nèi)含物比例、場 所等，所以可以提供如下優(yōu)點(diǎn)通過檢查糖鏈復(fù)制物可以可靠和便利地檢查糖鏈復(fù)制物所 來源的受試者的狀態(tài)。在現(xiàn)有技術(shù)中，甚至不存在這類糖鏈復(fù)制物的構(gòu)思。因此，作為直接 診斷的手段的有用性是巨大的?？梢酝ㄟ^以下方法制備這類糖鏈復(fù)制物將本發(fā)明的捕捉 糖鏈的載體中的二維延伸的支持物(例如脂質(zhì)膜)的表面(優(yōu)選疏水表面)吸附在固體箔 (優(yōu)選透明的固體箔)如玻璃上，粘附生物樣品以便在固體箔上轉(zhuǎn)移來源于生物樣品平面 的糖鏈二維圖像。因此，其中易于發(fā)生疏水相互作用的支持物可以優(yōu)選用作本文的支持物。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，有利的是包括這樣的步驟當(dāng)制備糖鏈復(fù)制物時(shí)，標(biāo)記固 體箔中的樣品的所需特征。此處，所需特性可以為可用肉眼觀察到的特征如損傷或者可以 為可用其它手段觀察到的特征。通過標(biāo)記所需特征如損傷并將標(biāo)記與鑒定的糖鏈相關(guān)聯(lián)， 可以研究糖鏈與通常未知的某些特征之間的關(guān)系?；蛘撸绻@種關(guān)系是已知的，則僅通過 鑒定糖鏈就可以以定性或定量的方式檢查所需特征如損傷的狀態(tài)。 另一方面，本發(fā)明提供了包含或預(yù)計(jì)包括糖鏈的樣品的糖鏈復(fù)制物。該糖鏈復(fù)制 物包含a)固體箔；b)定位有可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的二維延伸的支 持物，該支持物用于與固體箔發(fā)生相互作用；和C)來源于包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品的組 分，該組分被可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)捕捉。由于這類糖鏈復(fù)制物反映出 該糖鏈天然存在時(shí)的狀態(tài)、內(nèi)含物比例、場所等，所以可以提供以下優(yōu)點(diǎn)通過檢查糖鏈復(fù) 制物可以可靠和便利地檢查糖鏈復(fù)制物所來源的受試者的狀況?？梢酝ㄟ^以下方法制備這 類糖鏈復(fù)制物將本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體中的二維延伸的支持物(例如脂質(zhì)膜)的表面 (優(yōu)選疏水表面)吸附在固體箔(優(yōu)選透明的固體箔)如玻璃上，粘附生物樣品以便在固體 箔上轉(zhuǎn)移來源于生物樣品平面的糖鏈的二維圖像?？梢杂米鞴腆w箔的材料可以優(yōu)選為能夠 符合平面形狀的材料，如生物組織或組織片。因此，優(yōu)選可塑性材料而非硬材料如玻璃。當(dāng) 使用可見光線進(jìn)行觀察時(shí)，優(yōu)選所述材料是透明的。當(dāng)用紫外線進(jìn)行觀察時(shí)，優(yōu)選傳輸紫外 線的特性。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使與樣品的所需特征(例如損傷或疾病損害等)相關(guān)的 標(biāo)記固定在本發(fā)明的糖鏈復(fù)制物中的固體箔上。因此，與所需特征的相關(guān)性變得容易。
—方面，本發(fā)明提供了用于分析包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品上的糖鏈的方法。該 方法包括以下步驟a)將可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)在二維延伸的支持物 表面上定位并使未定位有該物質(zhì)的表面與固體箔接觸；b)使包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品 與固體箔接觸；和c)分析固體箔表面上存在的糖鏈。這類固體箔與用于上述糖鏈復(fù)制物的 固體箔相同且該方法可以稱作使用糖鏈復(fù)制物的分析方法。使用糖鏈復(fù)制物的分析方法可 以分析糖鏈，同時(shí)具有二維圖像保持原狀的樣品。因此，本發(fā)明的使用復(fù)制物的分析方法可 以有效地提供使用現(xiàn)有技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)的二維分析方法。此處，在步驟a)和b)中，所述技術(shù) 與如上所述用于糖鏈復(fù)制物的制備方法相似。就上述步驟c)中的糖鏈分析而言，如本說明 書中所述，可以使用各種方法(例如物理方法，如生理學(xué)方法，如質(zhì)譜、化學(xué)方法、生物化學(xué) 方法、生物學(xué)方法等)。例如，這類分析步驟可以包括使固體箔表面離子化、然后進(jìn)行質(zhì)譜分 析。 優(yōu)選地，這類分析方法還包括以下步驟標(biāo)記樣品的所需特征；并將標(biāo)記與通過 質(zhì)譜分析鑒定的糖鏈相關(guān)聯(lián)。通過包括這類步驟，可以即刻并以二維圖像形式分析所需特
