專利名稱：抗h3n8亞型馬流感病毒單克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及馬流感病毒單克隆抗體，尤其涉及抗H3N8亞型馬流感病毒單克隆抗 體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，本發(fā)明還涉及該單克隆抗體在檢測(cè)或防治馬A 型流感病毒的用途，屬于馬流感病毒單克隆抗體領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
馬流行性感冒(Equine influenza, ΕΙ)簡(jiǎn)稱馬流感，是由正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)流感病毒屬(Influenzavirus)馬A型流感病毒(EIV)引起馬屬動(dòng)物 的一種急性暴發(fā)式流行的傳染病。國(guó)際上根據(jù)流感病毒的H和N的不同，將H分成15個(gè)型， N有8個(gè)亞型。感染馬的只有兩種亞型馬甲I型和馬甲II型，分別屬于H7N7和H3N8亞型。與其它流感病毒一樣，馬A型流感病毒傳播迅速，常呈爆發(fā)性流行，給養(yǎng)馬業(yè)和賽 馬業(yè)均帶來了一定的損失。因此，若能適時(shí)進(jìn)行快速診斷，查明病原，在流行初期即能檢測(cè) 出馬體是否感染了 EIV，從而為快速處置預(yù)案或早期預(yù)防治療提供診斷依據(jù)，能夠最大限度 地減少經(jīng)濟(jì)損失。為此，研制出EIV H3N8亞型特異性的單克隆抗體可以為馬流感病毒的診 斷或防治奠定重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一株分泌抗H3N8亞型馬流感病毒單克隆抗體的雜交瘤 細(xì)胞株；本發(fā)明目的之二獲得由該雜交瘤細(xì)胞株所分泌的H3N8亞型馬流感病毒單克隆抗 體；本發(fā)明目的之三是將上述H3N8亞型馬流感病毒單克隆抗體應(yīng)用于制備成檢測(cè)或 防治馬流行性感冒病毒的試劑或藥物。本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一株分泌抗H3N8亞型馬流感病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其微生物保藏號(hào) 是CGMCC No 3543 ；保藏日期是2009年12月23日；分類命名是雜交瘤細(xì)胞；保藏單位 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào) 院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明以蔗糖密度梯度離心方法純化H3N8亞型馬流感病毒，分別免疫Balb/C小 鼠后取脾細(xì)胞與SP2/0融合，制備了一株分泌抗H3N8亞型馬流感病毒單克隆抗體的雜交瘤 細(xì)胞株。通過ELlSA和Western-blot方法鑒定證明H3N8/10單抗與馬傳染性貧血病毒 (EIAV)、馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)、正常雞胚尿囊液均無交叉反應(yīng)，H3N8/10的腹水ELISA效價(jià)為 1 1.6X104o本發(fā)明成功的制備了抗H3N8亞型單克隆抗體，可將其應(yīng)用于EIV的抗原性 分析、血清學(xué)診斷、疫苗質(zhì)量監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查等方面。


圖1本發(fā)明EIV H3N8亞型單克隆抗體的Western bolt分析；1 =Marker ；2 :H3N8 病毒；3 :EIAV對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1分泌抗H3N8亞 型馬流感病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制備1.材料和方法1. 1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1主要試劑HAT、HT選擇培養(yǎng)基、HRP-羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑均為Sigma 公司產(chǎn)品；PEG (MW，3350)為Solarbio公司產(chǎn)品；國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)胎牛血清購自天津顴洋生物工程 公司；所用其他化學(xué)試劑均為分析純。羊抗鼠IgG熒光抗體，購自北京中山生物技術(shù)有限公 司，用前以0.01%伊文思藍(lán)O.Olmol/1 pH 7. 