專(zhuān)利名稱：：調(diào)控水稻開(kāi)花的光周期鈍感突變體hd1-3基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于水稻整體生長(zhǎng)發(fā)育情況改進(jìn)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及水稻光周期鈍感突變體hdl-3基因及其應(yīng)用，該基因?qū)τ谡{(diào)控水稻的抽穗開(kāi)花至關(guān)重要。
背景技術(shù)：
："民以食為天"，糧食在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中具有舉足輕重的地位。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界約有三分之二的人口以水稻為主要的食物。其種植面積占我國(guó)糧食面積27%，產(chǎn)量卻占糧食總產(chǎn)的39%。水稻精確的圖位序列已于2005年全面完成并發(fā)表，這為水稻功能基因的克隆提供了有利的條件。水稻的一生要經(jīng)歷營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期兩個(gè)時(shí)期，從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變對(duì)水稻的開(kāi)花結(jié)實(shí)至關(guān)重要，這一轉(zhuǎn)變過(guò)程不僅僅是由水稻內(nèi)部基因所決定，還受外界環(huán)境因素的影響，決定這一轉(zhuǎn)變過(guò)程最重要的環(huán)境因素之一就是光周期。水稻是短日照植物，能在短日條件下實(shí)現(xiàn)從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，從而開(kāi)花結(jié)實(shí)，完成水稻的整個(gè)生活史，因此弄清光周期條件下水稻開(kāi)花機(jī)理對(duì)于水稻的育種有重要的意義。綜觀水稻遺傳育種發(fā)展歷程，人們永遠(yuǎn)不會(huì)忘記兩次綠色革命為全世界人民帶來(lái)的巨大恩惠，從矮腳烏尖矮源的發(fā)現(xiàn)到野敗型胞質(zhì)雄性不育系的發(fā)現(xiàn)，水稻產(chǎn)量大幅度提高。雜交水稻育種已實(shí)現(xiàn)了三系配套，以光溫敏雄性不育系為親本的"兩系法"簡(jiǎn)化了雜交育種程序，并使雜交水稻的品質(zhì)也有明顯改善。研究表明，光周期不但對(duì)水稻的基本營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期起決定性作用，而且對(duì)光溫敏雄性不育系育性轉(zhuǎn)換至關(guān)重要。春化作用對(duì)于冬性作物至關(guān)重要，例如冬小麥必須經(jīng)過(guò)春化階段才能開(kāi)花結(jié)實(shí)，完成其生活史，但對(duì)南方春夏播種的作物(例如水稻)積溫比春化作用更為重要。光照條件對(duì)植物的長(zhǎng)生發(fā)育影響十分廣泛，通過(guò)了春化階段的冬性作物還必須通過(guò)適合的光照條件才能開(kāi)花結(jié)實(shí)，而一些不受春化影響的植物也必須在適當(dāng)?shù)墓庹諚l件下才能正常發(fā)育。光照主要通過(guò)光周期依賴的途徑影響植物的開(kāi)花，光周期現(xiàn)象最早是從植物對(duì)季節(jié)的變化的適應(yīng)而觀察到的，根據(jù)光周期的反應(yīng)類(lèi)型可將植物分為三種類(lèi)型長(zhǎng)日照植物、短日照植物和日中性植物(GarnerandAllard，1920，1923;Vergaraetal.1985)。長(zhǎng)日照植物對(duì)日長(zhǎng)反應(yīng)比較寬松，長(zhǎng)日照處理能提早開(kāi)花，但在一定的短日條件也可以開(kāi)花，只不過(guò)開(kāi)花期延遲。而短日照植物對(duì)光照時(shí)間要求相對(duì)較嚴(yán)，短日條件能促進(jìn)其開(kāi)花，而長(zhǎng)日條件則會(huì)推遲其開(kāi)花。但是一些感光性較強(qiáng)的短日照植物品種在長(zhǎng)日照條件下不能開(kāi)花結(jié)實(shí)，其生長(zhǎng)只停留在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段。后來(lái)研究者通過(guò)暗期間斷反應(yīng)證實(shí)了短日照植物主要對(duì)暗期的長(zhǎng)度做出反應(yīng)，而不是決定于每日的光照長(zhǎng)度(HamnerandBonner，1938;ThomasandVince-Prue，1997)。短日照植物可以識(shí)別一定的暗期長(zhǎng)度，當(dāng)暗期達(dá)到一定的臨界值時(shí)，不管日長(zhǎng)多少，其都能從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變到生殖生長(zhǎng)階段，從而開(kāi)花結(jié)實(shí)。日中性植物對(duì)日照長(zhǎng)度沒(méi)有反應(yīng)，在長(zhǎng)日條件及短日條件下都能正常開(kāi)花結(jié)實(shí)。近年來(lái)植物開(kāi)花的分子機(jī)理的研究已有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，特別在模式植物擬南芥研究中較為深入，擬南芥是長(zhǎng)日照植物，已知的光周期條件下所涉及的基因網(wǎng)絡(luò)主要包括光f言號(hào)相關(guān)基因(Lightsignalrelatedgenes)、開(kāi)花時(shí)間基因(Flowering—timegenes)禾口花分生組織特性基因(Floralmeristemidentitygenes)三類(lèi)。光信號(hào)相關(guān)基因可以感知光的剌激，將外界光剌激轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锛?xì)胞能識(shí)別的信號(hào)向內(nèi)傳遞，從而使植物發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)。光信號(hào)相關(guān)基因主要包括光受體基因及生物鐘基因。已知的光受體基因主要有光敏色素基因(PHYAPHYE)和隱花色素基因(CRY1和CRY2)。植物可以通過(guò)這兩類(lèi)光受體基因感知不同區(qū)域的光，通過(guò)3條光受體途徑(紅光途徑、藍(lán)光途徑和遠(yuǎn)紅光途徑)調(diào)控植物的開(kāi)花(Linetal.2000a)。已知的生物鐘基因包括ELF3、ZTL、CCA1、LHY、T0C1、ELF4、GI(Hicksetal1996;Schafferetal.1998;Wangetal.1998;Fowleretal.1999;Somersetal.2000;Strayeretal.2000;Alabadietal.2001;Kikisetal.2005)，這些基因都具有表達(dá)水平上的晝夜節(jié)律性變化，對(duì)于植物保持正確的生物鐘循環(huán)發(fā)揮著重要作用。擬南芥開(kāi)花調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)中，已知的開(kāi)花時(shí)間基因主要有C0、FT、S0C1及FD。C0編碼一個(gè)鋅指蛋白，主要在葉中表達(dá)，能感受日長(zhǎng)信號(hào)，在長(zhǎng)日照條件下促進(jìn)開(kāi)花(Putteri11etal.1995;Samachetal.2000)。CO過(guò)表達(dá)使植物提早開(kāi)花，敲除該基因植物不能開(kāi)花或開(kāi)花延遲。FT基因編碼一個(gè)類(lèi)似磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)，也可以在長(zhǎng)日照條件下促進(jìn)植物開(kāi)花(Kardailskyetal.1999)。FT主要在葉韌皮部表達(dá)，它直接受CO基因的調(diào)控。