專利名稱::一種鹿筋膠原蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明屬于膠原蛋白純化
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及一種采用鹽酸水解和胰蛋白酶酶解的提取純化工藝制備水溶性很好的鹿筋膠原蛋白的方法。
背景技術(shù):
:膠原的英文是collagen,源自希臘文,意思是“生成膠的產(chǎn)物”,它是一類重要的蛋白質(zhì)。1940年,Orekhovich等用檸檬酸緩沖液(pH3.O4.5)從大鼠皮中溶解出不溶于水的蛋白質(zhì),其中含有角蛋白及彈性蛋白,此外還有一種是膠原的前驅(qū)體,這種從酸性鹽溶液中提取的膠原被命名為“前膠原”。后來經(jīng)過許多研究者的努力,發(fā)現(xiàn)從中性鹽和堿性鹽溶液中也能提取出膠原。1953年,Gross把這種構(gòu)建膠原的蛋白質(zhì)單體命名為“原膠原”(tropocollagen),它是膠原的基本結(jié)構(gòu)單位,原膠原分子經(jīng)過多級聚集,形成了膠原。早先認(rèn)為膠原只不過是一個結(jié)構(gòu)單一的,既缺少免疫原性又缺乏生物活性的普通結(jié)構(gòu)蛋白。近30年來,由于生物化學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們對細(xì)胞外基質(zhì),特別是對其主要成分膠原的興趣日益濃厚,對其研究方法和結(jié)構(gòu)的認(rèn)識逐漸提高,現(xiàn)已肯定膠原并不是某一個蛋白質(zhì)的名稱,而是在結(jié)構(gòu)上既有共同特點又有差異的一組蛋白質(zhì)?,F(xiàn)在對膠原的定義是它是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),含有一個或幾個由α-鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域,即膠原域(VictoriaJ.Christiansen.ArchBiochemBiophys.2007,457(2)177-186)。膠原占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%30%,相當(dāng)于體重的6%,是構(gòu)成皮膚、韌帶、軟骨、肌腱等結(jié)締組織或器官的主要成分,起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的功能(將挺大,膠原與膠原蛋白[M],北京,化學(xué)工業(yè)出版社,2006,2)。膠原具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu),分子量大約為30萬,不溶于冷水和熱水,不能被蛋白酶利用;明膠是膠原在酸、堿、酶或高溫作用下的變性產(chǎn)物,它不是均一的蛋白質(zhì),而是一種熱可溶性的混合物,溫度降到30°C以下形成凝膠,加熱則液化;膠原蛋白是膠原或明膠的水解產(chǎn)物,具有較小的分子質(zhì)量,可溶于冷水,并且更易降解,易被人體消化吸收。近年來膠原蛋白不僅在食品(李二鳳,何小維、羅志剛,膠原蛋白在食品中的應(yīng)用[J],中國乳品工業(yè),2006,34⑵5759)、化妝品(薛艷麗,膠原蛋白與美容[J],中國實用醫(yī)藥,2006,1(9)84)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,現(xiàn)有研究表明其降解產(chǎn)物膠原蛋白尚具有降血壓、抗衰老、增加骨密度、降低甘油三酯和膽固醇(李彥春、程寶箴、靳立強(qiáng),膠原蛋白應(yīng)用[J],皮革化工,2002,19(3):1014),并且可以補(bǔ)充體內(nèi)某些必需的微量元素等多種生理活性。