2PBS液稀釋成所需要的濃度。1. 1. 2細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、毒株與血清馬流感病毒A/equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)及其標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由本發(fā)明人實(shí) 驗(yàn)室保存。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞為本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室凍存。雌性BALB/c小鼠和昆明白鼠購于中 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2實(shí)驗(yàn)方法1. 2. 1 病毒 A/equine/Xinjiang/3/2007 的復(fù)壯與純化1. 2. 1. 1尿囊腔接種病毒將種毒A/equine/Xinjiang/3/2007接種于9日齡SPF雞胚100個(gè)，將尿囊液收集 到一起，用于超離，具體方法如下(1)選用9日齡發(fā)育良好的雞胚，照蛋標(biāo)出氣室及胚胎位置，在氣室底邊胚胎附近 無大血管處標(biāo)出尿囊腔注射部位。(2)氣室向上放置雞胚于卵架上，在氣室及標(biāo)記處先后用酒精棉球消毒蛋殼表面。(3)在所標(biāo)記注射部位用剪刀尖端打孔，注意用力要穩(wěn)，恰好使蛋殼打通而不傷及 殼膜。為防止注射接種物時(shí)因胚胎內(nèi)產(chǎn)生壓力而使接種物溢出，可在氣室頂端也打一小孔。(4)用1毫升注射器抽取接種物，針頭斜面(與卵殼成30°角)刺入注射部位3 5毫米達(dá)尿囊腔內(nèi)，注入接種物。一般接種量為0. 1 0. 2毫升。(5)另一種接種方法是只開一小孔，在距氣室底邊0. 5厘米處的卵殼上打一個(gè)孔， 由此孔進(jìn)針注射接種物。(6)注射完畢，用熔好的石蠟或消毒膠布封閉注射孔和氣室孔。氣室朝上于35 37°C溫箱中孵育。棄去24小時(shí)內(nèi)的死亡雞胚，因多系機(jī)械損傷、細(xì)菌或霉菌污染等非特異 性因素所引起，以后每天檢卵1 2次。
(7)檢視出的死雞胚、孵育48 72小時(shí)的活雞胚(某些病毒并不收獲活雞胚，應(yīng) 棄之)，取出置4°C冰箱過夜或-20°C冰箱中1小時(shí)，以免收獲時(shí)流血。(8)取出冷卻的雞胚，氣室端卵殼表面用碘酊和酒精棉球消毒，用鑷子無菌擊破氣 室部卵殼并去除殼膜，撕破絨毛尿囊膜，以眼科鑷子鑷住絨毛尿囊膜，用毛細(xì)吸管或吸管吸 取尿囊液和羊水，置無菌容器中保存?zhèn)溆?低溫冰箱凍結(jié)保存)。一般能收獲尿囊液6毫升 左右，最多可達(dá)10毫升。(9)標(biāo)記，_20°C保存。1.2. 1.2病毒的純化取含病毒的尿囊液，經(jīng)反復(fù)凍融兩次后，4°C，4000r/min離心20min，充分去除殘 渣，收集病毒上清，然后以高速離心機(jī)38000r/min離心60min，取沉淀用DEPC水融解。制備20%、30%、40%、50%、60%的蔗糖溶液，進(jìn)行蔗糖連續(xù)密度梯度離心純化流 感病毒，取沉淀用DEPC水融解，_70°C保存?zhèn)溆谩?. 2. 1. 3純化結(jié)果的測(cè)定測(cè)定流感病毒的血凝價(jià)與蛋白含量。測(cè)血凝價(jià)用常規(guī)的HA方法。測(cè)蛋白含量將 純化好的病毒溶于IOmL滅菌PBS中，用751G分光光度計(jì)測(cè)其280nm，260nm波長(zhǎng)處吸光度， 計(jì)算其蛋白含量，-20°C保存，用于制備EIV單抗。蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)= 1. 450D280nm_0· 740D260nm1. 2. 2動(dòng)物免疫1. 2. 2. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8_12周。1.2. 2. 2 免疫方法第一次免疫將抗原與弗氏佐劑等量進(jìn)行乳化，給每只小鼠腹部皮下多點(diǎn)注射抗 原0. lmL，2周后改用弗氏不完全佐劑進(jìn)行免疫，免疫后五周左右，從尾部采血測(cè)抗體效價(jià) (ELISA法)，選擇效價(jià)高的小鼠休息2 3周，準(zhǔn)備融合，在融合前三天，再加強(qiáng)免疫，將抗 原50 IOOug用PBS稀釋成0. 2mL,經(jīng)腹腔注射。表1 Balb/C小鼠的免疫方案 1. 2. 3檢測(cè)方法的建立1. 2. 3. 1陽性對(duì)照血清的制備三免后10d，對(duì)免疫小鼠斷尾采血，分離血清，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，一方面進(jìn)行檢測(cè)方 法的建立，另一方面選取結(jié)果在1 3 200以上的并且效價(jià)最高的小鼠準(zhǔn)備進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)，