48征。 另一方面，本發(fā)明提供了用于分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的設(shè)備，該設(shè)備包 括a)包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體；和b)鑒定糖鏈的 手段。捕捉糖鏈的載體還可以包含支持物。這類設(shè)備可以便利和可靠地鑒定糖鏈。通常， 包含任意類型糖鏈的樣品均可以成為研究對象。因此，該設(shè)備還可以以自動(dòng)化設(shè)備的形式 被制備?？梢杂帽绢I(lǐng)域眾所周知的技術(shù)實(shí)施這類自動(dòng)化。 本文中所包括的捕捉糖鏈的載體如本說明書中所述，當(dāng)它們適合于所述設(shè)備時(shí)， 可以適當(dāng)?shù)厥褂闷鋬?yōu)選實(shí)施方案。鑒定糖鏈的手段可以為使用各種方法(例如物理方法如 質(zhì)譜、化學(xué)方法、生物化學(xué)方法、生物學(xué)方法等)的任意手段。為了使所述設(shè)備小型化，有利 的是使用例如生物化學(xué)手段(特異性地結(jié)合糖鏈的抗體、凝集素等)或使用酶如糖苷酶。
另一方面，本發(fā)明提供了用于分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的裝置，其包含定 位有可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的支持物。這類裝置可以為任意形狀或可以 為任意大小。優(yōu)選地，在這種裝置中，可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)以陣列形式 排列在支持物上。更優(yōu)選地，該裝置為芯片形狀。當(dāng)使用芯片形狀的裝置時(shí)，例如，可以使 用具有較低硬度的材料如尼龍薄膜或具有高硬度的材料如玻璃。當(dāng)使用尼龍薄膜等時(shí)，可 以使用便利的分析系統(tǒng)分析結(jié)果。為了分析高密度物質(zhì)，優(yōu)選使用具有硬度的材料如玻璃。 因此，當(dāng)需要使用糖鏈芯片形式的裝置時(shí)， 一般優(yōu)選使用硬材料如玻璃作為支持物(或基 質(zhì))。 另一方面，本發(fā)明提供了用于診斷或區(qū)分受試者的方法。該方法包括以下步驟a) 使用本發(fā)明的裝置分析來源于受試者的樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)。該裝置為上述裝置， 優(yōu)選地，捕捉糖鏈的載體以陣列形式排列，且更優(yōu)選地，該裝置為芯片形狀。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷或測定方法中進(jìn)行的分析步驟包括檢測針 對糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的抗體和/或凝集素的存在。 另一方面，本發(fā)明提供了用于分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包 括a)包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體；b)使捕捉糖鏈的 載體和樣品接觸所需的嚴(yán)格條件的手段；和c)鑒定糖鏈的手段。捕捉糖鏈的載體還可以包 含支持物。該系統(tǒng)使用本發(fā)明的捕捉糖鏈的載體。由于捕捉糖鏈的載體無區(qū)別地與任意糖 鏈發(fā)生相互作用的特性，所以可以用上述系統(tǒng)分析糖鏈和含糖鏈物質(zhì)的內(nèi)含物比例，同時(shí) 該內(nèi)含物比例保持其天然狀態(tài)。照此，可以反映出天然狀態(tài)。因此，例如，用取自受試者的 樣品可以容易地確定可以用糖鏈進(jìn)行測定的所述受試者的狀況。或者，反映出天然狀態(tài)的 糖鏈被濃縮。因此，能夠提供可有效用于涉及生物分子領(lǐng)域的分析值，所述的涉及生物分子 的領(lǐng)域如醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、保健、食品、化妝品等。這類分析值在要求可靠地反映出原始糖鏈類型 的各方面中具有重要作用，因?yàn)樾纬蓴?shù)據(jù)基礎(chǔ)的樣品的糖鏈組成具有與原始糖鏈結(jié)合狀態(tài) 基本上相同的組成比例。 本發(fā)明的系統(tǒng)中所用的a)包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉 糖鏈的載體如本說明書中所述，且其優(yōu)選實(shí)施方案也可以用于該系統(tǒng)。捕捉糖鏈的載體還 可以包含支持物。 就本發(fā)明中所用的b)使捕捉糖鏈的載體和樣品接觸所需的嚴(yán)格條件的手段而 言，也可以使用本說明書中所述的技術(shù)，且其優(yōu)選實(shí)施方案也可以用于該系統(tǒng)。
本發(fā)明中所用的c)鑒定糖鏈的手段也可以為任意類型的手段，但可以為使用不 同方法(例如物理方法如質(zhì)譜法、化學(xué)方法、生物化學(xué)方法、生物學(xué)方法等)的手段。為了 使設(shè)備小型化，有利的是使用例如生物化學(xué)手段(特異性地與糖鏈結(jié)合的抗體、凝集素等) 或酶如糖苷酶?；蛘?，當(dāng)系統(tǒng)可能具有大的尺寸時(shí)，鑒定糖鏈的手段可以為質(zhì)譜儀。