一般的蛋白質(zhì)含有20種氨基酸,而膠原蛋白中僅含有18種氨基酸,并且其氨基酸的組成特點為總氨基酸中約1/3是甘氨酸,存在特殊的羥脯氨酸和羥賴氨酸,缺少胱氨酸和色氨酸(將挺大,膠原與膠原蛋白[M],北京,化學(xué)工業(yè)出版社,2006,4)。在絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)中脯氨酸含量很少,而膠原蛋白中脯氨酸和羥脯氨酸的含量是各種蛋白質(zhì)中最高的,這兩種氨基酸為環(huán)狀氨基酸,能鎖住整個膠原分子,使之很難拉開,故膠原具有微彈性和很強(qiáng)的拉伸強(qiáng)度。鹿筋是鹿科動物梅花鹿CervusnipponTemminck或馬鹿Cervus.elaphusLinnaeus的四肢干燥筋,始載于《唐本草》。用于治療腎虛手足無力、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、勞損、轉(zhuǎn)筋等癥?,F(xiàn)有較多研究表明,攝取一定量的鹿筋膠原蛋白可預(yù)防和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(孫曉迪,李銀清,趙雨,等,鹿筋膠原對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用[J],中國中藥雜志,2009,34(21):3135-3138)、骨質(zhì)疏松等癥。目前,很多關(guān)于膠原蛋白的提取工藝研究,尚未發(fā)現(xiàn)對鹿筋中膠原蛋白提取工藝研究的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種鹿筋膠原蛋白的制備方法,其是將鹿筋采用鹽酸浸提,水煮提取后離心得到明膠,再經(jīng)胰蛋白酶酶解后離心,經(jīng)0.2μm0.45μm濾膜過濾后,將所得濾液凍干即制備得到含量很高的膠原蛋白。本發(fā)明所述的鹿筋膠原蛋白粉的制備方法,其步驟如下1)取新鮮鹿筋去脂肪、皮、筋膜后,切成0.5Icm3的小塊,用濃度為0.9%(g/100mL)的生理鹽水反復(fù)清洗去除血清和脂肪,再用蒸餾水沖洗干凈,置于_20°C冰箱中保存,含水率為;6368%;2)取上述處理好的鮮鹿筋,按料液比Ig5mlIg15ml的比例加入0.05%1.0%體積濃度的鹽酸溶液,然后置于4°C冰箱中浸泡12h60h,鹿筋吸收酸水而發(fā)生酸膨脹,將膨脹好的鹿筋取出置于100°C沸水中,至鹿筋全部溶解,然后用夾有脫脂棉的紗布過濾,棄掉殘渣;將濾出液于1200015000rpm/min條件下離心IOmin45min,棄掉沉淀得上清液,此上清液即為明膠溶液;3)向明膠溶液中加入NaOH,KOH、CaO或Na2CO3溶液調(diào)pH為6.57.5,1200015000rpm/min離心IOmin45min后,棄掉沉淀,保留上清液;4)取步驟3)的上請液200μ1,0.45μm濾膜過濾,取20μ1濾液進(jìn)樣,記錄高效液相凝膠色譜圖,用以對比酶解前后的分子量的大小,明膠溶液保留時間約為1012min;5)向步驟3)的上清液中加胰蛋白酶,酶與底物(底物指鮮鹿筋)比為Ig5000gIg50000g,置37°C恒溫水浴箱中,酶解0.53h后立即升溫至80100°C,保溫1015min,使胰蛋白酶失活;上清液取出放置至室溫,1200015000rpm/min條件下離心IOmin45min,棄掉沉淀,即得膠原蛋白溶液;6)取膠原蛋白溶液200μ1,0.45μm濾膜過濾,取20μ1濾液進(jìn)樣,記錄高效液相凝膠色譜圖,水解后膠原蛋白保留時間約為2022min;7)將步驟5)的膠原蛋白溶液加熱濃縮,然后放置至室溫,用0.2μm0.45μm濾膜過濾,將濾液凍干,即得膠原蛋白粉。