5此小鼠在融合前，眼球取血，分離血清，作為陽性對(duì)照血清。1. 2. 3. 2間接ELISA檢測(cè)方法的抗原包被最佳濃度與對(duì)照血清最佳稀釋度的確定按常規(guī)間接ELISA操作步驟，運(yùn)用棋盤滴定試驗(yàn)確定抗原最佳包被量、血清最佳 工作濃度以及判定標(biāo)準(zhǔn)。將純化的EIV抗原用包被液分別做50、100、200、400、800倍稀釋 后包被酶標(biāo)板，待檢血清和陰性血清分別按1 50、1 IOOU 200,1 400…倍比稀釋。常規(guī)間接ELISA具體操作步驟如下(1)抗原包被將純化的EIV用包被液按一定稀釋倍數(shù)稀釋，酶標(biāo)板每孔各加 100 μ L，37°C—個(gè)小時(shí)后，4°C包被過夜，用含0. 5% Tween 20的PBST洗液洗滌3次，每次搖 床震蕩3min。(2)封閉加入封閉液(5%脫脂奶粉)200 μ L，37°C封閉2h，再用PBST洗液洗滌3次。(3) 一抗待檢抗體稀釋一定倍數(shù)后取IOOyL加到酶標(biāo)板中，陰性、陽性及空白 對(duì)照用PBS做一定倍數(shù)稀釋后各取100 μ L加入到酶標(biāo)板中，作好記錄。37°C孵育lh，再用 PBST洗液洗滌3次。(4) 二抗(HRP-羊抗鼠IgG)取HRP-羊抗鼠IgG 二抗用PBS以按其使用濃度稀 釋，混勻，每孔加100 μ L，37°C濕盒孵育lh，用PBST洗液洗滌3次。(5)顯色底物顯色液A與B等體積混勻，每孔加100 μ L，于37°C孵育lh。(6)終止用終止液(2mol/L H2SO4)每孔各加 50 μ L，37°C終止 15min。(7)酶標(biāo)儀測(cè)OD值設(shè)置酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)、450nm，測(cè)光吸收值。(8)分析陰性對(duì)照< 0. 2，陽性對(duì)照1. 0左右。當(dāng)樣品的P/N值彡2. 1時(shí)判定為 陽性，P/N< 1.5時(shí)判定為陰性。1. 2. 4細(xì)胞融合1. 2. 4. 1小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)采用的骨髓瘤細(xì)胞為SP2/0，本試驗(yàn)室有保存，實(shí)驗(yàn)前幾天進(jìn)行復(fù)蘇，傳代。用于融 合的骨髓瘤細(xì)胞通常為傳代后的第二天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集此時(shí)期的細(xì)胞。1. 2. 4. 2制作飼養(yǎng)層細(xì)胞(1)拉頸處死小鼠(小鼠餓2 3天，使其腹膜與大腸脫離，易于抽取)；(2) 75%酒精浸泡消毒10分鐘；(3)將小鼠固定在自制解剖臺(tái)上，用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開一個(gè)小口，剝開皮膚， 露出腹腔(注意不要把腹膜弄破)；(4)在培養(yǎng)皿中倒入50mLHAT培養(yǎng)液，用注射器將4mL培養(yǎng)液注入腹腔，小心反復(fù) 抽取腹腔液體；(5)將抽取的液體加到HAT培養(yǎng)液中，吹勻；(6)分裝到5塊96孔板中，每孔加100 μ L ；(7)封口并進(jìn)行標(biāo)記，保存到37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1. 2. 4. 3免疫脾細(xì)胞的制備(1)摘眼球取血，制備抗原，將血滴入EP管中，立刻橫放于4°C冰箱中(2)拉頸處死小鼠(3) 75%酒精浸泡消毒IOmin
(4)無菌條件下剪開小鼠腹腔，取出脾臟，(脾臟位于小鼠左側(cè)，呈淡黑紅色，取時(shí) 盡量剔除周圍的脂肪和結(jié)締組織，但不要弄破大腸以免污染)(5)將脾臟移入另一盛有20mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液的平皿內(nèi)，用針頭將脾臟一端刺孔，另 一端固定，用一次性無菌注射器吸取IOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)液，從脾臟一端緩慢注入，使液體從脾 臟另一端針孔流出，重復(fù)多次，直至脾臟呈透明狀。(6)將平皿中脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，1 000r/min離心lOmin，備用。1. 2. 4. 