另一方面，本發(fā)明提供了制備用于分析樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的設(shè)備的方 法。該方法包括以下步驟a)提供可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)；和b)使可以 與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)與支持物發(fā)生相互作用以產(chǎn)生捕捉糖鏈的載體。這類 方法具有有用性的方面在于它可以提供現(xiàn)有技術(shù)中不存在的用于分析樣品中的糖鏈或含 糖鏈物質(zhì)的設(shè)備。優(yōu)選地，該制備方法還包括將捕捉糖鏈的載體定位在容納用的容器上的 步驟。 另一方面，本發(fā)明提供了用于制備糖鏈陣列的方法。該方法包括以下步驟a)提 供支持物；b)使可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)以所需排列定位。作為支持物， 可以使用本說明書中所述的支持物。該方法中的所需排列可以為規(guī)則排列(例如柵格)或 者可以為不規(guī)則排列。優(yōu)選地，可以使用規(guī)則排列。 另一方面，本發(fā)明提供了用于分析與樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物 質(zhì)的方法。該方法包括以下步驟a)使包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕 捉糖鏈的載體在流體相中與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)發(fā)生相互作用以便固定；b)在預(yù)計(jì)特異性 地與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)可以與糖鏈反應(yīng)的條件下，使捕捉糖鏈的載體與樣品接 觸；c)使捕捉糖鏈的載體與樣品的混合物接觸所需的嚴(yán)格條件；和d)鑒定特異性與糖鏈或 含糖鏈物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)。捕捉糖鏈的載體還可以包含支持物。在該方法中，與上述方法相 反，可以分析預(yù)計(jì)包含在樣品中的、特異性地與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)結(jié)合的未知物質(zhì)。這類特 異性地與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)可以為抗體或凝集素，但不限于這些。當(dāng)它為抗體 時(shí)，推定在受試者中存在為抗體靶標(biāo)的糖鏈。因此，當(dāng)通過該方法測定這類抗體的存在時(shí)， 可以確定所述受試者內(nèi)存在所述特定的糖鏈。如果已知這類糖鏈與特定疾病、病癥或疾患 相關(guān)，則能夠根據(jù)抗體的存在來診斷這類疾病、病癥或疾患。因此，本文中所用的樣品可以 來源于預(yù)計(jì)具有損傷的受試者。與抗體和凝集素的相互作用相關(guān)的技術(shù)在本領(lǐng)域中也是眾 所周知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過適當(dāng)?shù)亟M合這類眾所周知的技術(shù)可以容易地進(jìn)行上述測定 等。通過本發(fā)明的方法鑒定的、與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)結(jié)合的新物質(zhì)也包括在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。通過使用這類新物質(zhì)，可以完成本發(fā)明的方法、設(shè)備、系統(tǒng)。 因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括以下步驟e)使抗體或凝集 素和與其存在相關(guān)的疾病、病癥、疾病損害或疾患相關(guān)聯(lián)。用于進(jìn)行這類步驟的技術(shù)在本領(lǐng) 域中眾所周知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡x擇和使用這類技術(shù)。 另一方面，本發(fā)明提供了用于分析與樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物
質(zhì)的裝置。該裝置包括捕捉糖鏈的載體，該載體包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的
物質(zhì)，其中糖鏈或含糖鏈物質(zhì)通過特異性相互作用固定在載體上。捕捉糖鏈的載體還可以
包含支持物。這類裝置可以分析預(yù)計(jì)包含在樣品中的特異性地與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)結(jié)合的
未知物質(zhì)。這類用于固定的方法可以通過例如選擇共價(jià)鍵作為相互作用而實(shí)現(xiàn)。 另一方面，本發(fā)明提供了用于分析與樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物
質(zhì)的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括a)包含捕捉糖鏈的載體的裝置，所述載體包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)，其中糖鏈或含糖鏈物質(zhì)通過特異性相互作用固定在載體上；b)樣
品導(dǎo)入部分；c)使捕捉糖鏈的載體與樣品的混合物接觸所需的嚴(yán)格條件的手段；和d)鑒定