最近研究表明，F(xiàn)T基因的活性受FD基因的調(diào)控，F(xiàn)D編碼一個(gè)bZIP類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子，酵母雙雜交試驗(yàn)表明FD與FT相互作用，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)D對(duì)于FT的活性調(diào)節(jié)是必需的，同樣FT對(duì)于FD的激活也是必需的(Abeetal.2005;Wiggeetal.2005)。雖然CO基因可以誘導(dǎo)FT在植物葉韌皮部表達(dá)，但誘導(dǎo)成花的起始部位在莖頂端分生組織中，而且研究表明不存在莖頂端分生組織中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，那么CO和FT是如何調(diào)節(jié)開(kāi)花時(shí)間的呢？最近研究表明，F(xiàn)T基因的mRNA可以由葉組織韌皮部篩孔中傳遞到莖頂端分生組織中，從而調(diào)節(jié)其下游花分生組織特性基因的表達(dá)，引發(fā)植物開(kāi)花，推測(cè)FT基因的mRNA可能是"成花素"(Florigen)信號(hào)的主要組成成分(Huangetal.2005)。SOC1編碼一個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子(Leeetal.2000)，它可以在FT基因的調(diào)控下調(diào)節(jié)植物開(kāi)花時(shí)間，也可以調(diào)控花分生組織特性基因的活性(例如它可以調(diào)節(jié)LFY活性)使植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?；ǚ稚M織特性基因?qū)τ谥参锍苫ㄖ陵P(guān)重要，這些基因的缺陷將使植物不能形成正常的花，表現(xiàn)出不完整花器官的表型。已知的花分生組織特性基因有LFY、AP1/CAL、FUL和TFL1。前三者主要在花分生組織中表達(dá)，促進(jìn)植物花分生組織的形成，促進(jìn)開(kāi)花。TFL1是另一類(lèi)型的花分生組織特性的基因，與前面幾個(gè)基因相反，tFll突變體花序分生組織被花分生組織代替，植株表現(xiàn)提早開(kāi)花，因此TFL1對(duì)植物由莖頂端分生組織向花分生組織轉(zhuǎn)變具有阻遏作用，抑制開(kāi)花(Gustafson-Brownetal.1994;Ohshimaetal.1997;Liljegrenetal.1999;Ferrandizetal.2000;Pelazetal.2000;Blazquezetal.2006)。上述花分生組織特性基因之間可以相互作用，互相調(diào)控，首先，AP1/CAL可以正向調(diào)節(jié)LFY的表達(dá)使植株形成新的花分生組織。其次，LFY和AP1/CAL可以抑制TFL1的表達(dá)，LFY還可以上調(diào)API表達(dá)進(jìn)一步抑制TFL1的表達(dá)，從而使植株正常開(kāi)花。另夕卜，TFL1也可以對(duì)LFY、AP1和CAL基因起負(fù)向調(diào)控作用。這些花分生組織特性基因之間的相互調(diào)控保證了植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)這一轉(zhuǎn)變的穩(wěn)定性，如果沒(méi)有這些基因之間的相互調(diào)控，這一轉(zhuǎn)變過(guò)程有可能發(fā)生回復(fù)。通過(guò)上述開(kāi)花時(shí)間基因及花分生組織特性基因的相互調(diào)控，從而使植物完成由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)變。早在50年前人們就知道葉片是植物感知光周期的最初器官，并推斷可能存在一種促使植物開(kāi)花的"成花素"，但直到近幾年人們才逐漸揭開(kāi)植物開(kāi)花過(guò)程的神秘面紗，在外界環(huán)境因素和植物激素作用下，上述基因網(wǎng)絡(luò)三類(lèi)基因相互作用，互相調(diào)控，光信號(hào)從植物葉片經(jīng)莖傳遞到莖頂端分生組織，才最終導(dǎo)致植物開(kāi)花。但到目前為止，涉及這一過(guò)程的基因網(wǎng)絡(luò)仍不完善，仍有許多支路的基因不明確，需要進(jìn)一步補(bǔ)充完善。雖然擬南芥中已知的開(kāi)花基因在水稻中具有一定的保守性，但水稻是短日照植物，在光周期的反應(yīng)上與擬南芥正好相反，與長(zhǎng)日植物相比，水稻屬于長(zhǎng)夜植物，即其能否開(kāi)花決定于相對(duì)暗期長(zhǎng)度，而不是決定于光照時(shí)間長(zhǎng)短。目前對(duì)于短日植物來(lái)說(shuō)，光周期介導(dǎo)的開(kāi)花機(jī)理還很不明確，所涉及的相關(guān)基因大多數(shù)還是未知的，短日植物如何識(shí)別暗期長(zhǎng)度仍然不清楚。在水稻光信號(hào)相關(guān)基因(光受體及生物鐘基因)研究方面，Izawa等(Izawaetal.2000)利用se5突變體克隆出了涉及光敏素發(fā)色團(tuán)合成的亞鐵血紅素氧化酶基因SE5，se5突變體是光周期鈍感的但表現(xiàn)出明顯的早花效應(yīng)，從功能上講，se5突變體表現(xiàn)光敏素合成缺陷，因此SE5基因在光敏素介導(dǎo)的水稻的開(kāi)花中起重要的作用，特別在長(zhǎng)日條件下對(duì)水稻開(kāi)花的抑制作用尤為顯著。水稻中有3種光敏色素基因，分別為PHYA、PHYB和PHYC。日本學(xué)者Takano等(Takanoetal.2005)用不同的組合創(chuàng)制出不同的雙突變體(phyAphyB、phyBphyC和phyAphyC雙突變體)對(duì)3種光敏色素的功能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明phyA和phyC可以介導(dǎo)遠(yuǎn)紅光途徑而去黃化，在調(diào)節(jié)水稻開(kāi)花的時(shí)間上，單個(gè)phyA突變體對(duì)水稻開(kāi)花時(shí)間幾乎沒(méi)有影響，而phyB和phyC突變體植株提早開(kāi)花，phyAphyB和phyAphyC雙突變體植株則表現(xiàn)強(qiáng)烈的早花效應(yīng)。在藍(lán)光受體研究上，上海植物生理生態(tài)研究所楊洪全研究組克隆出了水稻OsCRYl基因并分析了其功能(Zhangetal.2006)，揭示了該基因在藍(lán)光介導(dǎo)下抑制水稻幼苗胚芽鞘和葉片的伸長(zhǎng)。同時(shí)日本Takano研究組也克隆了水稻隱花色素基因0sCRYl和0sCRY2(Hiroseetal.2006)，發(fā)現(xiàn)0sCRYl主要在植物綠色組織中表達(dá)，在藍(lán)光介導(dǎo)下抑制水稻幼苗胚芽鞘的伸長(zhǎng)中起作用；而0sCRY2主要在植物胚芽鞘、花及愈傷組織中表達(dá)，能在長(zhǎng)日和短日條件下促進(jìn)水稻開(kāi)花。另外，與生物鐘相關(guān)的0sGI也已被克隆，其節(jié)律性的表達(dá)方式與擬南芥的CI基因非常相似，但其功能與擬南芥的CI相反，它對(duì)水稻的開(kāi)花具有抑制作用，可以作為調(diào)節(jié)水稻開(kāi)花時(shí)間的一個(gè)阻遏子(Hayamaetal.2003)。水稻在長(zhǎng)期的栽培條件下，一些適應(yīng)當(dāng)?shù)毓庵芷跅l件的變異品種通過(guò)自然選擇得到了保存，另外，在水稻的育種過(guò)程中已可以產(chǎn)生一些光周期相關(guān)變異材料，這為光周期條件下水稻開(kāi)花的遺傳網(wǎng)絡(luò)研究提供了基礎(chǔ)材料。日本學(xué)者Yano的研究組已用秈粳雜交的不同群體鑒定出14個(gè)水稻抽穗期相關(guān)的QTL位點(diǎn)(HdlHdl4)(Linetal.1998,2002，2003;Yamamotoetal.1998，2000;Yano1997，2001)，這些QTL位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和分析不僅對(duì)水稻開(kāi)花機(jī)理的研究提供了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于水稻的自然變異、馴化及育種研究提供了依據(jù)。目前已有幾個(gè)QTL位點(diǎn)已被克隆并揭示了其在水稻開(kāi)花中的重要功能，例如Hdl、Hd3、Hd6及Edhl。