專利名稱：新的β-肌動蛋白和RPS21啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)基因元件，如啟動子及其應(yīng)用，例如，在表達蛋白中的應(yīng)用。更特 別地，本發(fā)明涉及β-肌動蛋白和核糖體蛋白S21基因的啟動子。
背景技術(shù)：
每種真核基因含有驅(qū)動該基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件。該調(diào)節(jié)元件包括典型地直接位于 該基因編碼區(qū)上游的啟動子。作為轉(zhuǎn)錄機制的一部分，啟動子通過提供轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位 點來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。啟動子通常被用于在細胞培養(yǎng)中和體內(nèi)表達蛋白質(zhì)。很多啟動子是已知的 并被用于各種表達系統(tǒng)中表達蛋白質(zhì)。啟動子的例子包括巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動 子、勞氏肉瘤病毒基因組大基因組長末端重復(RSV)、猿病毒40(SV40)啟動子、干擾素基因 啟動子、金屬硫因啟動子、和胸腺嘧啶激酶啟動子及其它，如Fernandez等人(1999)在Gene ExpressionSystem, Academic Press中所描述的。然而，在本領(lǐng)仍需要提供一種可以產(chǎn)生 高表達水平和/或在長時間內(nèi)維持表達的啟動子。肌動蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，其通常在從原核到真核，包括人的所有物種中表 達。先前描述了人和雞的β-肌動蛋白啟動子。一般而言，β-肌動蛋白啟動子表現(xiàn)出比 廣泛被應(yīng)用的CMV啟動子更普遍的活性(Xu等(2001)Gene 272:149-156)。僅僅當其被連 接到CMV增強子序列時，雞的β-肌動蛋白啟動子比病毒CMV和SV40啟動子具有更高的 活性(Xu 等，supra)。核糖體蛋白S21(rpS21)與核糖體40S亞單位有關(guān)。人的rpS21基因的啟動子已 被鑒別(GenBank 接收號No. AJ250907)。與大多數(shù)核糖體啟動子基因相似，其缺少傳統(tǒng) 的轉(zhuǎn)錄元件，如 TATA 盒和 CAAT 序歹Ij (Smirnova 等(2000) Bioorg. Khim. 26 (5) :392_396)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的肌動蛋白啟動子，其與前述公知的肌動蛋白啟動 子相比具有低水平的序列同源性(如，人或雞)。本發(fā)明還提供了新的rpS21啟動子，其與 前述公知的rpS21啟動子相比具有低水平的序列同源性(如，人或小鼠)。本發(fā)明部分基于對中國倉鼠卵巢細胞(CHO)系來源的β-肌動蛋白和rpS21啟動 子的發(fā)現(xiàn)和分離。本發(fā)明進一步部分基于倉鼠肌動蛋白啟動子比CMV啟動子具有顯著 的高活性的觀察。本發(fā)明進一步部分基于當被用于表達一定基因時，rpS21啟動子至少具 有與倉鼠肌動蛋白啟動子相同的活性的觀察。本發(fā)明提供了這些啟動子的核酸序列，并包括具有啟動子活性的各種核酸序列的變種。在一些實施例中，本發(fā)明的肌動蛋白 啟動子來源于嚙齒類，如倉鼠、大鼠和小鼠。典型地rpS21啟動子來源于倉鼠。本發(fā)明進一步提供了含有可操作地連接到異源核酸上的本發(fā)明的肌動蛋白 或rpS21啟動子的載體。在某些實施例中，本發(fā)明的載體包括可操作地連接到異源核酸上 的啟動子，該異源核酸編碼異源表達產(chǎn)物，如治療蛋白質(zhì)或其片段。在示例性實施例中，表 達產(chǎn)物是酸性鞘磷脂酶(ASM)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、或組織血漿酶原激活劑(tPA)。本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。在描述性實施例中，宿主細胞 是哺乳動物細胞，如CHO、HEK和BHK。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法包括，例如，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染 細胞，該細胞用含有可操作地連接到編碼蛋白質(zhì)的異源核酸上的本發(fā)明的β-肌動蛋白啟 動子和/或rpS21啟動子的載體轉(zhuǎn)染的細胞，以及回收蛋白質(zhì)。在一些實施例中，異源表達 產(chǎn)物是分泌蛋白，其從培養(yǎng)基中被回收。在描述性實施例中，蛋白質(zhì)是六511、6六六、或1 八。本發(fā)明還涉及1. 一種選自SEQ ID NOs :1、2、3的核苷酸序列的分離的嚙齒動物β -肌動蛋白啟 動子或其具有啟動子活性的變種。2. 一種SEQ ID NO=I中列出的分離的倉鼠β _肌動蛋白啟動子核苷酸序列，或其 具有啟動子活性的變種。3. 一種SEQ ID NO :2中列出的分離的大鼠β -肌動蛋白啟動子核苷酸序列，或其 具有啟動子活性的變種。