特異性地與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的手段。捕捉糖鏈的載體還可以包含支持物。這
類裝置可以分析預(yù)計(jì)包含在樣品中的特異性與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)結(jié)合的未知物質(zhì)。 可以如本說明書中以上所述制備本發(fā)明的系統(tǒng)中所用的a)包含捕捉糖鏈的載體
的裝置，所述載體包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)，其中糖鏈或含糖鏈物質(zhì)
通過特異性相互作用固定在載體上。捕捉糖鏈的載體還可以包含支持物。 本發(fā)明的系統(tǒng)中所用的b)樣品導(dǎo)入部分如本說明書中所述且可以使用本領(lǐng)域眾
所周知的技術(shù)制備。 本發(fā)明的系統(tǒng)中所用的c)使捕捉糖鏈的載體與樣品的混合物接觸所需的嚴(yán)格條 件的手段如本說明書中所述且可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備。 本發(fā)明的系統(tǒng)中所用的d)鑒定特異性地與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的手段 如本說明書中所述且可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備。 另一方面，本發(fā)明提供了具有增加的糖鏈含量的糖鏈組合物，其通過使包含糖鏈 的樣品與可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)接觸、然后在相互作用的樣品中分離糖 鏈而獲得。在這類糖鏈組合物中，保持了天然存在的糖鏈和/或含糖鏈物質(zhì)，而糖鏈和含糖 鏈物質(zhì)以外的物質(zhì)被減少。因此，可以提供具有通過現(xiàn)有技術(shù)如通過使用凝集素、抗體等不 能實(shí)現(xiàn)的組成比例的組合物。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)可以以一定水 平或更高水平與任意糖鏈特異性地發(fā)生相互作用。因此，在這類糖鏈組合物中，反映出了天 然存在的糖鏈和/或含糖鏈物質(zhì)的內(nèi)含物比例，而糖鏈和含糖鏈物質(zhì)以外的物質(zhì)被減少。因 此，可以提供具有通過現(xiàn)有技術(shù)如通過使用凝集素、抗體等不能實(shí)現(xiàn)的組成比例的組合物。
這類糖鏈組合物可以用作藥物。這類糖鏈組合物還可以用作食品、保健食品、化妝 品、聚合物材料(生物可降解的聚合物等)等?；蛘?，這類糖鏈組合物可以用作手術(shù)材料 (移植物)等。如本說明書中所述，可以通過使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備和使用用作藥 物的形式。 此外，另一方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的糖鏈組合物的檢測試劑盒。這類檢測 試劑盒可以提供便利且精確的結(jié)果，因?yàn)樗龅奶擎溄M合物可靠地反映出糖鏈來源于所述 樣品來源時(shí)的糖鏈組成比例。 將本說明書中引用的參考文獻(xiàn)如科學(xué)文件、專利和專利申請引入本文作為參考， 就如同在本說明書中詳細(xì)描述其全部內(nèi)容一樣。
已經(jīng)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案闡述了本發(fā)明。然而，本發(fā)明不應(yīng)被曲解為僅限
于這些實(shí)施方案。注意本發(fā)明的范圍應(yīng)當(dāng)僅由權(quán)利要求的范圍來解釋。應(yīng)當(dāng)理解的是，根 據(jù)本發(fā)明具體的優(yōu)選實(shí)施方案的公開內(nèi)容并基于常用的技術(shù)知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實(shí)
施等同范圍的實(shí)施方案。注意將本說明書中引用的專利、專利申請和文件引入本文作為參 考，就如同在本說明書中詳細(xì)描述了其內(nèi)容一樣。
實(shí)施例 在下文中，參照實(shí)施例更具體地描述了本發(fā)明的結(jié)構(gòu)。然而，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。(實(shí)施例1 :可光聚合的羥基氨基脂質(zhì)4的合成) 根據(jù)圖2中所示的合成途徑合成本發(fā)明的可光聚合的羥基氨基脂質(zhì)4。
(1.1化合物2的合成) 將10，12-二十五碳二炔酸l(可由Lancaster獲得，1.6g)和2，2'-(亞乙二氧 基)二 (乙胺)(可由Aldrich獲得，5ml)溶于300ml氯仿。在0°C的溫度下加入1_乙 基-3(3'-二乙基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(可由Calbiochem獲得，3. 3g)。將該反應(yīng)混 合物在(TC下攪拌1小時(shí)，然后在室溫下攪拌8小時(shí)。將反應(yīng)溶液用水和飽和鹽溶液洗滌并 用硫酸鈉干燥。在通過過濾除去硫酸鈉后，蒸除溶劑，用硅膠柱純化殘余物(氯仿甲醇= 7 : 3)，得到目標(biāo)物質(zhì)2。產(chǎn)率為70%。