Hdl是開(kāi)花QTL的主效應(yīng)位點(diǎn)，是擬南芥C0基因的同源基因，編碼一個(gè)鋅指蛋白，主要在白天表達(dá)，而在夜晚表達(dá)量很低，表現(xiàn)出白天的表達(dá)模式。Hdl在開(kāi)花調(diào)控上具有雙重功能，在長(zhǎng)日條件下抑制水稻的開(kāi)花，但在短日條件下促進(jìn)水稻的開(kāi)花(Yanoetal.2000)。這與C0基因不同，目前為止沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CO對(duì)擬南芥在光周期條件下的開(kāi)花具有抑制作用。Izawa等(Izawaetal.2002)分析了SE5與Hdl相互作用關(guān)系表明，SE5的突變不影響Hdl的表達(dá)模式，selse5雙突變體更接近與se5單突變體的表型。Ehdl是用圖克隆從粳稻品種臺(tái)中65和非洲栽培稻IRGC104038(OryzaglaberrimaSteud.)的雜交分離群體中分離出的，在T65中含有hdl和ehdl兩個(gè)功能缺失的等位基因，展示了晚抽穗的表型。而0.glaberrimaIRGC104038和日本晴含有有功能的Ehdl而表現(xiàn)早抽穗表型。Ehdl編碼一個(gè)B-type效應(yīng)調(diào)節(jié)子，可以不依賴于Hdl而獨(dú)立的行使其功能，在短日條件誘導(dǎo)FT-like基因表達(dá)而促進(jìn)水稻的開(kāi)花，而在長(zhǎng)日條件下不表達(dá)(Doietal.2004)。Ehdl是水稻中特有的基因，在擬南芥中沒(méi)有同源基因，與擬南芥不同，水稻的Hdl和Ehdl都可以在短日條件下調(diào)控FT-1ike基因表達(dá)而促進(jìn)水稻的開(kāi)花，而擬南芥僅在長(zhǎng)日條件下通過(guò)CO基因調(diào)控FT基因而促進(jìn)開(kāi)花的。另外，Ehdl為何在長(zhǎng)日條件沒(méi)有活性，目前還不清楚，推測(cè)可能是水稻中不同于擬南芥的另一條光周期介導(dǎo)的調(diào)控植物開(kāi)花的途徑。另外，最近研究表明Ghd7基因在長(zhǎng)日條件下抑制Ehdl的表達(dá)，也參與了光周期調(diào)控的水稻抽穗開(kāi)花。Ghd7編碼一個(gè)含有CCT結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在長(zhǎng)日照條件下推遲水稻的抽穗期，增加了株高及穗的大小，對(duì)于增加水稻的產(chǎn)量具有重要的作用(Xueetal.2008)。Hd3a是水稻第6染色上的一個(gè)QTL，編碼一個(gè)類(lèi)似磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白，與FT具有較高的同源性，它是水稻開(kāi)花的激活子，在短日照條件下其有較高的表達(dá)量，但在長(zhǎng)日照條件下表達(dá)量很低。在Hdl的調(diào)控下，Hd3a在短日條件下促進(jìn)水稻的開(kāi)花(Kojimaetal.2002)。在擬南芥中，CI是CO的激活子，CO可以正向調(diào)控FT的活性。但Hayama等(Hayamaetal.2003)在長(zhǎng)日和短日條件下分析0sGI轉(zhuǎn)基因植株中的Hdl和Hd3a的mRNA水平時(shí)發(fā)現(xiàn)Hddl的mRNA水平與0sGI的mRNA水平表現(xiàn)正相關(guān)，而Hd3a的mRNA水平與OsGI的mRNA水平表現(xiàn)負(fù)相關(guān)。這暗示了Hdl的表達(dá)可能抑制了Hd3a的表達(dá)，Hdl可以負(fù)向調(diào)控Hd3a的表達(dá)。同時(shí)也表明0sGI定位于Hdl和Hd3a的上游，可以調(diào)控后者的表達(dá)。另外，研究表明0sMADS51也參與了該光周期調(diào)控途徑，其和0sGI都可以調(diào)控Hdl和Hd3a表達(dá)，從而調(diào)控水稻的抽穗期(Kimetal.2007)。事實(shí)上，水稻是一個(gè)長(zhǎng)夜植物，利用暗期間斷反應(yīng)實(shí)驗(yàn)可以證明水稻可以識(shí)別夜長(zhǎng)。最近的研究已經(jīng)證明暗期間斷反應(yīng)的分子機(jī)理是由于Hd3a在暗期間斷時(shí)的表達(dá)受到強(qiáng)烈的抑制的結(jié)果(Ishikawaetal.2005)。另夕卜，Ghd7基因在長(zhǎng)日照條件下對(duì)Hd3a的表達(dá)具有很強(qiáng)抑制作用，但在短日照條件下不影響Hd3a的表達(dá)(Xueetal.2008)。Hd6是又一個(gè)涉及光周期途徑的QTL，編碼一個(gè)蛋白激酶CK2的a亞基(CK2a)(Takahashietal.2001)，其在長(zhǎng)日條件下延遲水稻開(kāi)花，其確切的調(diào)控途徑還不清楚。最近華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張啟發(fā)院士研究組克隆出了一個(gè)誘導(dǎo)開(kāi)花及調(diào)控花的轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)錄因子RID1，它是從水稻T-DNA插入突變體ridl克隆的，突變體ridl是一個(gè)鑒定的不能抽穗開(kāi)花的突變體，其發(fā)育僅停留在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段。RIDl編碼一個(gè)Cys-2/His-2類(lèi)型的鋅指蛋白，它在擬南芥在沒(méi)有對(duì)應(yīng)的同源基因，對(duì)于水稻的開(kāi)花時(shí)間具有重要的調(diào)控作用(Wuetal.2008)。在兩系雜交水稻育種上，光周期對(duì)于育性的轉(zhuǎn)換起著至關(guān)重要的作用。石明松在6上世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)了光敏核不育水稻(石明松1985)，該水稻的幼穗在短日條件下發(fā)育時(shí)表現(xiàn)雄性正?？捎?，而當(dāng)其幼穗在長(zhǎng)日條件下發(fā)育時(shí)表現(xiàn)雄性不育(盧興桂2003)。對(duì)于農(nóng)墾58S的育性轉(zhuǎn)換上，葉建榮等(2004)發(fā)現(xiàn)水稻低分子量GTP結(jié)合蛋白基因OsRACD參與了光周期條件下光敏核不育水稻的育性轉(zhuǎn)換，正義的OsRACD轉(zhuǎn)基因58S植株育性有一定程度的恢復(fù)，而反義的OsRACD基因降低了58N的育性。到目前為止，光周期對(duì)水稻光敏核不育的作用機(jī)制仍不清楚，因此盡快弄清光周期條件下調(diào)控水稻開(kāi)花的基因網(wǎng)絡(luò)對(duì)于水稻育種具有重要的指導(dǎo)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供調(diào)控水稻開(kāi)花的光周期鈍感突變體hdl-3基因及其應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下的方法予以實(shí)現(xiàn)水稻光周期鈍感hdl-3基因的核苷酸序列為SEQIDNo.1，其所對(duì)應(yīng)的hdl-3mRNA序列為SEQIDNo.2。調(diào)控水稻開(kāi)花的光周期鈍感突變體hdl-3基因的氨基酸序列為SEQIDNo.3。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了水稻光周期鈍感hdl-3基因在調(diào)控水稻抽穗開(kāi)花方面的應(yīng)用。本發(fā)明在構(gòu)建的水稻插入突變體庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)光周期鈍感突變體，該突變體在長(zhǎng)日條件(14.5h光，9.5h暗)和短日條件(11.5h光，12.5h暗)表現(xiàn)同時(shí)抽穗，而野生型(中花ll)在短日條件(11.5h光，12.5h暗)下與突變體同時(shí)抽穗，在長(zhǎng)日條件(14.5h光，9.5h暗)下比突變體推遲抽穗。