8)采用Folin-酚試劑法測定膠原蛋白粉中膠原蛋白含量,膠原蛋白粉收率為62.5280.31%(以絕干重計),膠原蛋白含量為50.1372.25%(質(zhì)量百分比)。本發(fā)明制備的膠原蛋白具有的優(yōu)點1、實驗工藝簡單易操作,實驗結(jié)果穩(wěn)定,可適用于工業(yè)大生產(chǎn);2、本發(fā)明采用的是低濃度鹽酸(0.05%1.0%)浸提,防止強(qiáng)酸使氨基酸結(jié)構(gòu)破壞;3、本發(fā)明采用胰蛋白酶酶解,對比胃蛋白酶,酶解時間短,酶解條件溫和,酶解程度高;4、本發(fā)明采用酸解后酶解的方法,可以確保膠原蛋白的肽鏈結(jié)構(gòu)保持較為完整;5、膠原分子量大約為300000Da,不溶于冷水和熱水,不能被蛋白酶利用,而水解得到的膠原蛋白分子量大部分在6500Da以下,可溶于冷水,且易降解,易被人體吸收利用;6、本發(fā)明得到的膠原蛋白產(chǎn)率高,含量高,不僅可用于食品,化妝品等,對其藥理作用研究表明,其對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及骨質(zhì)疏松癥有一定的預(yù)防和治療作用。圖1明膠溶液和膠原蛋白溶液的高效液相凝膠色譜圖。其中,曲線A為明膠溶液高效液相凝膠色譜圖;曲線8000酶解Ih后膠原蛋白溶液高效液相凝膠色譜圖;曲線C為110000酶解3h后膠原蛋白溶液高效液相凝膠色譜圖;曲線D為130000酶解3h后高效液相凝膠色譜圖。鹿筋中的膠原具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu),文獻(xiàn)中報道分子量大約為三十萬,不溶于熱水,不能被蛋白酶酶解;酸膨脹后的鹿筋經(jīng)加熱水解成明膠,明膠的分子量大約為十幾萬,不易被人體消化吸收;經(jīng)胰蛋白酶酶解得到的為膠原蛋白,分子量主要在6500Da以下,此時的膠原蛋白易降解,已被人體消化吸收。從高校液相凝膠色譜圖中可以很容易的看出水解后的明膠和不同酶與底物比酶解得到的膠原蛋白分子量的變化,是一種檢測蛋白水解程度的一種方法。采用美國AglientllOO高效液相,SKgelG2000SW(XL)凝膠柱測定。色譜條件流動相為0.IMNa2HPO4,0.IMNaH2PO4,0.IMNa2SO4,ρΗ6·6,流速為0.5ml/min。標(biāo)準(zhǔn)分子量15.48min,分子量75000Da;17.04min,分子量43000Da;18.93min,分子量29000Da;19.85min,分子量13700Da;21.23min,分子量6500Da。采用美國AglientllOO高效液相,WondasilC18柱(4.6X150mm)測定。色譜條件流動相A:0.lmol/L醋酸鈉緩沖溶液(取醋酸鈉39.78g,加水至4850mL,用36%醋酸調(diào)至PH6.5)-乙腈(973);流動相B:乙腈-水(41)。流速1.Oml/min;柱溫35°C;檢測波長:254nm;進(jìn)樣量20μL。表1鹿筋膠原蛋白中18氨基酸含量采用HPLC-C18柱測定膠原蛋白粉中氨基酸含量,從表1中得到鹿筋膠原蛋白中甘氨酸含量為31.796%,羥脯氨酸含量為7.042%,脯氨酸含量為14.561%,符合膠原蛋白中氨基酸含量特點。表1鹿筋膠原蛋白中的18氨基酸及含量(質(zhì)量百分比)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>具體實施例方式實施例11)取新鮮鹿筋去脂肪、皮、筋膜后,切成0.5Icm3的小塊,用0.9%的生理鹽水反復(fù)清洗去除血清和脂肪,再用蒸餾水沖洗干凈,置-20°C冰箱中保存,含水率約為65%;2)取上述處理好的鮮鹿筋30g,按料液比Ig10ml,加入300ml、0.1%體積濃度的鹽酸溶液置4°C冰箱中12h,使鹿筋吸收酸水而發(fā)生酸膨脹,12小時后取出鹿筋置于100