(1.2化合物3的合成) 將化合物2(lg， 1. 98,1)和Boc-氨基-羥乙酸(可由Calbiochem獲得，0. 9g) 溶于含有5%甲醇的氯仿。在ot:的溫度下向該溶液中加入1-乙基-3 (3' - 二乙基氨基丙 基)碳二亞胺鹽酸鹽(2. Og， 10. 4mmo1)，然后在室溫下攪拌12小時(shí)。將該溶液用水和飽和 鹽溶液洗滌并用硫酸鈉干燥。在蒸除溶劑后，在硅膠柱上進(jìn)行純化(氯仿甲醇=9 : 1)， 得到目標(biāo)物質(zhì)3。產(chǎn)率為94%。
(1.3化合物4的合成) 在(TC的溫度下，將化合物3(0.5g)溶于二氯甲烷(50ml)，加入三氟乙酸(10ml)。 將該溶液在0t:下攪拌5小時(shí)，然后加入甲苯(10ml)并蒸除所有溶劑。定量獲得目標(biāo)物 質(zhì)4。通過NMR和質(zhì)譜對該化合物進(jìn)行鑒定。'H-NMR(500MHz， CDC13) 6. 456 (s， 1H) ， 4. 41 (s， 2H) ， 3. 62-3. 56 (m， 6H) ， 3. 56—3. 48 (m， 4H) ， 3. 46—3. 41 (m， 2H) ， 2. 214 (t， J = 6. 94Hz， 4H)， 1. 6-1. 2(m，36H) ，0. 857(t， J = 7.25Hz，3H) ;13C_NMR(125MHz， CDC13) 175. 69， 157. 90， 114. 44,77. 633,77. 441,72. 465,70. 046,70. 011,69. 825,69. 212,65. 313,65. 233,39. 526， 39. 0312,36. 334,31. 917,29. 644,29. 624,29. 608,29. 478,29. 338,29. 134,29. 097， 29. 076， 28. 893， 28. 873， 28. 762， 28. 375， 28. 303， 25. 744， 22. 685，19.199，19.156，14.100 ; ESI-Mass(pos)計(jì)算值[M+H]+C33H6。N305 :578. 45，測定值578. 42。
(實(shí)施例2 :捕捉糖鏈的聚合物的制備方法) 將實(shí)施例1中合成的可光聚合的羥基氨基脂質(zhì)4(7mg)和為可光聚合的基質(zhì)分子 5的二二十五碳二炔?；字Ｄ憠A(30mg)溶于10ml氯仿并放入200ml回收瓶中。用蒸 發(fā)器蒸除氯仿，向?yàn)闅堄辔锏闹|(zhì)混合物中加入30ml超純水。在將該混合物在7(TC下加熱 10分鐘后，使用探針型超聲設(shè)備將其超聲處理15分鐘，此后該溶液變澄清。將該溶液快速
冷卻至4t:并通過抽吸器將該溶液充分脫氣。然后，將該溶液轉(zhuǎn)移至石英錐形瓶中并通過使
用相距10cm的紫外線燈(8W， 100V)用光照射，同時(shí)緩慢通入氬氣。將照射進(jìn)行30分鐘，在 此過程中將溶液于4t:下保持在水浴中。使從紅色改變成橙色的該溶液通過450微米濾器 將其純化，得到球形的捕捉糖鏈的聚合物(圖3)。通過電子顯微鏡證實(shí)了捕捉糖鏈的聚合 物的形狀。電子顯微鏡檢查的結(jié)果如圖4中所示。(實(shí)施例3 :捕捉糖鏈的聚合物與酶釋放的糖蛋白的糖鏈的純化和分離)
(3. 1純化的來源于人的免疫球蛋白的糖鏈圖譜分析) [OS22][糖鏈的釋放]
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將純化的來源于人的免疫球蛋白(可由Sigma獲得)溶于0. 01N鹽酸水溶液，通 過使用0. IN鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2并在9(TC下進(jìn)行加熱處理60分鐘。在熱處理后，將該溶液用 碳酸氫銨溶液中和并凍干。將凍干產(chǎn)物溶于50mM的碳酸氫銨，向其中加入以重量計(jì)相當(dāng)于 免疫球蛋白百分之一的胰蛋白酶并使反應(yīng)在37t:下持續(xù)進(jìn)行24小時(shí)。然后，將該混合物在 9(TC下加熱15分鐘并冷卻至室溫。然后，加入l單位/lmg免疫球蛋白的N-糖苷酶(來源 于黃桿菌屬的酶在大腸桿菌中表達(dá)，可由Roche獲得)并使反應(yīng)在37t:下持續(xù)進(jìn)行24小 時(shí)。然后，將該混合物在9(TC下加熱15分鐘以終止反應(yīng)。將5mg來自該混合物的免疫球蛋 白用于糖鏈純化試驗(yàn)。
[糖鏈捕捉與分離和純化] 圖5表示使用捕捉糖鏈的聚合物進(jìn)行具體分離和純化過程的示意圖。向800 iU實(shí) 施例2中制備的捕捉糖鏈的聚合物溶液中加入10 iU 3N乙酸緩沖液(pH 5. 6)。然后，向其 中加入200 ii 1上述來源于免疫球蛋白的糖鏈混合物溶液(將5mg來源于人的免疫球蛋白 溶于lml碳酸氫銨溶液)，向其中加入200 ii 1甲醇并將該溶液在37t:下保持12小時(shí)。使 用Microcon(可由Millipore獲得)在10， 000轉(zhuǎn)/分鐘和10°C的溫度條件下進(jìn)行離心過 濾40分鐘。向聚合物濃縮物中加入200 ii 1超純水，在相同條件下再次進(jìn)行離心過濾。向 濃縮物(幾Pi)中加入100 iil超純水，得到聚合物濃縮物。 [O526][糖鏈的釋放過程] 將質(zhì)子型離子交換樹脂(可由Aldrich獲得，Amberlite IR-120)加入到獲得的聚 合物濃縮物中并將該混合物在37t:下攪拌1小時(shí)。使用Microcon(可由Millipore獲得) 將該溶液在10， 000轉(zhuǎn)/分鐘和l(TC的溫度條件下進(jìn)行離心過濾30分鐘并回收濾液。 [O528][糖鏈的質(zhì)譜分析] 通過使用MALDI-T0F MS (可由Bruker獲得，Bif lex)對濾液進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得 了6個(gè)信號(hào)(未顯示)。作為用于測定的基質(zhì)試劑，使用2，5-二羥基苯甲酸(可由Fluka 獲得)。所用的來源于抗體的糖鏈結(jié)構(gòu)是已知的(N-結(jié)合型糖鏈)且確定6個(gè)質(zhì)譜信號(hào)均 來源于糖鏈。在用捕捉糖鏈的聚合物純化前MALDI-TOF MS的信號(hào)極為復(fù)雜。因此，可以證 實(shí)糖鏈被選擇性地分離和純化。