該突變體為研究光周期條件下短日植物開(kāi)花機(jī)理提供了極好的基礎(chǔ)材料，我們已從突變體中分離出目的基因，該基因是一個(gè)調(diào)控水稻開(kāi)花的重要功能基因。該基因不僅為探明光周期條件下短日植物開(kāi)花機(jī)理提供證據(jù)和基礎(chǔ)材料，而且對(duì)于指導(dǎo)水稻的育種(特別是兩系雜交水稻育種)，調(diào)節(jié)水稻生長(zhǎng)期，進(jìn)一步提高水稻的產(chǎn)量，解決世界人口的糧食問(wèn)題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)效益，相關(guān)的研究將為水稻育種的分子設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)，并為其它作物的生產(chǎn)發(fā)展及理論研究提供借鑒。圖l是突變體的表型描述。注A:突變體及野生型表型，M為突變體lfll32，WT為野生型中花ll;B:突變體與野生型的穗長(zhǎng)及各節(jié)間長(zhǎng)度，共調(diào)查了15株，5次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3個(gè)單株；C:突變體與野生型在不同播種時(shí)期的抽穗期；D:不同播種時(shí)期期間的光周期的變化趨勢(shì)；E:不同播種時(shí)期期間的平均溫度的變化趨勢(shì)，紅色框表示在此段時(shí)間內(nèi)由于連續(xù)陰雨天氣所致的低溫。圖2為不同光周期與溫度條件下突變體和野生型的抽穗期與出葉數(shù)速率。注A:不同光周期與溫度條件下突變體和野生型的抽穗期；B:不同光周期與溫度條件下突變體和野生型的出葉數(shù)速率。lfll32為突變體，WT為中花11。每個(gè)處理調(diào)查10株。圖3表示突變體與野生型Hdl-3位點(diǎn)的序列分析。注A:突變體lfl132突變位點(diǎn)分析。黑色三角代表插入片段；垂直細(xì)線代表堿基替換；藍(lán)色垂直細(xì)線和數(shù)字標(biāo)明了在hdl-3中的相對(duì)位置；箭頭所示SEF和SER引物的位置，可以在突變體中擴(kuò)增315bp的插入片段。B:突變體lfl132中315bp的插入片段的PCR檢測(cè)。C:Hddl-3在突變體與野生型中的表達(dá)。D:推斷的Hdl及l(fā)fll32蛋白質(zhì)的氨基酸序列。黑色的線表示鋅指結(jié)構(gòu)域，星號(hào)表示日本晴Hdl蛋白與推斷的lfl132蛋白質(zhì)的氨基酸替換。E:突變體與hdl-3位點(diǎn)的連鎖分析。P工為中花ll;&為lfl132。圖4表示不同光周期和不同溫度條件下Hdl-3的表達(dá)模式。圖5表示不同光周期和不同溫度條件下Hd3a的表達(dá)模式。注M為lfl132;WT為中花11。A，B，C，D表示Hd3a在高溫27t:條件下和低溫23t:條件下的表達(dá)譜，A:LD條件下野生型的表達(dá)模式；B:SD條件下野生型的表達(dá)模式；C:LD條件下突變體的表達(dá)模式；D:SD條件下突變體的表達(dá)模式。E:為高溫27t:條件下野生型在不同光周期下的表達(dá)譜；F:為高溫27t:條件下突變體在不同光周期下的表達(dá)譜；G:短日照高溫27t:條件下野生型和突變體Hd3a表達(dá)模式；H:長(zhǎng)日照高溫27t:條件下野生型和突變體Hd3a表達(dá)模式。具體實(shí)施例方式為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明。下面的具體實(shí)施例僅僅是用于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例11材料1.1植物材料參試材料為粳稻品種中花11(0ryzasativaL.ssp.J即onica)及其突變體lfll32，lfll32來(lái)自于構(gòu)建的水稻T-DNA插入突變體庫(kù)，遺傳背景為中花11背景。約500株中花ll及500株lfll32在2007年夏季分期種植于中國(guó)水稻研究所試驗(yàn)田(N30°05'，E119°05')，播種時(shí)間分別為5月15日、5月28日、6月12日、6月23日、7月10日和7月21日。秧齡20天時(shí)移栽秧苗，抽穗期按群體主莖抽穗率達(dá)50%時(shí)記錄。中花ll和lfll32雜交的Fl代種植在海南三亞(N18°15'，E109°43')，雜交的F2分離群體種植在北京(N39°48'，E116°28')。以上材料均保持田間常規(guī)管理。1.2人工氣候箱材料種植及生長(zhǎng)條件控制條件下的鑒定在日光型人工氣候箱(KOITOTRONS-153W-Special，日本小系公司制造)中進(jìn)行，共用4個(gè)人工氣候箱進(jìn)行供試材料的處理，包括兩個(gè)溫度設(shè)置和兩個(gè)光周期設(shè)置。溫度設(shè)置為日加權(quán)平均溫度23t:(低溫)和27t:(高溫)，光照時(shí)間設(shè)置為短日照條件(SD):11.5h光，12.5h暗；長(zhǎng)日照條件(LD)14.5h光，9.5h暗。4個(gè)人工氣候箱生長(zhǎng)條件設(shè)置為L(zhǎng)D，27°C;LD，23°C;SD，27°C;SD，23°C。lfl132和對(duì)照中花11播種于秧田，入箱前一周分別選擇均勻一致的秧苗移栽到直徑為12cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，每盆2株，標(biāo)記主莖葉齡，兩周大小的水稻幼苗各選20盆轉(zhuǎn)移入設(shè)定的人工氣候箱，每箱5盆。后每4天統(tǒng)計(jì)主莖葉齡，記載每株的抽穗時(shí)間及成熟期。對(duì)抽穗期的短日促進(jìn)率和高溫促進(jìn)率公式計(jì)算如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>2方法2.1水稻基因組DNA的微量提取采用簡(jiǎn)易CTAB法提取。具體步驟如下1)取約300mg新鮮的水稻嫩葉用液氮速凍后研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至1.5mLEnpdoff管中；2)加入650iiL經(jīng)65。C預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液(lOOmMTris-HClpH8.0，20mMEDTA，1.4MNaCl，2.0%CTAB，1%PVP)，65。C水浴40min，每隔10min搖動(dòng)混勻;3)加入等體積的氯仿異戊醇混合液(含76:4:20的氯仿異戊醇乙醇(v/V))，搖動(dòng)混勻3min，靜置3min;4)10000rpm離心8min，小心轉(zhuǎn)移上清于另一潔凈的1.5mL離心管中；5)加入0.8倍體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置片刻出現(xiàn)白色絮狀沉淀；6)10000rpm離心5min，棄上清收集沉淀；7)加入800iiL75%的乙醇洗滌沉淀；8)12000rpm離心3min后棄上清；9)超凈臺(tái)上吹干沉淀后加入200iiLTE(pH8.0)溶解備用。2.2水稻植株總RNA的提取植株總RNA采用TRIzol(Invitrogen)試劑提取，具體步驟如下1)約lg植株葉片在液氮中研磨勻槳后，迅速轉(zhuǎn)移100mg于事先預(yù)冷的用DEPC處理過(guò)的1.5mL離心管；2)加入lmLTRIzol提取液振蕩混勻；3)室溫靜置5分鐘后，加入0.2mL的氯仿，搖動(dòng)混勻3分鐘后，室溫放置15min;4)在12，000Xg條件下，4。C離心15min，轉(zhuǎn)移上清至RNA專(zhuān)用1.5mL離心管；5)加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻后于室溫靜置10min;6)12，000Xg，4。C離心10min沉淀RNA;7)棄上清，加入lmL75%酒精洗滌沉淀兩次；8)空氣中自然干燥后加入20iiLDPEC處理的ddH20溶解保存于_701:冰箱備用。2.3突變位點(diǎn)檢測(cè)從日本晴、中花11及突變體LF1132的葉片中分離基因組DNA，由于在突變體中插入了279bp的片段，因此可以用PCR檢測(cè)突變體中的突變位點(diǎn)。PCR檢測(cè)所用引物為SEF:5'-AGAGGAACAGGAGAAGACGC-3'和SER:5'-ACCACTATGCTGCTGCTCAC-3'。