專(zhuān)利名稱(chēng)：一種野生型p53蛋白的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥制品以及臨床檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域，具體涉及一種野生型p53蛋白分離純化的新方法。
背景技術(shù)：
p53基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)腫瘤相關(guān)性最高的基因，約半數(shù)以上的人類(lèi)腫瘤存在P53基因的改變。人類(lèi)p53基因定位于17pl3. 1，含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，編碼分子量為53KD的核磷酸蛋白，故稱(chēng)之為p53。p53基因分為野生和突變兩種類(lèi)型。野生型 P53蛋白半衰期很短(20 30min)，在組織內(nèi)不易積累，所以正常人體內(nèi)的p53水平較低。 在腫瘤患者體內(nèi)，P53基因發(fā)生突變，突變型p53蛋白半衰期長(zhǎng)達(dá)20 40h，可在腫瘤組織中積累，同時(shí)大量P53蛋白釋放到血液中，導(dǎo)致p53水平上升。按照p53基因其一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，可以將其分為3個(gè)區(qū)域第一、帶電荷的酸性N端區(qū)包含前部75 80aa，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似轉(zhuǎn)錄因子酸性區(qū)。第二、親水的富脯氨酸區(qū)人此區(qū)域?yàn)?0 150aa，小鼠為75 150aa， 其結(jié)構(gòu)類(lèi)似轉(zhuǎn)錄因子的富脯氨酸區(qū)。第三、帶電荷的堿性C端區(qū)。人的為319 393aa，小鼠為276 390aa，形成中級(jí)兩性螺旋結(jié)均，能與DNA專(zhuān)一順序結(jié)合。p53有5個(gè)進(jìn)化保守區(qū)，分別位于第13-19、第117-142、第171-181、第236-258和第270-288號(hào)氨基酸殘基。這些保守區(qū)的存在與P53蛋白的功能密切相關(guān)，可能是P53蛋白生物學(xué)活性的關(guān)鍵部位。p53基因作為體內(nèi)的抑癌基因，主要在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著如下重要的作用第一、參與細(xì)胞周期控制細(xì)胞內(nèi)p53對(duì)各種可能引起腫瘤的異常情況起零耐受作用，能有效地防止細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。DNA遭受各種損害均可激活p53，不同的蛋白激酶修飾P53不同的DNA結(jié)合活性，誘導(dǎo)激活不同的p53靶基因，導(dǎo)致細(xì)胞停頓于特定的周期位點(diǎn)ο第二、參與DNA的損傷應(yīng)答一系列的研究表明，野生型p53并非為所有細(xì)胞的凋亡過(guò)程所必需，但對(duì)DNA損傷而誘發(fā)的細(xì)胞凋亡卻是必不可少的。當(dāng)DNA由于各種原因損傷后，野生型P53首先誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G期，抑制細(xì)胞增殖，直至損傷的DNA修復(fù)。一旦DNA 不能被修復(fù)，野生型P53就會(huì)活化那些誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。第三、p53與衰老流性病學(xué)研究表明，p53在預(yù)防腫瘤中具有重要作用，然而p53 過(guò)量表達(dá)對(duì)宿主是致死的。研究人員研究了 p53與衰老的關(guān)系以及p53抑制腫瘤但不加速衰老的可能性，結(jié)果表明雖然在某些條件下，P53可能加速衰老，但p53激活仍然不失為一條腫瘤治療和預(yù)防的好策略。第四、參與細(xì)胞凋亡p53調(diào)節(jié)一些與凋亡有關(guān)的基因，這些基因有的編碼控制線(xiàn)粒體的完整性的蛋白質(zhì)，有的編碼細(xì)胞膜的死亡受體蛋白質(zhì)。細(xì)胞凋亡可能主要存在三條信號(hào)傳導(dǎo)途徑，即細(xì)胞凋亡的受體途徑、線(xiàn)粒體途徑和P53依賴(lài)的調(diào)控途徑。大量的研究表明野生型的P53具有負(fù)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)DNA損傷細(xì)胞走向細(xì)胞凋亡的功能。綜上所述，p53是細(xì)胞應(yīng)激的關(guān)鍵性調(diào)控分子之一，能整合多種細(xì)胞危急事件的信號(hào)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄途徑對(duì)這些信號(hào)作出包括生長(zhǎng)抑制及凋亡在內(nèi)的不同反應(yīng)，監(jiān)視細(xì)胞基因組的完整性。