4. 一種SEQ ID NO :3中列出的分離的小鼠β -肌動蛋白啟動子核苷酸序列，或其 具有啟動子活性的變種。5. 一個包括SEQ ID NO 1中列出的核苷酸序列的分離的核酸，或其具有啟動子活 性的變種。6. 一個包括SEQ ID NO 2中列出的核苷酸序列的分離的核酸，或其具有啟動子活 性的變種。7. 一個載體，其包括SEQ ID NO 1中的啟動子，或其具有啟動子活性的變種。8. 一個載體，其包括SEQ ID NO 2中的啟動子，或其具有啟動子活性的變種。9. 一個載體，其包括SEQ ID NO 3中的啟動子，或其具有啟動子活性的變種。10.根據(jù)權(quán)利要求7-9的任何一項所述的載體，其中啟動子被可操作地連接到異 源核酸上。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體，其中異源核酸編碼治療性蛋白。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的載體，其中治療性蛋白選自酸性鞘磷脂酶、α -葡萄糖 苷酶或組織血漿酶原激活劑。13.用權(quán)利要求7-12的任何一項的所述的載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。14.根據(jù)權(quán)利要求13的宿主細胞，其中細胞是CHO細胞。15. 一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)培養(yǎng)用含有倉鼠肌動蛋白啟動子或其變種的載體轉(zhuǎn)染的細胞，該啟動子 或其變種被可操作地連接到編碼該蛋白質(zhì)的核酸上，和；(b)回收蛋白質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中蛋白質(zhì)是抗體。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中抗體結(jié)合TGF-β族成員。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中蛋白質(zhì)是治療性蛋白。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中治療性蛋白選自酸性鞘磷脂酶、α-葡萄糖 苷酶或組織血漿酶原激活劑。20.含有權(quán)利要求1-6的任何一項所述的啟動子的轉(zhuǎn)基因動物。 根據(jù)權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)基因動物，其中動物是哺乳動物。 具有SEQ ID NO :39的核苷酸序列的分離的rpS21啟動子，或其具有啟動子活21.22.
性的變種。 上。脂酶。
23.含有SEQIDNO :39的核苷酸序列或其具有啟動子活性的變種的載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的載體，其中核苷酸序列被可操作地連接到異源核酸
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的載體，其中異源核酸編碼治療性蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的載體，其中治療性蛋白是α-葡萄糖苷酶或酸性鞘磷
27.用權(quán)利要求23-26的任何一項所述的載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的宿主細胞，其中細胞是CHO細胞。
29.—種生產(chǎn)蛋白的方法，其包括
(a)培養(yǎng)用含有倉鼠rpS21啟動子或其變種的載體轉(zhuǎn)染的細胞，該啟動子或其變 種被可操作地連接到該編碼蛋白質(zhì)的核酸上，和； 回收蛋白質(zhì)。
根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中蛋白是抗體。 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中蛋白是治療性蛋白。 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中治療性蛋白是α -葡萄糖苷酶或酸性鞘磷
一種含有權(quán)利要求22所述的啟動子的轉(zhuǎn)基因動物。 根據(jù)權(quán)利要求33所述的轉(zhuǎn)基因動物，其中動物是哺乳動物。 一種分離的β “肌動蛋白啟動子，其核苷酸序列作為ATCC參考號ΡΤΑ-5309 被保藏，其分類命名為含有克隆到噬菌粒載體PBluescript II KS+的β-肌動蛋白啟 動子的倉鼠基因組克隆pBlueP-肌動蛋白/Avr(Hamster genomic clone containing β -actinpromoter cloned in phagemid vector pBlueScript II KS+:pBlueβ-actin/ Avr)，保藏單位為美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)， 保藏日為2003年7月3日。 36. 一種分離的rpS21啟動子，其核苷酸序列作為ATCC參考號_被保藏。(b)
30.
31.
32.脂酶。
33.
34.
35.