[與HPLC的比較] 另一方面，向5mg來自進(jìn)行N-糖苷酶處理的樣品的免疫球蛋白中加入50iig鏈 霉蛋白酶(可由Calbiochemi獲得)并使該反應(yīng)在37°C下持續(xù)進(jìn)行16小時(shí)。然后，將 該混合物在9(TC下加熱15分鐘以終止該反應(yīng)。通過使用生物凝膠(可由Bio-rad獲 得)進(jìn)行凝膠過濾純化反應(yīng)物，使用2-氨基吡啶鹽酸溶液和氰基三氫硼化鈉(sodium cyanotrihydroborate)將糖鏈與妣啶基胺衍生物結(jié)合并使用S印hadex(可由Amersham Biotech獲得)除去未反應(yīng)的2-氨基吡啶。通過反相系統(tǒng)柱高效液相色譜法分析糖鏈(圖 6)。如已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的那樣(Anal. Biochemistry, 163,489-499， 1987)，認(rèn)為來源于免疫球蛋白 的糖鏈組成為圖7中所示的那樣，且可以證實(shí)它與上述的質(zhì)譜分析結(jié)果相匹配(圖8)。
(3. 2卵清蛋白的糖鏈圖譜分析) [OS33][糖鏈的釋放] 將卵清蛋白(2mg，可由Sigma獲得)溶于0. 5ml Tris緩沖液(pH 8. 0)，加入胰凝 乳蛋白酶(0. 2mg)，將該混合物在37t:下保持12小時(shí)。在9(TC下溫育10分鐘后，加入20單位的N-糖苷酶F，將該混合物在37t:下保持12小時(shí)。再將該混合物在9(TC下保持10分
鐘，然后凍干，得到卵清蛋白與釋放的糖鏈的混合物。[糖鏈捕捉與分離和純化] 向凍干的卵清蛋白混合物中加入lml捕捉糖鏈的微粒水溶液(通過將可光聚合的 羥基氨基脂質(zhì)4(2.0mg)、可光聚合的磷酸型脂質(zhì)5(8.5mg)光聚合制備)、5ia pH 5.2的乙 酸緩沖液(3M)和200 ii 1 MeOH。在用Vortex攪拌后，通過離心(7000rpm， 24°C ， 10分鐘) 除去不溶性組分。將上清液在4(TC下保持15小時(shí)，通過Spinfiltration(分子量級分 30,000)除去未被納米粒捕捉的組分。
[糖鏈的釋放過程] 將0.5ml純水加入到濃縮的捕捉糖鏈的微粒中，然后加入20mg離子交換樹脂 Amberlite(H+)和0. lml丙酮并將該混合物攪拌12小時(shí)。通過Spinf iltration (分子量級 分30， 000)回收從納米粒中釋放的糖鏈。 [O539][糖鏈的質(zhì)譜分析] 通過MALDI-TOF質(zhì)譜法分析濾液(圖9)。未觀察到來源于肽的信號(hào)，僅觀察到來 源于糖鏈的信號(hào)(圖9)。 向獲得的純化糖鏈中加入Girard T(可由Sigma獲得，用于將季胺加入到糖鏈中 且可商購獲得用于改善MALDI-TOF中糖鏈的信號(hào)靈敏度的試劑)。將5iU純水和10 iU 20mM Girard T(80% MeOH溶液)加入到樣品(lOiU)中并在90。C下保持1小時(shí)。獲得的 MALDI-TOF光譜如圖10中所示。在圖10中，可以觀察到糖鏈圖譜的更為明顯的信號(hào)。
(3. 3運(yùn)鐵蛋白的糖鏈圖譜分析) 對運(yùn)鐵蛋白進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)并獲得糖鏈圖譜的信號(hào)(圖11)。類似于以上第3. 2 部分中所述的情況，在用Girard T試劑處理圖11的樣品后的MALDI-TOF MS光譜如圖12 中所示。在圖12中，可以觀察到糖鏈圖譜更為明顯的信號(hào)。
(3. 4人血清中包含的糖蛋白的糖鏈圖譜分析) 凍干的人血清由Sigma購得。由于血清包含釋放的葡萄糖，所以將干燥的血清 (193mg)溶于10ml乙酸鹽緩沖液(pH 5. 2，20mM)。然后，向其中加入1. 82mg葡萄糖氧化酶 并將該混合物在35t:下攪拌30分鐘，同時(shí)通入空氣。接下來的操作與對上述糖蛋白的操 作相同。獲得的人血清糖蛋白糖鏈的圖譜如圖13中所示。類似于以上第3.2部分中所述 的情況，在用GirardT試劑處理圖13的樣品后的MALDI-TOF MS光譜如圖14中所示。在圖 14中，可以觀察到糖鏈圖譜的更為明顯的信號(hào)。(實(shí)施例4 :使用捕捉糖鏈的聚合物進(jìn)行的對糖鏈具有特異性的回收的確證)