正常P53在體內(nèi)扮演“分子警察”的角色，可以抑制腫瘤的發(fā)生。因此，檢測(cè)人血清P53蛋白的水平，對(duì)腫瘤的早期診斷、判斷愈后、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)、指導(dǎo)治療以及高危人群篩查等都有一定的價(jià)值，血清P53蛋白水平是一種具有廣闊應(yīng)用前景的腫瘤生物學(xué)指標(biāo)，可作為診斷腫瘤是否發(fā)生的一種候選輔助手段。為了更好地研究p53基因的功能，首先需要得到高濃度和高純度的P53蛋白。以往的研究幾乎都是通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)，從誘導(dǎo)表達(dá)裂解的菌體沉淀的包涵體中通過(guò)變性而后復(fù)性的方式得到目的蛋白。這種方法雖然能使得原核表達(dá)的蛋白部分活性恢復(fù)，但是若需將此目的蛋白應(yīng)用于BIAC0RE分子互作或是進(jìn)行一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則還是存在一定的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效簡(jiǎn)便的生產(chǎn)高濃度、高純度P53蛋白的新方法，尤其涉及一種野生型P53蛋白分離純化的方法。本發(fā)明提供了一種野生型p53蛋白的分離純化方法，包括P53基因的克隆、構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化，基于原核系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解菌體，利用鎳柱親和層析來(lái)分離純化所得裂解上清中的P53蛋白。本發(fā)明所述p53蛋白的在ncbi 網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的 GeneID 為:71570所述的構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒是將克隆獲得的ρ53基因PCR產(chǎn)物，經(jīng)雙酶切后，與原核載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再?gòu)霓D(zhuǎn)化的平板上挑取單克隆，抽提質(zhì)粒。所述的誘導(dǎo)表達(dá)是重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，加入LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后在菌液中加入0. 05-0. 6mmol/L IPTG，在16°C _22°C這兩種不同的溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，4-20小時(shí)。所述的蛋白純化是預(yù)先用50%的Ni-NTA Slurry裝柱，5倍柱體積的蒸餾水洗柱，而后用10倍柱體積的binding buffer平衡柱后，將離心得到的菌體上清過(guò)柱，收集流穿液，然后用10mM-50mM濃度的咪唑洗滌液和100mM-300mM洗脫液進(jìn)行洗滌和洗脫，分步收集流出液，洗去非特異吸附的雜蛋白，收集特異性結(jié)合的P53蛋白。所述的重組表達(dá)質(zhì)粒是pET-3h_p53。所述的p53基因的克隆是以人肝cDNA為模板PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得p53基因的DNA 編碼序列。所述的PCR反應(yīng)退火溫度為62°C。具體PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C 變性40s，62°C退火30s，72°C延伸1.5min，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0所述的PCR 反應(yīng)的引物序列為 Tp53-A :5，-C CGA ATT CCC ATG GAG GAG CCG CAG TCA GATCC-3'和 Tp53-B 5' -AC GGA TCC TCA GTC TGA GTC AGG CCC TTC TGT C_3，。本發(fā)明的最大的優(yōu)勢(shì)在于從原核系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解的菌體上清中利用鎳柱親和層析來(lái)分離純化得到較大濃度的活性目的蛋白。本發(fā)明中沒(méi)有進(jìn)行包涵體的變性和復(fù)性，而是直接從超聲裂解的上清中純化蛋白，使得目的蛋白的活性得到了最大程度的保持，并通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)以及純化方案使得目的蛋白的得率較之現(xiàn)有方法有了較大的提尚ο