圖IA顯示了倉鼠β-肌動蛋白啟動子部分核苷酸序列(SEQ ID Ν0:1)與大鼠 β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO :2)的比對，顯示出SEQ IDNO :1中的核苷酸487-893與SEQ ID NO :2中的核苷酸1-417具有79%的同一性。大鼠β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO 2)與倉鼠β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO 1)的全長相比具有67%的同一性。圖IB顯示了倉鼠β-肌動蛋白啟動子部分核苷酸序列(SEQ ID Ν0:1)與大鼠 β -肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO 2)的比對，顯示出SEQ IDNO 1中的核苷酸1047-3006與 SEQ ID NO 2中的核苷酸546-2493具有83%的同一性。圖2Α顯示了倉鼠β-肌動蛋白啟動子部分核苷酸序列(SEQ ID Ν0:1)與小鼠 β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO 3)的比對，顯示出SEQ IDNO 1中的核苷酸33-487與SEQ ID NO :3中的核苷酸1-449具有84%的同一性。小鼠β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO 3) 與倉鼠β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO 1)的全長相比具有80%的同一性。圖2Β顯示了倉鼠β-肌動蛋白啟動子部分核苷酸序列(SEQ ID Ν0:1)與小鼠 β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO 3)的比對，顯示出SEQ IDNO :1中的核苷酸996-3006與 SEQ ID NO :1中的核苷酸921-2953具有83%的同一性。圖3顯示了倉鼠β-肌動蛋白啟動子部分核苷酸序列(SEQ ID Ν0:1)與倉鼠 β-肌動蛋白基因(GenBank 接收號No.U20114 ;SEQ ID NO 4)的比對，顯示出SEQ ID NO :1中的核苷酸1775-3006與SEQ ID NO :4中的核苷酸1-1232具有98%的同一性。倉 鼠β-肌動蛋白基因序列與倉鼠β-肌動蛋白啟動子序列(SEQ ID NO 1)的全長相比具 有40%的同一性。圖4顯示了倉鼠β-肌動蛋白啟動子部分核苷酸序列(SEQ ID Ν0:1)與在先已知 的人β-肌動蛋白啟動子(GenBank 接收號No. gi28337 ;SEQ ID NO 5)的比對，顯示出 SEQ ID NO 1中的核苷酸113-148與SEQ ID NO 5中的核苷酸38-73具有94%的同一性， SEQ ID NO :1中的核苷酸362-433與SEQ ID NO :5中的核苷酸303-374具有83%的同一 性，SEQ ID NO 1中的核苷酸1728-1764與SEQ ID NO 5中的核苷酸1791-1830具有90% 的同一性，SEQ ID NO 1中的核苷酸1797-1966與SEQ ID NO 5中的核苷酸1840-2007具 有91%的同一性。倉鼠β-肌動蛋白啟動子序列(SEQ ID NO 5)與人β-肌動蛋白啟動 子(SEQ IDNO=I)的全長相比具有10%的同一性。圖5顯示了倉鼠β-肌動蛋白啟動子核苷酸序列(SEQ ID Ν0:1)與先前已知的雞 β-肌動蛋白啟動子(GenBank 接收號No. gi217043 ;SEQ ID NO 6)的比對，顯示出SEQ ID NO 1中的核苷酸1878-1919與SEQ ID NO 6中的核苷酸186-227具有83%的同一性。 雞的β-肌動蛋白啟動子序列(SEQ ID NO 6)與倉鼠β-肌動蛋白啟動子(SEQIDN0 1)的 全長相比具有的同一性。圖6Α描述了 CHO-Kl細胞中的半乳糖結(jié)合蛋白、鐵蛋白和β -肌動蛋白的RNA斑 點印跡。mRNAs分別分離自放射菌素D處理后0、4、8、10和15小時后的細胞。圖6B描述了半乳糖結(jié)合蛋白、鐵蛋白和β-肌動蛋白的相對mRNA表達水平。 mRNAs分別分離自放射菌素D處理后的CHO-Kl細胞10、4、8、10和15小時后的細胞。