擴(kuò)增條件為lmin/95。C;30cycles(30sec/94。C，30sec/58。C，lmin/72。C);5min/72。C。反應(yīng)體系如下(總體積20iiL):DNA10-30ng10XBuffer(含20mMMg2+)2iiLd證(2.5mM)0.2mMSEF0.2iiMSER0.2iiMExTaq酶(TaKaRa)1UddH20補(bǔ)至20iiL2.4Hdl-3在突變體與野生型中的表達(dá)分析為了分析Hdl-3在突變體與野生型中的表達(dá)情況，田間自然條件下24小時(shí)取樣，從早晨9點(diǎn)30分開(kāi)始取樣，每隔3小時(shí)取樣一次，共取9次樣?？俁NA從30天大小的植株葉片中分離后用DNaseI(Invitrogen，USA)處理消化基因組DNA。1yg的總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa，Dalian，China)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序如下(總體積20iiL):總RNAlug10iiM01igo(dT)5iiL70。C變性10mindNTP(10mM)1iiLRNA酶抑制劑(TaKaRa)1UM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/iiL)0.6iiLddH20補(bǔ)至20iiLlh/42°C;15min/7(TC。后保存于-2(TC冰箱中備用。合成的cDNA用Hdl-3基因的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，以水稻OsActinl做內(nèi)參相對(duì)分析Hdl-3基因的表達(dá)?；虮磉_(dá)特異引物序列為:HD1F:5，-GGTTATGGAGTTGTGGGAGCAGAC-3，和HD1R:5'-AGTGAAGGGACATCTGAAGCGAGG-3'。OsActinl內(nèi)參引物序歹lj為ActinF:5'-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3'和ActinR:5'-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3'。PCR擴(kuò)增條件如下對(duì)于Hdl-3基因lmin/95。C;35cycles(30sec/94°C，30sec/60°C，30sec/72°C);5min/72°C。對(duì)于OsActinl:lmin/95。C;26cycles(30sec/94°C，30sec/60°C，30sec/72°C);5min/72°C。反應(yīng)體系如下(總體積20L):cDNA1iiL10XPCRBuffer(含20mMMg2+)2iiLd證(2.5mM)0.2mMHdlF/ActinF0.2iiMHdlR/ActinR0.2iiMExTaq酶(TaKaRa)1UddH20補(bǔ)至20iiL2.5Hdl-3和Hd3a實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timePCR)分析為了分析在控制條件下的Hdl-3和Hd3a的精確表達(dá)，移入4個(gè)人工氣候箱約兩周的材料的葉片被收集，24h晝夜取樣，每隔4h取一次樣，并提取總RNA。用DNaseI(Invitrogen，USA)消化基因組DNA。1iig的總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa，Dalian，China)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序同2.2.3所述。反轉(zhuǎn)錄好的cDNA用于Real-timePCR模板。Real-timePCR按照SYBRGreenPCRmastermix(Tiangen，Beijing,China)試劑盒說(shuō)明操作，在StratageneMx3000PThermalSystem(STRATAGENE，USA)PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。Hdl-3基因所用引物序列同2.2.3所述。Hd3a基因引物序列為HD3aF:5'-TTGGTAGGGTTGTGGGTGATGTGC-3'和HD3aR:5'-AGGTTAGGGTCACTTGGGCTTGGT—3'。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)，并用OsActinl作為內(nèi)參相對(duì)定量分析，數(shù)據(jù)分析采用Livak描述的2—AAet方法進(jìn)行(Livaketal.2001)。Real-timePCR擴(kuò)增條件為2min/95°C;40cycles(20sec/95°C，30sec/60°C，30sec/68°C)。反應(yīng)體系如下(總體積20iiL):cDNA1iiL2.5XPCRmastermixPrimerF0.2iiMPrimerR0.2iiMddH20補(bǔ)至3結(jié)果分析3.1突變體的表型描述及遺傳分析lfl132突變體來(lái)源于構(gòu)建的水稻T-DNA插入突變體庫(kù)，在中國(guó)水稻研究所實(shí)驗(yàn)田正季種植(光周期大約為14h光，10h暗)條件下，表現(xiàn)明顯的早抽穗表型(圖1A)。突變體lfll32大約比野生型中花11早抽穗18天。另外，與野生型相比，突變體的生長(zhǎng)量也有所下降，例如穗長(zhǎng)變短，株高及分蘗數(shù)也下降(圖IB)。為了研究突變體的遺傳規(guī)律，我們用lfl132和中花11雜交，所獲得的F2分離群體種植于北京(長(zhǎng)日照條件)，在種植的1020個(gè)F2單株，有253株早抽穗植株，播種后57天抽穗；254株晚抽穗植株，播種后76天抽穗；513株中間表型的，但其抽穗期更接近于晚抽穗表型植株，播種后70天抽穗。表明突變體早抽穗的表型是由單基因控制的。為了更近一步分析突變體的抽穗期，探索引起早抽穗的可能環(huán)境因素，我們采用分期播種方法將突變體及中花11種植于中國(guó)水稻研究所實(shí)驗(yàn)田，共分6個(gè)時(shí)期播種，分別為5月15日、5月28日、6月12日、6月23日、7月10日和7月21日。同時(shí)記錄播種到抽穗期間的天氣情況。結(jié)果表明，突變體在6個(gè)播期的抽穗天數(shù)(從播種至抽穗的天數(shù))分別為61d、50d、49d、43d、41d和47d，分別比野生型中花11提早14d、18d、17d、16d、18d和lld(圖1C)。大體上，突變體及野生型的抽穗天數(shù)隨著播種期的推遲都縮短，但7月21日播種相對(duì)7月10日播種，lfl132生育期有所延長(zhǎng)，這可能與抽穗期間低溫有關(guān)(平均溫度低于24°C，圖IE紅框所示)根據(jù)光周期變化趨勢(shì)，從第一個(gè)播種期5月15日開(kāi)始到最后一個(gè)抽穗期9月17日，日照長(zhǎng)度大約從13.3h增加到最大值14h(6月23日)，之后逐漸下降至12.lh(9月20日)(圖1D)。然而溫度基本上隨著播種期的推遲而升高，除了7月21日播種后，在即將抽穗一段時(shí)間內(nèi)由于杭州連續(xù)陰雨天氣而使溫度下降(平均溫度低于24t:，最低為19t:;圖1E)。從上面的數(shù)據(jù)，我們初步推斷突變體的表型可能與光周期或者溫度密切相關(guān)。3.2人工氣候箱控制條件下突變體與野生型抽穗期分析為了精確研究光周期與溫度對(duì)突變體及野生型的效應(yīng)，我們將兩材料種植于4個(gè)不同光周期與溫度設(shè)置的人工氣候箱中，4個(gè)人工氣候箱由2個(gè)光周期處理(長(zhǎng)日照條件LD:14.5h光，9.5h暗；短日照條件SD:11.5h光，12.5h暗)與2個(gè)溫度處理(高溫27"和低溫23°C)組合而成。在高溫27t:條件下，突變體lfl132在SD和LD條件下的抽穗天數(shù)(從播種至抽穗所經(jīng)歷的時(shí)間，下同)分別為45天和45.8天，而中花11在SD和LD條件下的抽穗天數(shù)分別為48天和69天(圖2A，表1)，表明突變體對(duì)光周期表現(xiàn)鈍感。突變體在SD條件下的抽穗期比野生型早3天，但在LD條件下比野生型提早14天抽穗。野生型和突變體的短日促進(jìn)率分別為30.4%和1.7%，表明短日照條件對(duì)野生型有明顯的促進(jìn)效應(yīng)，但對(duì)突變體沒(méi)有明顯的促進(jìn)效應(yīng)(表1)。