[糖鏈捕捉過程] 向lml捕捉糖鏈的聚合物6的乙酸緩沖液(lmg/ml)中加入a 1-3， a 1-6甘露三 糖(可由Dextran laboratories獲得，300微克)和帶有甲基化還原末端的a 1-3， a 1-6 甘露三糖(可由Dextran laboratories獲得，200微克)的混合物并在25"下保持12小 時(shí)。將該溶液分入兩個(gè)Microcon(可由Millipore獲得)(各500iU)并在10， 000轉(zhuǎn)/分 鐘和10°C的溫度條件下進(jìn)行離心過濾40分鐘。向聚合物濃縮物中加入200 ii 1超純水并 在相同條件下再進(jìn)行離心過濾。將該操作重復(fù)兩次。將100iU超純水加入到所述濃縮物 (幾Pi)中，獲得捕捉糖鏈的聚合物濃縮物。
54[O549][糖鏈釋放過程] 將質(zhì)子型離子交換樹脂(可由Aldrich獲得，Amberlite IR-120)加入到獲得的聚 合物濃縮物中并將該混合物在37t:下攪拌1小時(shí)。使用Microcon(可由Millipore獲得) 將該溶液在10， 000轉(zhuǎn)/分鐘和l(TC的溫度條件下進(jìn)行離心過濾30分鐘并回收濾液。
[質(zhì)譜分析] 作為基質(zhì)試劑，使用2， 5- 二羥基苯甲酸(10mg/ml，可由Fluka獲得)并將濾液用 MALDI-TOF MS(可由Bruker獲得，Biflex)進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果如圖15中所示。未觀察到 來源于不能結(jié)合捕捉糖鏈的聚合物的"帶有甲基化還原末端的a 1-3， al-6甘露三糖"的 信號(hào)，因?yàn)槠浔患谆Ｗo(hù)。該結(jié)果表明捕捉糖鏈的聚合物可以與糖鏈特異性地結(jié)合。
(實(shí)施例5 :通過澆鑄法減少糖鏈的分離和純化過程) 將甘露戊糖(mannopentaose)(可由Funakoshi Co. ， Ltd.獲得，lmg)力口入至lj 500 iil捕捉糖鏈的聚合物6的乙酸緩沖液(lmg/ml)中。向其中加入100 yl甲醇并將該 混合物在25t:下保持12小時(shí)。將該水溶液澆鑄在MALDI-TOFMS的平板上并使溶劑自然蒸 發(fā)。在水中充分洗滌用聚合物澆鑄的平板以除去未反應(yīng)的糖鏈。作為基質(zhì)試劑，將包含2， 5-二羥基苯甲酸(10mg/ml)的10%三氟乙酸水溶液(對從聚合物中釋放糖鏈而言是必需 的)固定在流延薄膜上。在使所有溶劑自然蒸發(fā)后，進(jìn)行質(zhì)譜測定。觀察到來源于甘露戊 糖的信號(hào)(圖16)。作為對照實(shí)驗(yàn)，將用脂質(zhì)5光聚合的、不具有捕捉糖鏈能力的聚合物進(jìn) 行了相同實(shí)驗(yàn)。在對照實(shí)驗(yàn)中，未獲得來源于甘露戊糖的信號(hào)(圖16)。發(fā)現(xiàn)通過使用捕捉 糖鏈的聚合物作為流延薄膜可以將糖鏈的分離和純化過程減少至僅用水洗滌。
(實(shí)施例6 :具有捕捉糖鏈的聚合物包被的表面的復(fù)制物制備平板的制備方法)
通過使用為標(biāo)準(zhǔn)方法的Langmuir-Blodgett (LB)法制備復(fù)制物制備平板。親水基 與疏水基平衡的兩親性成膜分子在水表面上形成穩(wěn)定的單分子層。將單分子層轉(zhuǎn)移至基質(zhì) 表面而產(chǎn)生復(fù)制物制備平板。特別地，將可光聚合的羥基氨基衍生物4(7mg)和為可光聚合 的基質(zhì)分子5的二二十五碳二炔?；字Ｄ憠A(30mg)溶于10ml氯仿。如下展開單分子 層將展開溶液溶于氯仿溶劑并逐漸滴加溶液(液滴的體積為40-200 iU)并使用微量注射 器(lOOym)在通過以下步驟產(chǎn)生的框內(nèi)展開將4支吸管(由聚丙烯制成，外徑6mm)對 角切緣，使各吸管排列成菱形，其中末梢的尖端在內(nèi)部彼此相鄰且還用特氟龍(商標(biāo))帶連 接，使得吸管于10-25t:下在清潔浴中靈活變形。然后將紫外線燈(8W，100V)置于10cm距 離以便輻射出光線并聚合。然后，使用于顯微鏡觀察的蓋玻片接觸單分子層并干燥至得到 復(fù)制物制備平板。(實(shí)施例7 :使用復(fù)制物制備平板的糖鏈復(fù)制物制備方法) 在-25t:下使用冷凍切片機(jī)將在顯微鏡觀察手術(shù)過程中摘除和冷凍的乳腺癌樣本 切成4微米厚度并使用一般方法進(jìn)行蘇木精伊紅染色。干燥后，將實(shí)施例6中制備的復(fù)制 物制備平板的單分子層表面放在組織切片一側(cè)以覆蓋組織切片并通過固定膠帶固定。通過 使用顯微鏡用超細(xì)微的油基氈制筆等適當(dāng)標(biāo)記觀察的損傷部位。使用微量注射器將肼溶液 或糖苷酶溶液注入復(fù)制物制備平板與載玻片之間的縫隙并使樣品于25-38t:下在溫控室內(nèi) 反應(yīng)。在復(fù)制物制備平板上復(fù)制組織切片表面的糖鏈。使用實(shí)施例4的方法通過使激光照 射預(yù)先標(biāo)記的部位對通過復(fù)制獲得的糖鏈進(jìn)行質(zhì)譜分析。
(實(shí)施例8 :糖鏈陣列)