4 細(xì)胞融合(1)取來兩個(gè)大瓶(250mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶)的SP2/0，用20mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打 下來，然后將液體轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，1000r/min離心lOmin，棄上清；(2)將離心后的脾細(xì)胞上清倒掉，用IOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)液將脾細(xì)胞懸起，加入到裝有 SP2/0的離心管中，混勻，1000r/min離心lOmin，棄上清；(3)輕敲離心管底部，使沉淀流動(dòng)，把沉淀管放入37°C水浴燒杯中(在裝有42°C水 的水槽中內(nèi)部放置一個(gè)裝有37°C水的燒杯)，使其達(dá)到融合溫度；(4)加預(yù)熱至37°C的50% PEGlmL,用ImL吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉淀管，肉眼可 見有顆粒出現(xiàn)，滴加過程不超過lmin，先慢后快；(5)逐滴加入15mL不含血清的DMEM培養(yǎng)液，邊加邊搖，滴加過程不超過2min，先 慢后快，使PEG稀釋而失去促融作用；(6)室溫以1000r/min離心lOmin，使細(xì)胞沉淀，棄上清；(7)加入含20 % FBS的預(yù)熱的HAT培養(yǎng)液50mL ；(8)混勻，分裝到96孔板中，封口并進(jìn)行標(biāo)記，保存到5% CO2飽和濕度37°C培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)；(9)培養(yǎng)3天后，進(jìn)行觀察，記錄有融合的培養(yǎng)孔，跟蹤觀察，適當(dāng)換液，使用含HAT 的完全DMEM培養(yǎng)液；(10)在15天左右，吸取上清，檢查抗體。1. 2. 5雜交瘤細(xì)胞的篩選用ELISA法檢測(cè)陽性克隆，設(shè)置的陽性對(duì)照為免疫小鼠的血清；陰性對(duì)照為 SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液。雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔內(nèi)的上清液為一抗；酶標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1病毒增殖與純化約700mL繁殖種毒收獲的SPF雞胚尿囊液的HA效價(jià)為28。尿囊液經(jīng)差速離心去 除殘?jiān)?，超速離心獲取病毒沉淀，蔗糖密度梯度離心純化，取40%與60%蔗糖梯度之間 的白色病毒層，PBS稀釋經(jīng)超速離心沉淀后，得到3mL乳白色已純化的病毒懸液HA效價(jià)為
221。分光光度計(jì)測(cè)定尿囊液蔗糖密度梯度超速離心后的病毒濃度為1. 928mg/mL。此純 化的病毒作為免疫原和篩選原。2. 2ELISA檢測(cè)方法的建立將純化的EIV抗原按照1 100、1 200,1 400倍比稀釋后包被ELISA平板， 與1 100、1 200,1 400倍比稀釋的陰陽性血清做方陣試驗(yàn)，確定抗原的最佳包被濃 度及陰陽性血清的最佳稀釋倍數(shù)，結(jié)果見表2。
表2原和陰陽性血清最佳稀釋度的確定 * ⑴表示陽性血清，㈠表示陰性血清最佳包被量和最佳血清稀釋度的判定標(biāo)準(zhǔn)為陽性血清0D492值接近1. 0，陰性血 清0D492 <0.2，P/N≥2. 1，最終確定EIV抗原以1 200倍稀釋為最佳包被濃度，陰陽 性血清的最佳稀釋度為1 6400。EIV抗原最佳包被條件是37°C包被1小時(shí)，4°C過夜包 被；陰陽性血清和酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)條件是37°C孵育Ih ；底物最佳反應(yīng)條件和作用時(shí)間為 37 °C 15min。2. 3雜交瘤細(xì)胞株的建立用50% PEG-1500做融合劑，采用傳統(tǒng)的融合方法將免疫小鼠脾細(xì)胞和處于指數(shù) 生長(zhǎng)期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，每次培養(yǎng)5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。