在低溫23t:條件下，突變體lfl132在SD和LD條件下的抽穗天數(shù)分別為65.2天和54.6天，而中花11在SD和LD條件下的抽穗天數(shù)分別為67.6天和81天(圖2A，表1)，突變體在SD條件下的抽穗期比野生型早2.4天，但在LD條件下比野生型提早27天抽穗。水稻是短日照植物，SD條件可以促進(jìn)水稻的抽穗，而LD條件抑制其抽穗。然而本研究中，SD條件不能促進(jìn)突變體的抽穗，反之，LD條件促進(jìn)了突變體的抽穗，突變體的短日促進(jìn)率表現(xiàn)為負(fù)數(shù)(-19.4%，表1)。但野生型表現(xiàn)正常，短日促進(jìn)率為16.5%，表明短日照條件對(duì)野生型有明顯的促進(jìn)效應(yīng)，但對(duì)突變體沒(méi)有促進(jìn)效應(yīng)(表l)。暗示了光周期在低溫23t:條件下對(duì)突變體的抽穗具有負(fù)向的調(diào)控效應(yīng)，突變體的抽穗期會(huì)被長(zhǎng)日縮短而不是通常的延長(zhǎng)。另外，與高溫27t:條件下相比，在低溫條件下突變體及野生型的抽穗期都推遲了，野生型和突變體在SD條件下的高溫促進(jìn)率分別為29%和30.7%，在LD條件下的高溫促進(jìn)率分別為14.8%和16.1%(表1)，在不同光周期下，高溫都有促進(jìn)抽穗的作用，在短日條件下促進(jìn)作用更明顯。表明溫度可以正向調(diào)控水稻的抽穗期，低溫條件對(duì)水稻的抽穗具有抑制作用。3.3不同溫度及光照條件下對(duì)主莖葉片數(shù)的影響—般地，植物主莖出葉數(shù)可以反應(yīng)植物抽穗開(kāi)花的時(shí)間差異，因此我們分析了突變體與野生型的主莖出葉數(shù)和出葉速率。從人工氣候箱不同溫度及光周期下的出葉數(shù)可以看出(表2)，在高溫27t:條件下，突變體lfl132在SD和LD條件下的主莖葉片數(shù)均為9張，而野生型中花11在同樣的條件下分別為8張和11張，光周期沒(méi)有影響突變體的主莖葉片數(shù)，但野生型主莖葉片數(shù)在LD條件下有所增加，間接表明了突變對(duì)光周期鈍感，而野生型對(duì)光周期敏感。無(wú)論在SD條件下還是LD條件下，突變體的出葉速率高于野生型出葉速率(圖2B)，表明突變體的抽穗期提早，這與上述的不同光周期條件下突變體的抽穗期早于野生野生型抽穗期相一致。在低溫23°CT，突變體lfl132在SD和LD條件下的主莖葉片數(shù)均為10張和9張，而野生型中花11在同樣的條件下分別為9張和11張(表2)，突變體在LD條件下的主莖葉片數(shù)比SD條件下少1張，SD和LD條件下的出葉速率分別為0.20張/天和0.25張/天，LD條件下的出葉速率快于SD條件下出葉速率(圖2B)。這表明突變體在LD條件下抽穗期提早，與上述突變體在LD條件下抽穗期比在SD條件下提早約11天的結(jié)果相一致。而野生型中花11的主莖葉片數(shù)表現(xiàn)出短日比長(zhǎng)日少，而在SD和LD條件下的每天出葉速度基本一致，為0.17張/天(圖2B)。但是無(wú)論在SD條件下還是在LD條件下，突變體和野生型在低溫23°C下的出葉還率都減慢了，表明低溫抑制了水稻的生長(zhǎng)發(fā)育，推遲了水稻的抽穗期。表1不同光周期與溫度對(duì)突變體和野生型抽穗期的效應(yīng)中花11SD凈增加(天)短日促進(jìn)SDLD凈增加短日促進(jìn)率(％)(天)率(％)27'C4545.80.81.748692130.423'C65.254.6-10.6-19.467.68113.416.5凈增加(天)20.28.819.612高溫促進(jìn)率(％)30.716.12914.8表2不同光周期與溫度對(duì)突變體和野生型出葉數(shù)的影響12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3.4lflll32突變位點(diǎn)序列分析以前研究中，sel突變體HS66和HS110展示早抽穗表型，并表現(xiàn)光周期鈍感。后來(lái)證明Sel與Hdl是等位的(Yanoetal.2000)。序列分析發(fā)現(xiàn)HS66和HS110在Hdl位點(diǎn)分別含有一個(gè)43bp缺失和一個(gè)433bp插入。另外和日本晴相比，HS66、HS110和它們野生型Ginbouzu在Hdl位點(diǎn)都含有一個(gè)36bp插入和一個(gè)單堿基替換(Yanoetal.2000)。本研究中，lfl132突變體表型和sel突變體非常相似，因此我們對(duì)lfl132突變體和中花11的Hdl位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析，看是否在突變體的Hdl位點(diǎn)含有突變發(fā)生。測(cè)序結(jié)果表明，和日本晴序列相比，中花11的Hdl位點(diǎn)含有一個(gè)36bp插入和一個(gè)單堿基替換(同于Ginbouzu的突變位點(diǎn))(圖3A)。但在lfl132突變體中，除了與中花11在同一位置含有一個(gè)36bp插入和一個(gè)單堿基替換外，還含有6個(gè)新的單堿基替換和兩個(gè)新的插入片段，一個(gè)129bp的插入片段和一個(gè)150bp插入片段，這兩個(gè)插入片段位于Hdl位點(diǎn)的第一個(gè)外顯子中，由該位點(diǎn)本身基因組序列重復(fù)組成(圖3A)。我們推斷突變體的早抽穗表型可能是由6個(gè)新的單堿基替換和兩個(gè)新的插入片段造成的，因?yàn)樵谥谢?1和前人研究的Ginbouzu中都含有相同的36bp插入和一個(gè)單堿基替換。PCR檢測(cè)證明，在突變體lfl132中能成功擴(kuò)增出兩個(gè)新插入位點(diǎn)，但在中花ll和日本晴中不能擴(kuò)增出129bp的插入片段和150bp插入片段(圖3B)。以上結(jié)果表明該基因是一個(gè)新的等位基因，在長(zhǎng)照條件下能促進(jìn)水稻的抽穗，定名為hdl-3。為了檢測(cè)hdl-3突變是否造成了該基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化，我們?cè)?4小時(shí)光周期內(nèi)取樣，每隔3小時(shí)取一次，從30天大小的水稻植株葉片中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用RT-PCR分析該基因在突變體和野生型樣品的表達(dá)水平，結(jié)果表明在突變體植株中，hdl-3表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上都急劇下降(圖3C)，但在一些時(shí)間點(diǎn)仍可以檢測(cè)到hdl-3表達(dá)。盡管在lfl132突變體中含有2個(gè)新的插入片段及6個(gè)新的單堿基替換，但這些突變沒(méi)有造成終止密碼子，因此hdl-3仍然可以翻譯成一個(gè)蛋白質(zhì)(圖3D)。另外，這些突變沒(méi)有發(fā)生在鋅指結(jié)構(gòu)域中。這些突變可能僅僅影響了Hdl-3蛋白的活性，所以在lfl132突變體，hdl-3仍然有低水平的表達(dá)。為了證明lfll32突變表型是由hdl-3位點(diǎn)突變?cè)斐傻?，lfll32和中花11回交產(chǎn)生F2分離群體，并根據(jù)期抽穗期判定表型。1020個(gè)F2單株，有253株早抽穗植株(突變體表型)，254株晚抽穗植株，513株中間表型植株。我們從253株早抽穗植株、32株晚抽穗植株及64株中間型植株的葉片中提取基因組DNA，用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖分析，PCR檢測(cè)表明253株早抽穗植株都擴(kuò)增出了lfl132突變體的帶型，31株晚抽穗植株展示了中花11帶型，65株展示了雜合帶型(圖3E)。這一結(jié)果暗示了lfll32突變表型是由hdl-3位點(diǎn)突變?cè)斐傻摹?.5Hdl-3和Hd3a在不同光周期和不同溫度條件下的表達(dá)分析上面的分析證明了突變體lfl132的早抽穗突變體表型是由于Hdl-3位點(diǎn)突變?cè)斐傻?