通過糖鏈固定陣列檢測抗體 離析來源于卵巢癌的包含糖鏈的細(xì)胞(已經(jīng)根據(jù)下列Chien等的文件區(qū)分出 是惡性還是良性疾病的患者DX Chien， PE. Schwartz, CA125 "用于檢測惡性子宮癌的分 析".Gynecology, 75 (4) :701-704， 1990)。采集預(yù)計(jì)包括識(shí)別為卵巢腫瘤標(biāo)記物的乙二醇 蛋白質(zhì)復(fù)合物CA125的患者唾液。使用筒式柱對每份唾液中10000或更高分子量的級分進(jìn) 行分級分離并濃縮。將它們用PBS稀釋(1000、200、40、10、1、0. lng糖蛋白/ yl，各1 yl)， 用肼溶液處理糖鏈且使其粘附在實(shí)施例6中制備的復(fù)制物制備平板上的點(diǎn)上以形成陣列。 與固相載體上的點(diǎn)粘附后立即將其在25t:下于加濕室內(nèi)保持1小時(shí)。然后，通過浸入1% BSA/0. 05%吐溫20-PBS(PBS-T) 1小時(shí)進(jìn)行阻斷處理并獲得糖鏈陣列。向該糖鏈陣列中加 入抗-CA125單克隆抗體并于25t:下在加濕室內(nèi)溫育1小時(shí)。接下來，用PBS-T將陣列洗 滌3次、用PBS沖洗，然后干燥。使用熒光標(biāo)記抗-IgG抗體標(biāo)記獲得的反應(yīng)陣列，用PBS沖 洗，然后干燥。然后，通過掃描儀測定陣列表面的熒光強(qiáng)度?？梢愿鶕?jù)下列文獻(xiàn)中所述的任 意方法進(jìn)行一般分子生物學(xué)方法如標(biāo)記"Molecular Cloning-Laboratory Manual "，第2 片反，Sambrook， FritschandManiatis (Cold SpringHarbor Laboratory, 1989);或"Latest protocol ofmolecular biology，，，第1-3巻，F(xiàn) M Asubel， R Brentand， R E Kingston編 輯，John Wiley Publishing,1998。 已經(jīng)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案闡述了本發(fā)明。注意本發(fā)明的范圍僅應(yīng)由權(quán)利要 求的范圍解釋。注意將本說明書中所引用的專利、專利申請和文件引入本文作為參考，就如 同在本說明書中對其內(nèi)容進(jìn)行了詳細(xì)描述一樣。
工業(yè)實(shí)用性 根據(jù)本發(fā)明的方法，通過有效地分離、純化或濃縮來源于細(xì)胞或生物樣品的復(fù)合 糖脂如糖蛋白、糖脂等和預(yù)先采集組分如混合蛋白、脂質(zhì)等，直接分析方法如質(zhì)譜法變得容 易。此外，能夠?qū)碓从诓±砬衅奶擎溡远S圖像形式進(jìn)行轉(zhuǎn)移。為了使本發(fā)明公開的 捕捉糖鏈的聚合物與已經(jīng)進(jìn)行了與體內(nèi)酶等組合的適當(dāng)預(yù)處理的活生物體表面接觸，將來 源于與之前不能采集的腺系統(tǒng)連接的血管(輸乳管、膽管等)細(xì)胞腔的糖鏈進(jìn)行分級成為 可能。分級的糖鏈組合物可以用作藥物如疫苗、保健食品、具有減少的殘余蛋白質(zhì)或脂質(zhì)且 抗原性更低的藥物和更低過敏原食品。
5權(quán)利要求
測定包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品中的糖鏈的方法，該方法包括以下步驟a)將可以與糖鏈特異性地發(fā)生作用的物質(zhì)定位在二維延伸的支持物上的表面上并使未定位有所述物質(zhì)的表面與固體箔接觸；其中可以與糖鏈特異性地發(fā)生作用的物質(zhì)包含選自羥基氨基、N-烷基羥基氨基、酰肼基、氨基硫脲基和半胱氨酸殘基的官能團(tuán)；b)使包含或預(yù)計(jì)包含糖鏈的樣品與固體箔接觸；和c)表征存在于固體箔表面上的糖鏈。
2. 鑒定樣品中與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟a) 使包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體在流體相中與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)發(fā)生相互作用以便固定；其中可以與糖鏈特異性地發(fā)生作用的物質(zhì)包含選自羥基氨基、N-烷基羥基氨基、酰肼基、氨基硫脲基和半胱氨酸殘基的官能團(tuán)；b) 在與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)可以與糖鏈反應(yīng)的條件下，使捕捉糖鏈的載體與樣品接觸；c) 使捕捉糖鏈的載體與樣品的混合物接觸保持捕捉糖鏈的載體與樣品不解離的條件；和d) 鑒定與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)為抗體或凝集素。
全文摘要
本發(fā)明提供了可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)。此外，本發(fā)明還提供了分離、濃縮或純化各自包含在樣品中的糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的方法，其包括以下步驟a)在捕捉糖鏈的載體可以與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)反應(yīng)的條件下，使包含可以與糖鏈特異性地發(fā)生相互作用的物質(zhì)的捕捉糖鏈的載體在流體相中與樣品接觸；b)從流體相中取出捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)的復(fù)合物；和c)使該復(fù)合物接觸捕捉糖鏈的載體與糖鏈或含糖鏈物質(zhì)之間的相互作用至少部分被消除的條件。
文檔編號(hào)C07C239/20GK101788557SQ201010124050
公開日2010年7月28日 申請日期2003年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者中川裕章, 岡山峰伸, 新倉謙一, 西村紳一郎 申請人:鹽野義制藥株式會(huì)社