°C沸水中,至鹿筋全部溶解,所用時間為75min,然后用夾有脫脂棉的紗布過濾,將濾液離心(12000rpm/min、30min),棄掉沉淀,保留上清液;3)向上清液中加入IM的NaOH溶液調(diào)pH至7.0,離心(12000rpm/min、30min),棄掉沉淀,保留上清液,即為明膠溶液;4)取步驟3)的明膠溶液200μ1,0.45μm濾膜過濾,取20μ1濾液進(jìn)樣,記錄高效液相凝膠色譜圖,明膠溶液保留時間約為12min,結(jié)果見圖1中A;5)向步驟3)的明膠溶液中按酶與底物比IgSOOOg加胰蛋白酶0.0037g,置于37°C恒溫水浴中酶解lh,lh后立即升溫至80°C以上,保持lOmin,使胰蛋白酶失活。取出放置至室溫,離心(12000rpm/min、30min),棄掉沉淀,上清液即為膠原蛋白溶液;6)取步驟5)中膠原蛋白溶液200μ1,0.45μm濾膜過濾,取20μ1濾液進(jìn)樣,記錄高效液相凝膠色譜圖,水解后膠原蛋白保留時間約為21min,結(jié)果見圖1中B;7)將步驟5)膠原蛋白溶液濃縮至100ml,放置至室溫,用0.45μm濾膜過濾,濾液凍干,即得膠原蛋白粉,收率為70.25%(以絕干重計),膠原蛋白含量為62.47%(質(zhì)量百分比)。實施例21)取新鮮鹿筋去脂肪、皮、筋膜后,切成0.5Icm3的小塊,用0.9%的生理鹽水反復(fù)清洗去除血清和脂肪,再用蒸餾水沖洗干凈,置-20°C冰箱中保存,含水率約為65%;2)取上述處理好的鮮鹿筋30g,按料液比IgIOml加0.2%體積濃度的鹽酸溶液置4°C冰箱中36h,使鹿筋吸收酸水而發(fā)生酸膨脹,36h后取出鹿筋置于100°C沸水中,至鹿筋全部溶解,所用時間為55min,然后用夾有脫脂棉的紗布過濾,將濾液離心(12000rpm/min、30min),棄掉沉淀,保留上清液;3)向步驟2)的上清液中加入IMNaOH溶液調(diào)pH至7.0,離心(12000rpm/min、30min),棄掉沉淀,保留上清液,即得明膠溶液;4)取步驟3)的明膠溶液200μ1,0.45μm濾膜過濾,取20μ1濾液進(jìn)樣,記錄高效液相凝膠色譜圖,明膠溶液保留時間約為12min,結(jié)果見圖1中A;5)向步驟3)的明膠溶液中按酶與底物比IgIOOOOg加胰蛋白酶0.003g,置于37°C恒溫水浴中酶解3h,3h后立即升溫至80°C以上,保持lOmin,使胰蛋白酶失活。取出放置至室溫,離心(12000rpm/min、30min),棄掉沉淀,上清液即為膠原蛋白溶液;6)取步驟5)中膠原蛋白溶液200μ1,0.45μm濾膜過濾,取20μ1濾液進(jìn)樣,記錄高效液相凝膠色譜圖,水解后膠原蛋白保留時間約為21min,結(jié)果見圖1中C;7)將步驟5)膠原蛋白溶液濃縮至100ml,放置至室溫,用0.45μm濾膜過濾,濾液凍干,即得膠原蛋白粉,收率為72.15%(以絕干重計),膠原蛋白含量為63.36%(質(zhì)量百分比)。實施例31)取新鮮鹿筋去脂肪、皮、筋膜后,切成0.5-lcm3的小塊,用0.9%的生理鹽水反復(fù)清洗去除血清和脂肪,再用蒸餾水沖洗干凈,置_20°C冰箱中保存,含水率約為65%;2)取上述處理好的鮮鹿筋30g,按料液比Ig15ml加0.8%體積濃度的鹽酸溶液置4°C冰箱中60h,使鹿筋吸收酸水而發(fā)生酸膨脹,60h后取出鹿筋置于100°C沸水中,至鹿筋全部溶解,所用時間為32min,然后用夾有脫脂棉的紗布過濾,將濾液離心(12000rpm/min、30min),棄掉沉淀,保留上清液;3)向步驟2)明膠溶液中加入IMKOH溶液調(diào)pH至7.0,離心(12000rpm/min、30min),棄掉沉淀,保留上清液,即得明膠溶液;4)取步驟3)的明膠溶液200μ1,0.45μm濾膜過濾,取20μ1濾液進(jìn)樣,記錄高效液相凝膠色譜圖,明膠溶液保留時間約為12min,結(jié)果見圖1中A;5)向步驟3)的明膠溶液中按酶與底物比Ig30000g加胰蛋白酶,置于37°C恒溫水浴中酶解3h,3h后立即升溫至80°C以上,保持lOmin,使胰蛋白酶失活。