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1ρ53蛋白的分離純化一、材料與方法1.材料與試劑1. 1材料人肝cDNA，DH5a菌株，JM109感受態(tài)菌，H1299細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)載體pCMV-Myc，鼠(mouse)抗p53單克隆抗體購(gòu)于Clontech公司；PCR擴(kuò)增試劑盒； PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)于Boehringer公司；細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料公司；用^vitrogen脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；p53單克隆抗體(DOl) 購(gòu)于SANTACRUZ公司所用引物均由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。1. 2 試劑50XTAE :Tris 堿 242g加 ddH20 600ml 充分溶解，加冰乙酸 57. lml.O. 5M EDTA(pH 8. 0) 100ml，定容至 IL0瓊脂糖凝膠1 % Agarose,以1 XTAE為溶劑。LB液體培養(yǎng)基(pH 7. 0)1% polyp印tone (DIFC0 公司產(chǎn)品)，0. 5% bacto-yeast extract (DIFC0 公司產(chǎn)品)，1% NaCl，121°C，高壓濕熱滅菌20min。氨芐青霉素(儲(chǔ)存濃度100mg/ml) :0. 5g氨芐青霉素注入5ml滅菌ddH20充分溶解，分裝于1. 5ml離心管中，-20°C保存。30%丙烯酰胺將^g丙烯酰胺和Ig亞甲雙丙烯酰胺，溶于總體積為60ml的 ddH20中。加熱至37°C溶解，補(bǔ)加水至終體積100ml，查證該溶液pH值應(yīng)不大于7. 0，置棕
色瓶中保存于室溫。10%過(guò)硫酸胺lg過(guò)硫酸胺溶解于IOml的ddH20中，4°C保存。1. 5mol/L Tris (pH 8.8) :50ml ddH20 中溶解 18. 16g Tris堿，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至 8. 0，加 ddH20 定容至 100ml。lmol/L Tris (pH 6. 8) :80ml 水中溶解 12. Ilg Tris 堿，加入濃鹽酸調(diào) pH。SDS-PAGE 膠配方
12%分離膠(20 ml)
5%濃縮膠(10 ml)H2O6.6 ml6.8 ml
30%丙稀酰胺8.0 ml1.7 ml
Tris-HCl 5.0 ml(1.5 Μ, pH8. 8) 0.25 ml (1.0 Μ, pH6. 8)
10%SDS0.2 ml0.1 ml
10%APS0.2 ml0.1 ml
TEMED8 ul10 μ 1 5XTris-Gly 電泳緩沖液:Tris 堿 15. lg, Glycine 94g, 10% SDS 50ml，加 ddH20 至IL0轉(zhuǎn)移緩沖液=Tris 5. 8g，甘氨酸2. 9g，定容到800ml后加200ml甲醇，4°C預(yù)冷。
IXTBS =Tris 12. lg, Nacl 9g，用 IOOml 水溶后調(diào) pH 到 7. 4，定容到 IL0IXPBS =Na2HPO4. 12H20 1. 44g, KCl 0. 2g, NaCl 8. 0g, KH2P04 0. 24g。調(diào)節(jié) pH 至 7. 4，加ddH20定容至1L，120°C高壓蒸汽滅菌20min，備用。洗滌緩沖液(IXTBST)含0. 2% Tween-20 的 TBS0封閉緩沖液含5%脫脂奶粉的1XTBS。麗春紅染色液0. 5g麗春紅中加入Iml冰醋酸，溶解后再加入IOOml水。蛋白分離純化試劑裂解緩沖液加入少量的溶菌酶(終濃度為100mg/ml)和1 %的Triton-xlOO于 20ml IXPBS溶液中攪拌均勻，置于冰上待用(同上配方)；母液IMTris-CKpH 8. 0) 250ml (Tris 30. ^g，加入 HCl 約 Ilml 調(diào)節(jié) pH 值)，IM 咪唑 250ml (咪唑 17. 02g)，2M NaCl 500ml (NaCl 58. 5g)，0. 5M 甘油 200ml (100ml 的 H2O 中加入IOOrnl的丙三醇)；
之后一系列咪唑梯度的緩沖液(加入對(duì)應(yīng)母液后用ddH20補(bǔ)齊)
IOmM咪唑緩沖液200ml (10ml IM Tris-Cl, 2ml IM咪唑，30ml 2M NaCl，20ml 0. 5M
20mM咪唑緩沖液200ml (10ml IM Tris-Cl,4ml IM咪唑，30ml 2M NaCl，20ml 0. 5M
甘油)