，為了從分子水平揭示水稻抽穗期的機(jī)理，我們用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析了野生型Hdl-3在不同光周期和不同溫度條件下的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，Hdl-3mRNA在不同光周期和不同溫度條件下展示了相似的表達(dá)模式，在夜晚有較高的表達(dá)水平，在白天表達(dá)量下降(圖4)，表明Hdl-3夜間的表達(dá)模式?？偟恼f(shuō)來(lái)，光周期和溫度對(duì)Hdl-3mRNA水平影響較小，但在LD條件下Hdl-3mRNA水平略高，尤其在低溫長(zhǎng)日照條件下的表達(dá)水平提高(圖4)。Hdl-3這種表達(dá)水平與擬南芥中CO基因的表達(dá)模式相似(Putterilletal.1995;Bldzquezetal.2003)。以前研究已經(jīng)表明Hd3a是水稻抽穗開(kāi)花的激活子，并受Hdl的調(diào)控。短日照條件下高水平的Hd3a表達(dá)量可以促進(jìn)水稻的抽穗，長(zhǎng)日照條件下低水平的Hd3a表達(dá)量抑制水稻的抽穗(Izawaetal.2002;Kojimaetal.2002)。所以我們分析了在不同光周期和不同溫度條件下突變體和野生型中Hd3a的表達(dá)水平。結(jié)果表明，無(wú)論在SD還是在LD條件下，低溫處理都大大降低了突變體和野生型Hd3amRNA水平(圖5A，B，C，D)。上面抽穗期的研究結(jié)果表明低溫條件抑制了突變體和野生型的抽穗期(表l)，和低溫條件下的Hd3a表達(dá)結(jié)果相一致。所以這一結(jié)果表明低溫條件下突變體和野生型的晚抽穗是由于低水平的Hd3a表達(dá)所致。Hd3a在白天有較高的表達(dá)水平，夜間表達(dá)水平降低，顯示了白天表達(dá)模式。在SD條件下，Hd3a有較高的表達(dá)水平，但在LD條件下，Hd3a的表達(dá)被抑制，與前人的研究結(jié)果一致(Kojimaetal.2002)(圖5E，F(xiàn))。另外，在SD條件下，Hd3a在突變體與野生型中表達(dá)峰值不同，野生型在光期開(kāi)始達(dá)到表達(dá)高峰，但突變體在暗期開(kāi)始達(dá)到峰值(圖5E，F(xiàn))，在光階段后期Hd3a在突變體中表達(dá)水平明顯高于野生型，但在光階段前期Hd3a在野生型中的表達(dá)高于突變體。在LD條件下，Hd3a在野生型中的表達(dá)很難檢測(cè)得到，但在突變體中可能明顯檢測(cè)到Hd3a表達(dá)，暗示了LD條件下Hdl-3對(duì)Hd3a的負(fù)調(diào)控作用(圖5G，H)。[cms]參考文獻(xiàn)1.AbeM，KobayashiY，YamamotoS，DaimonY，YamaguchiA，IkedaY，IchinokiH，NotaguchiM，GotoKandArakiT.FD，abZIPproteinmediatingsignalsfromthefloralpathwayintegratorFTattheshootapex.Science.2005，309:1052-1056.2.AlabadiD，0yamaT，YanovskyMJ，HarmonFG，MasP，KaySA.ReciprocalregulationbetweenTOClandLHY/CCAlwithintheArabidopsiscircadianclock.Science2001,293:880-883.3.DoiK，IzawaT，F(xiàn)useT，YamanouchiU，KuboT，ShimataniZ，YanoMandYoshimuraA.Ehdl，aB—typeresponseregulatorinrice，confersshort—daypromotionoffloweringandcontrolsFT—likegeneexpressionindependentlyofHdl.Genes&Dev.2004，18:926-936.4.Gustafson-Brown，C.，Savidge，B.andYanofsky，M.F.RegulationoftheArabidopsisfloralhomeoticgeneAPETALA1.Celll994，76:131-143.5.HayamaR，YokoiS，TamakiS，YanoM，Shimamoto{(.Adaptationofphotoperiodiccontrolpathwaysproducesshort_dayfloweringinrice.Nature2003，422:719-722.6.HuangT，BohleniusH，ErikssonS，ParcyF，Nilsson0.ThemRNAoftheArabidopsisgeneFTmovesfromleaftoshootapexandinducesflowering.Science2005,309:1694-1696.7.IshikawaR，TamakiS，YokoiS，InagakiN，ShinomuraTetal.SuppressionofthefloralactivatorHd3aistheprincipalcauseofthenightbreakeffectinrice.PlantCell2005,17:3326-3336.8.IzawaT.Daylengthmeasurementsbyriceplantsinphotoperiodicshort—dayflowering.InternationalReviewofCytology2007,256:191—222.9.IzawaT，0ikawaT，SugiyamaN，TanisakaT，YanoM，ShimamotoK.PhytochromemediatestheexternallightsignaltorepressFTorthologsinphotoperiodicfloweringofrice.Genes&Dev.2002，16:2006-2020.10.IzawaT，0ikawaT，TokutomiS，0kunoK，ShimamotoK.Phytochromesconferthephotoperiodiccontroloffloweringinrice(ashort-dayplant).PlantJ.2000，22:391-399.11.KardailskyI，ShuklaVK，AhnJH，DagenaisN，ChristensenSK，NguyenJT，ChoryJ，HarrisonMJ，WeigelD.ActivationtaggingofthefloralinducerFT.Science1999,286:1962-1965.12.KikisEA，Kha皿aR，QuailPH.ELF4isaphytochrome-regulatedcomponentofanegativefeedbackloopinvolvingthecentraloscillatorcomponentsCCAlandLHY.PlantJ.2005，44:300-31313.KimSL，LeeS，KimHJ，NamHG，AnG.0s廳S51isashort-dayfloweringpromoterthatfunctionsupstreamofEhdl，0sMADS14，andHd3a.PlantPhysiol.2007，145:1484-1494.14.KojimaS，TakahashiY，KobayashiY，Mo皿aL，SasakiT，ArakiT，YanoM.Hd3a，ariceorthologoftheArabidopsisFTgene，promotestransitiontofloweringdownstreamofHdlundershort—dayconditions.PlantCellPhysiol.2002，43:1096-1105.15.LiljegrenSJ，Gustafson-BrownC，PinyopichA，DittaGS，YanofskyMF.Interactio固mongAPETALA1，LEAFY，andTERMINALFL0WER1specifymeristemfate.PlantCell.1999,11:1007-1018.16.LinC.Photoreceptorandregulationoffloweringtime.PlantPhysiol.2000a，123:39_50.17丄inHX，LiangZW，SasakiT，YanoM.FinemappingandcharacterizationofquantitativetraitlociHd4andHd5controllingheadingdateinrice.BreedSci2003,53:51-59.18.LinHX，YamamotoT，SasakiT，YanoM.CharacterizationanddetectionofepistaticinteractionsofthreeQTLs，Hdl，Hd2