取出放置至室溫,離心(12000rpm/min、30min),棄掉沉淀,上清液即為膠原蛋白溶液;6)取步驟5)的膠原蛋白溶液200μ1,0.45μm濾膜過濾,取20μ1濾液進(jìn)樣,記錄高效液相凝膠色譜圖,水解后膠原蛋白保留時間約為21min,結(jié)果見圖1中D;7)將步驟5)的膠原蛋白溶液濃縮至100ml,放置至室溫,用0.45μm濾膜過濾,濾液凍干,即得膠原蛋白粉,收率為78.56%(以絕干重計),膠原蛋白含量為68.47%(質(zhì)量百分比)。權(quán)利要求一種鹿筋膠原蛋白的制備方法,其步驟如下1)取新鮮鹿筋去脂肪、皮、筋膜后,切成0.5~1cm3的小塊,用濃度為0.9%的生理鹽水反復(fù)清洗去除血清和脂肪,再用蒸餾水沖洗干凈,置于-20℃冰箱中保存,含水率為63~68%;2)取上述處理好的鮮鹿筋,加入鹽酸溶液,然后置于4℃冰箱中浸泡12h~60h,鹿筋吸收酸水而發(fā)生酸膨脹,將膨脹好的鹿筋取出置于100℃沸水中,至鹿筋全部溶解,然后用夾有脫脂棉的紗布過濾,棄掉殘渣;將濾出液離心后棄掉沉淀得上清液,此上清液即為明膠溶液;3)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為6.5~7.5,離心后棄掉沉淀,保留上清液;4)向步驟3)的上清液中加胰蛋白酶,然后置于37℃恒溫水浴箱中,酶解0.5~3h后立即升溫至80~100℃,保溫10~15min,使胰蛋白酶失活;上清液取出放置至室溫,離心后棄掉沉淀,即得膠原蛋白溶液;5)將步驟4)的膠原蛋白溶液加熱濃縮,然后放置至室溫,用0.2μm~0.45μm濾膜過濾,將濾液凍干,即得膠原蛋白粉。2.如權(quán)利要求1所述的鹿筋膠原蛋白的制備方法,其特征在于步驟2)中是按料液比Ig5mlIg15ml的比例在鮮鹿筋中加入鹽酸溶液。3.如權(quán)利要求1所述的鹿筋膠原蛋白的制備方法,其特征在于步驟2)中加入鹽酸溶液的體積濃度為0.05%1.0%。4.如權(quán)利要求1所述的鹿筋膠原蛋白的制備方法,其特征在于是在1200015000rpm/min條件下離心IOmin45min。5.如權(quán)利要求1所述的鹿筋膠原蛋白的制備方法,其特征在于步驟3)中是向明膠溶液中加入NaOH、KOH、CaO或Na2CO3溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為6.57.5。6.如權(quán)利要求1所述的鹿筋膠原蛋白的制備方法,其特征在于步驟4)中胰蛋白酶與鮮鹿筋的用量比為Ig5000gIg50000g。全文摘要本發(fā)明屬于膠原蛋白提取
技術(shù)領(lǐng)域:
,涉及采用鹽酸水解和胰蛋白酶酶解的提取純化工藝制備鹿筋膠原蛋白的方法。其是將鹿筋去脂肪,皮,筋膜后,切成0.5~1cm3的小塊,然后用生理鹽水反復(fù)清洗去除血清和脂肪,再用蒸餾水沖洗干凈后,按料液比1g∶5m/~1g∶15ml的比例加入0.05%~1.0%體積濃度的鹽酸浸泡12h~60h,然后將鹿筋置于100℃沸水中至鹿筋全部溶解,離心,上清用堿性溶液調(diào)至中性,加入胰蛋白酶酶解后離心,酶與底物比為1g∶5000g~1g∶50000g,上清液濃縮后0.2~0.45um濾膜過濾,濾液真空凍干,得到膠原蛋白粉。本發(fā)明工藝簡單易操作,實驗結(jié)果穩(wěn)定,可適用于工業(yè)大生產(chǎn)。文檔編號C07K1/12GK101805775SQ20101014357公開日2010年8月18日申請日期2010年4月12日優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日發(fā)明者張鶴,徐云鳳,惠歌,趙雨申請人:趙雨