甘油)；50mM 咪唑緩沖液 200ml (10ml IM Tris-Cl, 10ml IM 咪唑，30ml 2M NaCl，20ml 0.5M甘油)；IOOmM 咪唑緩沖液 200ml (10ml IM Tris-Cl, 20ml IM 咪唑，30ml 2M NaCl，20ml 0.5M甘油)；200mM 咪唑緩沖液 100ml (5ml IM Tris-Cl, 20ml IM 咪唑，15ml 2M NaCl, 10ml 0.5M甘油)；300mM 咪唑緩沖液 100ml (5ml IM Tris-Cl, 30ml IM 咪唑，15ml 2M NaCl, 10ml 0. 5M甘油)。2.方法2. Ip53基因的克隆以人肝cDNA為PCR反應(yīng)模板，擴(kuò)增p53基因的ORF。所用引物為T(mén)p53-A :5，_C CGA ATT CCC ATG GAG GAG CCG CAG TCA GAT CC-3，； (SEQ ID N01)Tp53-B :5，_AC GGA TCC TCA GTC TGA GTC AGG CCC TTC TGT C_3，(SEQ ID N02)。PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，62°C退火 30s，72°C延伸 1. 5min, 35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳，驗(yàn)證PCR擴(kuò)增結(jié)果。2. 2重組表達(dá)質(zhì)粒pET-3h_p53的構(gòu)建純化后的PCR產(chǎn)物及載體pET_32a，經(jīng)雙酶切后，用DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。從轉(zhuǎn)化的平板上挑取單克隆，抽提質(zhì)粒。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。篩選得到的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-32a-p53進(jìn)行測(cè)序鑒定。2. 3重組p53蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化重組表達(dá)質(zhì)粒pET_3h-p53轉(zhuǎn)化大腸桿菌后， 以1 50的菌量加入25個(gè)裝有5ml LB培養(yǎng)液的玻璃管中37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD = 0. 6時(shí)，分別改變誘導(dǎo)的溫度、IPTG濃度以及誘導(dǎo)的時(shí)間以摸索最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。在菌液中分別加入0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6mmol/L IPTG，在16°C和22°C這兩種不同的溫度下誘導(dǎo)
6表達(dá)，4h，8h，12h，16h和20h后分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。 小量誘導(dǎo)最佳條件得到后，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。離心6000rpm，5min/次來(lái)收集菌體。用配制的裂解緩沖液反復(fù)吹打溶解菌體，經(jīng)優(yōu)化的超聲破碎條件處理后離心12000rpm， 30min。得到的菌體上清置于冰上。預(yù)先用50%的Ni-NTA Slurry裝Iml柱，5倍柱體積的蒸餾水洗柱，而后用10倍柱體積的binding buffer平衡柱后，將離心得到的菌體上清過(guò)柱，收集流穿液。用不同咪唑濃度的洗滌液(分別是10mM，20mM，50mM)和洗脫液(lOOmM， 200mM, 300mM)進(jìn)行洗滌和洗脫，分步收集流出液，洗去非特異吸附的雜蛋白，收集特異性結(jié)合的目的蛋白。 各取等量的樣品進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳分析。電泳條件質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠。電壓80V，跑30min后換120V電壓，大約兩小時(shí)后電泳結(jié)