進(jìn)行了兩次細(xì)胞融 合，融合率如表3所示表3兩次細(xì)胞融合結(jié)果 融合后第四天，可見由單個(gè)雜交瘤細(xì)胞分裂5 7個(gè)不等的細(xì)胞集落，進(jìn)行半換 液；融合后第八天，可見融合細(xì)胞克隆集落長(zhǎng)至孔底1/7 1/5，然后進(jìn)行全換液，當(dāng)融合細(xì)胞長(zhǎng)至孔底的1/3時(shí)，用建立的ELISA進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果呈陽性的雜交瘤細(xì)胞集落經(jīng)過 有限稀釋法進(jìn)行三次克隆。經(jīng)檢測(cè)和篩選最終獲得了 1株能夠穩(wěn)定分泌抗EIV的單克隆抗 體的雜交瘤細(xì)胞，命名為H3N8/10。試驗(yàn)例1抗H3N8亞型的單克隆抗體的制備及性能檢測(cè)1.試驗(yàn)方法1. 1抗H3N8亞型的單克隆抗體的制備1. 1. 1有限稀釋法克隆雜交瘤細(xì)胞(1)在已檢測(cè)過的96孔培養(yǎng)板內(nèi)將待克隆的孔做好標(biāo)記；(2)用吸管吹打孔內(nèi)的細(xì)胞使其散開，從孔內(nèi)吸出0. ImL細(xì)胞懸液到ImL雜交瘤細(xì) 胞培養(yǎng)液中計(jì)數(shù)；(3)初次克隆時(shí)用HT培養(yǎng)液，調(diào)整雜交瘤細(xì)胞密度到3 10個(gè)/mL，每塊96孔培 養(yǎng)板內(nèi)為IOmL(第二、三次克隆可改用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液)；(4)將調(diào)好密度的細(xì)胞懸液加到含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)，每個(gè)孔加0. ImL ；(5)將96孔培養(yǎng)板置5% CO2飽和濕度37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(6)第四天用新的培養(yǎng)液置換孔內(nèi)1/2上清液；(7)第四天至第九天當(dāng)孔底細(xì)胞集落在1 2mm大小時(shí)，吸出雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔的 上清液，按抗體篩選方法檢測(cè)上清液中的抗體，計(jì)算雜交瘤細(xì)胞的陽性孔比率(陽性孔數(shù)/ 雜交細(xì)胞生長(zhǎng)孔數(shù)*100% )；(8)將抗體陽性的孔內(nèi)細(xì)胞移到24孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)2 4d ；(9)按步驟1 7，將擴(kuò)大培養(yǎng)后的陽性細(xì)胞在重復(fù)克隆2 3次，直到雜交瘤細(xì) 胞的陽性孔率達(dá)到100%為止，孔內(nèi)的細(xì)胞即為克隆化后的雜交瘤細(xì)胞；(10)將克隆化后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，以1 OOOr/min離心5min，收集上清液 作陽性克隆鑒定，凍存沉淀的細(xì)胞備用；1.1. 2腹水的制備(1)取10只BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌石蠟油0. 5mL/只。(2)經(jīng)10 14天后，將雜交瘤細(xì)胞吹打下來，1 000r/min離心lOmin，棄去上清， 用5mLDMEM營(yíng)養(yǎng)液懸浮計(jì)數(shù)。(3)每只小鼠腹腔接種細(xì)胞IO6個(gè)。(4)經(jīng)7 10天后，可見小鼠腹部膨大，采集腹水。(5)將腹水3 000r/min離心lOmin，收集上清，_20°C保存?zhèn)溆谩?.2腹水效價(jià)的測(cè)定用間接ELISA方法進(jìn)行測(cè)定。1. 3單克隆抗體的特異性分析主要是比較各種單克隆抗體與其他非免疫原間的交叉反應(yīng)性。交叉反應(yīng)性越少 者，單克隆抗體的特異性越好。實(shí)驗(yàn)用間接ELISA法將無關(guān)抗原馬傳染性貧血病毒(EIAV)、馬動(dòng)脈炎病毒(EAV) 及正常雞胚尿囊液包被96孔酶標(biāo)板(lOug/mL)，封閉后，每孔加陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清 液(100 μ L/孔)，以免疫小鼠陽性血清為陽性對(duì)照，DMEM為陰性對(duì)照，37°C孵育lh，充分洗 滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體100 μ L/孔，37°C孵育lh, TMBlOO μ L/孔顯色15min，