andHd3，controllingheadingdateinriceusingnearlyisogeniclines.TheorApplGenet1998，101:1021-1028..19.LivakKJ，SchmittgenTD.AnalysisofRelativeGeneExpressionDataUsingReal_Time(3uantitativePCRandthe2_AACtMethod.Methods2001,25:402-408.20.PutterillJ，RobsonF，LeeK，SimonR，CouplandG.TheC0NSTANSgeneofArabidopsispromotesfloweringandencodesaproteinshowingsimilaritiestozincfingertranscriptionfactors.Cell1995，80:847_857.21.StrayerC，0yamaT，SchultzTF，RamanR，SomersDE，MasP，PandaS，Kr印sJA，KaySA.CloningoftheArabidopsisclockgeneTOCl，anautoregulatoryresponseregulatorhomolog.Science2000,289:768_771.22.Suc5rez-L6pezP，WheatleyK，RobsonF，0nouchiH，ValverdeF，CouplandG.CONSTANSmediatesbetweenthecircadianclockandthecontroloffloweringinArabidopsis.Nature2001,410:1116-1120.23.TakahashiY，ShomuraA，SasakiT，YanoM.Hd6，aricequantitativetraitlocusinvolvedinphotoperiodsensitivity,encodesthesub皿itofproteinkinaseCK2.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2001,98:7922—7927.24.TakanoM，InagakiN，XieX，YuzuriharaN，HiharaF，Ishizuk，YanoM，NishimurM，MiyaoA，HirochikaHandShinomurT.DistinctandCooperativeFunctionsofPhytochromesA，B，andCintheControlofDeetiolationandFloweringinRiceThePlantCell.2005，17，3311-332525.ThomasB，Vince-PrueD.PhotoperiodisminPlants.1997，AcademicPress,London,UK.26.WangZY，TobinEM.ConstitutiveexpressionoftheCIRCADIANCLOCKASS0CIATED1(CCA1)genedisruptscircadianrhythmsandsuppressesitsownexpression.Cell1998,93:1207-1217.27.WiggePA，KimMC，JaegerKE，BuschW，SchmidM，LohmannJU，WeigelD.IntegrationofSpatialandTemporalInformationDuringFloralInductioninArabidopsis.Science2005,309:1056-1059.28.WuCY，YouCJ，LiCS，LongT，ChenGX，ByrneMEandZhangQF.RIDl，encodingaCys2/His2_typezincfingertranscriptionfactor,actsasamasterswitchfromvegetativetofloraldevelopmentinrice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2008,105:12915-12920.29.XueW，XingY，WengX，ZhaoY，TangW，WangL，ZhouH，YuS，XuC，LiX，ZhangQ.NaturalvariationinGhd7isanimportantregulatorofheadingdateandyieldpotentialinrice.NatGenet.2008，40:761-767.30.YamamotoT，KubokiY，LinSY，SasakiT，YanoM.FinemappingofquantitativetraitlociHdl，Hd2，andHd3，controllingheadingdateofrice，assingleMendelianfactors.TheorApplGenet1998,97:37—44.31.YamamotoT，LinHX，SasakiT，YanoM.IdentificationofheadingdatequantitativetraitlocusHd6andcharacterizationofitsepistaticinteractionswithHd2inriceusingadvancedbackcrossprogeny.Genetics2000，154:885—891.32.YanoM，KatayoseY，AshikariM，YamanouchiU，Mo皿aL，F(xiàn)useT，BabaT，YamamotoK，UmeharaY，NagamuraY，SasakiT.Hdl，amajorphotoperiodsensitivityquantitativetraitlocusinrice，iscloselyrelatedtotheArabidopsisfloweringtimegeneCONSTANS.PlantCell2000,12:2473-2484.33.ZhangYC，GongSF，LiQH，SangY，YangHQ.FunctionalandsignalingmechanismanalysisofriceCRYPTOCH匪E1.PlantJ.2006，46:971-98334.盧興桂(主編)，中國(guó)光、溫敏雄性不育水稻育性生態(tài).2003，北京科學(xué)出版社。權(quán)利要求調(diào)控水稻開(kāi)花的光周期鈍感突變體hd1-3基因的核苷酸序列為SEQIDNo.1，其所對(duì)應(yīng)的hd1-3mRNA序列為SEQIDNo.2。2.調(diào)控水稻開(kāi)花的光周期鈍感突變體hdl-3基因的氨基酸序列為SEQIDNo.3。3.權(quán)利要求1所述水稻光周期鈍感突變體hdl-3基因在調(diào)控水稻開(kāi)花方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及調(diào)控水稻開(kāi)花的光周期鈍感突變體hd1-3基因的核苷酸序列為SEQIDNo.1，其所對(duì)應(yīng)的hd1-3mRNA序列為SEQIDNo.2。本發(fā)明在構(gòu)建的水稻插入突變體庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)光周期鈍感突變體。該突變體為研究光周期條件下短日植物開(kāi)花機(jī)理提供了極好的基礎(chǔ)材料，通過(guò)本發(fā)明的研究，可望獲得一個(gè)功能明確的調(diào)控水稻開(kāi)花的重要功能基因，不僅為探明光周期條件下短日植物開(kāi)花機(jī)理提供證據(jù)和基礎(chǔ)材料，而且對(duì)于指導(dǎo)水稻的育種(特別是兩系雜交水稻育種)，調(diào)節(jié)水稻生長(zhǎng)期，進(jìn)一步提高水稻的產(chǎn)量，解決世界人口的糧食問(wèn)題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)效益，相關(guān)的研究將為水稻育種的分子設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)，并為其它作物的生產(chǎn)發(fā)展及理論研究提供借鑒。文檔編號(hào)C07K14/415GK101792770SQ20101014178公開(kāi)日2010年8月4日申請(qǐng)日期2010年4月8日優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日發(fā)明者孫宗修,欒維江申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)