束?？捡R斯亮藍(lán)染色觀察結(jié)果。將收集得到的含單一條帶的蛋白樣品混合后放在半透膜中在透析液(1XPBS溶液，PH7.4)中4°C攪拌，每4- 更換一次透析液，透析Mh。次日吸出透析后的p53蛋白樣品混勻進(jìn)行蛋白定量并置于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?. 4目的蛋白Wfestern Blot檢測(cè)將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET_32a-p53菌體總蛋白及純化透析后的P53蛋白樣品一起進(jìn)行15%分離膠的SDS-PAGE電泳檢測(cè)。再將凝膠上的純化蛋白在轉(zhuǎn)移液中轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)鼠抗人P53單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的羊抗兔二抗各在37°C搖床上溫育lh，加顯色液室溫避光顯色5min，定影液中浸泡以終止反應(yīng)。2. 5蛋白定量(Bradford法)取適量體積的蛋白加入1. 5ml的印pendorf管中， 補(bǔ)加實(shí)驗(yàn)緩沖液至lOOul，加入Iml的Bradford工作液震蕩混勻，5分鐘后在UV3000分光光度儀上檢測(cè)A595。同時(shí)用BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，而后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白的濃度。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. PCR擴(kuò)增野生型的p53基因從cDNA文庫(kù)中，利用設(shè)計(jì)的特定引物擴(kuò)增p53基因。在大約1200bp處出現(xiàn)了一條特異性的DNA條帶。將PCR純化產(chǎn)物克隆到pCMV_Myc載體中構(gòu)建pCMV-p53載體。測(cè)序證實(shí)載體中克隆了 p53基因的0RF，全長(zhǎng)為1179bp。2.重組表達(dá)質(zhì)粒pET-3h_p53的構(gòu)建及鑒定P53cDNA與載體pET_3h進(jìn)行末端連接，轉(zhuǎn)化DH5 α，挑取克隆經(jīng)雙酶切后在1200bp左右處出現(xiàn)一條帶，由電泳結(jié)果初步判斷重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。電泳鑒定后的重組質(zhì)粒其測(cè)序結(jié)果與Gene Bank中報(bào)道的p53cDNA序列完全一致。3.重組p53蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化重組表達(dá)質(zhì)粒pET-3h_p53轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，以1 50的菌量加入25個(gè)裝有5ml LB培養(yǎng)液的玻璃管中37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD =0.6時(shí)，分別改變誘導(dǎo)的溫度、IPTG濃度以及誘導(dǎo)的時(shí)間以摸索最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。在菌液中分別加入0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6mmol/L IPTG，在16°C和22°C這兩種不同的溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，4h，8h，12h，16h和20h后分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。4.小量誘導(dǎo)后，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。收集得到菌體后，用配制的IXPBS緩沖液反復(fù)吹打溶解菌體，而后按照Ig菌體中加入6-8ml的裂解緩沖液進(jìn)行充分裂解。待裂解充分時(shí)(約30min)，可見(jiàn)菌體由絮狀變?yōu)檩^透明澄清的粘稠液體。而后進(jìn)行超聲破碎，超聲條件超聲ls，間隔3s，共超聲50次；超聲處理后菌體更加透明澄清并不再粘稠。離心 12000rpm，30min。將得到的菌體上清在4°C環(huán)境中與事先已平衡好的鎳柱緩慢旋轉(zhuǎn)孵育池。將此混合液過(guò)柱，收集流穿液用作樣品檢測(cè)。之后用不同咪唑濃度的洗滌液(分別是 IOmM, 20mM, 50mM)和洗脫液(lOOmM，200mM，300mM)進(jìn)行分級(jí)洗滌和洗脫，分步收集流出液， 待充分洗去非特異吸附的雜蛋白，收集特異性結(jié)合的目的蛋白。上述過(guò)程都需在冰上進(jìn)行， 并且需要實(shí)時(shí)用G250蛋白顯色液檢測(cè)流出液中蛋白的濃度分布情況。5.重組p53蛋白的Wfestern Blot鑒定將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET_32a-p53菌體總蛋白及純化以及透析后的P53蛋白樣品一起進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，并將凝膠上的純化蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上，而后用特異的P53抗體檢測(cè)蛋白的特異性。6.