92M H2SO4SOyL/孔終止反應(yīng)，終止反應(yīng)后于波長(zhǎng)450nm測(cè)定OD值。P/N彡2. 1者為陽性，反 之陰性。1. 4雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性測(cè)定將雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代20代，每隔5代檢測(cè)1次細(xì)胞培養(yǎng)上清液ELISA抗體 效價(jià)，以正常培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，在連續(xù)傳代過程中定期進(jìn)行凍存和復(fù)蘇，用ELISA檢測(cè)復(fù) 蘇后細(xì)胞培養(yǎng)上清液的效價(jià)。1. 5單克隆抗體的熱穩(wěn)定測(cè)定將產(chǎn)生的腹水McAb分別置于37°C，22°C及4°C放置兩周，每隔Id測(cè)定一次腹水效 價(jià)，以-20°C保存的腹水作陽性對(duì)照，以正常的鼠血清作陰性對(duì)照。1. 6 Western Blot 分析首先對(duì)純化的EIV，馬傳貧病毒(EIAV)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后以H3N8/10單抗 為一抗，HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot分析。2.試驗(yàn)結(jié)果2. 1腹水的制備與效價(jià)測(cè)定小鼠接種雜交瘤細(xì)胞后，第7天可見腹部略為膨大，小鼠行動(dòng)緩慢，第8天用注 射器抽吸腹水，每只小鼠可收集2 3mL腹水，離心后上清液呈淡黃色。ELISA效價(jià)為 1 1.6X104。2. 2單抗的特異性分析單克隆抗體與馬傳染性貧血病毒(EIAV)、馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)及正常雞胚尿囊液 做ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均為陰性，說明H3N8/10與三者無免疫交叉反應(yīng)，具有較好的免疫原性。2. 3抗體分泌穩(wěn)定性測(cè)定雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體外連續(xù)傳代3個(gè)月后，仍具有穩(wěn)定分泌抗體的能力，ELISA效價(jià)不 低于 1 1. OXlO4O2. 4水熱穩(wěn)定性測(cè)定腹水單抗分別在37°C，22°C及4°C放置兩周后，分別測(cè)定其效價(jià)，均可保持原來的 效價(jià)，其效價(jià)與一 20°C對(duì)照無差別，腹水單抗的穩(wěn)定性好。2. 5 Western bolt 分析結(jié)果以A/Equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)馬流感病毒為抗原，制備單克隆抗體，WB結(jié) 果表明得到了特異性良好的單抗，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。
權(quán)利要求
一株分泌抗H3N8亞型馬流感病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其微生物保藏號(hào)是CGMCC NO3543。
2.由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)馬A型流感病毒試劑中的用途。
4.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備防治由馬A型流感病毒所引起疾病的藥物中的 用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗H3N8亞型馬流感病毒單克隆抗體及其用途。本發(fā)明分泌抗H3N8亞型馬流感病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的微生物保藏號(hào)是CGMCC No.3543。通過EL1SA和Western-blot方法鑒定證明本發(fā)明單克隆抗體與馬傳染性貧血病毒、馬動(dòng)脈炎病毒、正常雞胚尿囊液均無交叉反應(yīng)，本發(fā)明H3N8/10的腹水ELISA效價(jià)為1∶1.6×104。本發(fā)明抗H3N8亞型的單克隆抗體可應(yīng)用于馬A型流感病毒的抗原性分析、血清學(xué)診斷、疫苗質(zhì)量監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查等方面。
文檔編號(hào)C07K16/10GK101892200SQ20101013902
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日
發(fā)明者才琳, 相文華, 趙立平, 郭巍, 閆妍, 黃文強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所