蛋白定量(Bradford法)在UV3000分光光度儀上檢測(cè)蛋白的A595，并作BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出目的蛋白的濃度約為180ng/ul。實(shí)施例2流式細(xì)胞儀測(cè)定p53重組蛋白對(duì)H1299腫瘤細(xì)胞凋亡的影響選用濃度為180ng/ul的p53重組蛋白誘導(dǎo)的H1299細(xì)胞，分別在12h、Mh、48h、 7 這四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，用IXPBS(pH7. 4)洗滌一遍，置于檸檬酸緩沖液Ih后，離心去掉上清。先后加入適量的胰酶消化液、胰酶抑制劑，并加入PI暗處染色15min后，待成單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)。經(jīng)P53重組蛋白作用四個(gè)時(shí)間梯度的H1299腫瘤細(xì)胞在流式細(xì)胞儀均能檢測(cè)到凋亡峰，相對(duì)對(duì)照組來(lái)說(shuō)凋亡率有極大的提高?？梢?jiàn)，隨著P53重組蛋白作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率明顯增加。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。實(shí)施例3利用BIAC0RE分子互作儀檢測(cè)純化得到的p53蛋白與小分子的互作BIAC0RE分子互作儀是基于表面等離子共振技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)跟蹤生物分子之間的相互作用。由于無(wú)需任何的標(biāo)記物，真實(shí)地反應(yīng)了生物分子間的各種作用，近年來(lái)得到了研究者的廣泛應(yīng)用。利用BIAC0RE分子互作儀來(lái)檢測(cè)p53重組蛋白與Hbx的相互作用。預(yù)先測(cè)定重組蛋白的濃度，達(dá)到一定的濃度要求時(shí)即可進(jìn)行蛋白耦連。用PH 4.0，4.5，5.0和5.5的醋酸鈉緩沖液分別將待分析的目的蛋白稀釋至50ug/ml，然后進(jìn)樣，使上述蛋白稀釋液先后流經(jīng)CM5傳感芯片表面。兩次進(jìn)樣之間用NaOH溶液來(lái)洗滌芯片表面，除去預(yù)吸附的蛋白質(zhì)。 記錄預(yù)吸附值最高的PH條件用其來(lái)進(jìn)行下一步的耦連實(shí)驗(yàn)。選用上述得到的最適PH的醋酸鈉溶液稀釋蛋白后，進(jìn)行蛋白耦連。而將Hbx耦連至GM5傳感芯片的第二、三通道上，第一通道用作對(duì)照表面。每個(gè)蛋白樣品重復(fù)兩次，進(jìn)樣流速需控制在40ul/min，進(jìn)樣體積為 50ul，溫度保持在20°C。最后在分析軟件中進(jìn)行曲線(xiàn)擬合及數(shù)據(jù)整合分析。實(shí)施例4利用生物發(fā)酵罐誘導(dǎo)菌體大量表達(dá)目的蛋白為了大量表達(dá)含有目的蛋白的菌體，使得實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更加高效，本發(fā)明利用生物發(fā)酵罐來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)大腸桿菌，并利用之前摸索出的最優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)方案來(lái)擴(kuò)大化培養(yǎng)菌體，以供今后大量純化目的蛋白P53使用。發(fā)酵罐不同于普通搖床誘導(dǎo)表達(dá)的主要特點(diǎn)在于第一、空間體積大，能一次性誘導(dǎo)表達(dá)IOL或50L的菌液；第二、由于其外接了很多管道，所以可以定時(shí)定量地加入IPTG并適時(shí)改變罐內(nèi)的溫度、壓強(qiáng)、空氣密度等等。第三、如有特殊需要，也可加入一些適量的添加物以達(dá)到最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)的目的。基于生物發(fā)酵罐上述的三個(gè)優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明可以廣泛利用發(fā)酵罐來(lái)進(jìn)行各類(lèi)菌體的誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)發(fā)酵罐大量誘導(dǎo)表達(dá)的P53菌體較之前的菌體菌齡更年輕、目的蛋白p53的表達(dá)更快，而且量也更多，并且大多在裂解后的上清中，這為今后表達(dá)純化P53蛋白提供了一條有利的線(xiàn)索。生物發(fā)酵罐不僅適用于大腸桿菌等原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)，而且在畢
8赤酵母等真核表達(dá)載體的大量誘導(dǎo)表達(dá)中也發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。由此可見(jiàn)，發(fā)酵罐將在從實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究逐步發(fā)展到產(chǎn)業(yè)化的過(guò)程中扮演重要的角色。
權(quán)利要求
1.一種野生型P53蛋白的分離純化方法，包括P53基因的克隆、構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化，其特征在于，基于原核系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解菌體，利用鎳柱親和層析來(lái)分離純化所得裂解上清中的P53蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒是將克隆獲得的P53基因PCR產(chǎn)物，經(jīng)雙酶切后，與原核載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再?gòu)霓D(zhuǎn)化的平板上挑取單克隆，抽提質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)表達(dá)是重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，加入LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后在菌液中加入0. 05-0. 6mmol/L IPTG，在16°C -22°C的溫度下誘導(dǎo)表達(dá)4_20小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的蛋白純化是預(yù)先用50% 的Ni-NTASlurry裝柱，5倍柱體積的蒸餾水洗柱，而后用10倍柱體積的binding buffer平衡柱后，將離心得到的菌體上清過(guò)柱，收集流穿液，然后用10mM-50mM濃度的咪唑洗滌液和 100mM-300mM洗脫液進(jìn)行洗滌和洗脫，分步收集流出液，洗去非特異吸附的雜蛋白，收集特異性結(jié)合的P53蛋白。
5.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的重組表達(dá)質(zhì)粒是 pET-32a-p53o
6.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的p53基因的克隆是以人肝 cDNA為模板PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得p53基因的DNA編碼序列。
7.如權(quán)利要求6所述的分離純化方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)退火溫度為62°C。
8.如權(quán)利要求6所述的分離純化方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)的引物序列為 Tp53-A 5' -C CGA ATT CCC ATG GAG GAG CCG CAG TCA GAT CC-3'禾口 Tp53_B 5' -AC GGA TCC TCAGTC TGA GTC AGG CCC TTC TGT C-3，。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥制品以及臨床檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域，主要涉及一種野生型p53蛋白分離純化的新方法。本發(fā)明的野生型p53蛋白的分離純化方法，包括p53基因的克隆、構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化，基于原核系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解菌體，利用鎳柱親和層析來(lái)分離純化所得裂解上清中的p53蛋白。本發(fā)明從原核系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解的菌體上清中利用鎳柱親和層析來(lái)分離純化得到較大濃度的活性目的蛋白。本發(fā)明中沒(méi)有進(jìn)行包涵體的變性和復(fù)性，而是直接從超聲裂解的上清中純化蛋白，使得目的蛋白的活性得到了最大程度的保持，并通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)以及純化方案使得目的蛋白的得率較之現(xiàn)有方法也有了較大的提高。
文檔編號(hào)C07K1/22GK102212525SQ20101014475
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者王佳 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)