圖7A描述了在CHO-Kl細胞中的瞬時轉(zhuǎn)染分析檢測下列啟動子的相對啟動子強 度CMV、人EF-1、倉鼠GAPDH、倉鼠rpS21和倉鼠β-肌動蛋白。在pDsRED_l質(zhì)粒中啟動子 分別被克隆到紅色熒光蛋白(RFP)基因的上游。用FACS檢測熒光。圖7B描述了在CHO-Kl細胞中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析檢測中下列啟動子的相對啟動子強 度CMV、人EF-1、倉鼠GAPDH、倉鼠rpS21_和倉鼠β-肌動蛋白。在pDsRED-Ι質(zhì)粒中分別 將啟動子被克隆到紅色熒光蛋白(RFP)基因的上游。用FACS檢測平均熒光。
圖8A描述了在來源于三個被含有可操作地連接到CMV啟動子或倉鼠β -肌動蛋 白啟動子上的ASM cDNA的載體轉(zhuǎn)染的CH0-DXB11細胞池的培養(yǎng)基中酸性鞘磷脂酶(ASM) 蛋白的表達。用分析ASM酶活性的分析方法分析ASM的表達。圖8B描述了在來源于三個被含有可操作地連接到CMV啟動子或倉鼠β -肌動蛋 白啟動子上的GAA cDNA的載體轉(zhuǎn)染的CH0-DXB11細胞池的培養(yǎng)基中α-葡萄糖苷酶(GAA) 蛋白的表達。用分析α-葡萄糖苷酶(GAA)蛋白酶活性的分析方法分析GAA的表達。圖9描述了在來源于被含有可操作地連接到倉鼠β-肌動蛋白啟動子上的tPA cDNA的載體轉(zhuǎn)染的CH0-DXB11細胞池的培養(yǎng)基中tPA蛋白的表達。用ELISA方法分析tPA 的表達。
具體實施例方式為了更容易地理解本發(fā)明，首先對術(shù)語進行定義。另外的定義在貫穿說明書的詳 細說明中列出。術(shù)語“啟動子”指調(diào)節(jié)元件，其指導與其可操作地連接的核酸的轉(zhuǎn)錄。啟動子可以 調(diào)節(jié)可操作地連接到其上的核酸的轉(zhuǎn)錄速率和效率。啟動子還可以被可操作地連接到其它 的調(diào)節(jié)元件上，其可增強(“增強子”)或抑制(“抑制子”)啟動子依賴的的核酸轉(zhuǎn)錄。術(shù) 語“可操作地連接”指處于與其它核酸有功能關(guān)系的位置的核酸。啟動子通常位于核酸轉(zhuǎn) 錄起始點的5’端(S卩，上游)。然而，啟動子可以包括轉(zhuǎn)錄起始點的3’端(S卩，下游)。啟 動子還可以包括可操作地連接的核酸的轉(zhuǎn)錄起始點的5’和3’端。術(shù)語“啟動子活性”指啟動子啟動與其可操作連接的核酸轉(zhuǎn)錄的能力?？梢詰?yīng)用 本領(lǐng)域公知的或?qū)嵤├忻枋龅姆椒z測啟動子活性。例如，可以通過測量被轉(zhuǎn)錄的mRNA 的量測量啟動子的活性，例如，RNA印跡或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。可供選擇地，可以通過測 量被翻譯的蛋白產(chǎn)物的量測量啟動子的活性，例如，蛋白印跡、ELISAjn Bradford分析 (Bradford(1976) Anal. Biochem. ,72 248)的色比色分析和各種活性分析，包括報告基因 分析和其他本領(lǐng)域公知的或?qū)嵤├忻枋龅姆椒?。術(shù)語“載體”指可以攜帶其他核酸的病毒或非病毒、原核或真核、脫氧核糖核酸、核 糖核酸或核酸類似物。載體可攜帶核酸進入被稱為“宿主細胞”的細胞，從而使核酸的全部 或部分被轉(zhuǎn)錄或表達。可供選擇地，載體可被用于體外轉(zhuǎn)錄分析中。載體通常來源于不同病 毒、細菌或哺乳動物基因元件的組合物裝配而成。載體含有各種包括編碼選擇性標記(如， 抗生素抗性基因)、有助于其在細菌中增殖的序列、或僅在某些細胞類型中表達的一個或多 個轉(zhuǎn)錄單位的編碼和非編碼序列。例如，哺乳動物表達載體通常即含有有助于載體在細菌 中增殖的原核序列，又含有僅在真核細胞中表達的一個或多個真核轉(zhuǎn)錄單位。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解載體的設(shè)計取決于如所選擇的被轉(zhuǎn)染的宿主細胞、所需的蛋白質(zhì)表達水平等 因素。載體包括例如，質(zhì)粒、噬菌粒和病毒載體。對于已具有啟動子的載體，可以使用本 領(lǐng)域熟知的標準重組DNA技術(shù)對載體進行修飾，從而用任何SEQ ID NOs :1、2、3或39或其變 種列出的啟動子序列取代已存在的啟動子序列，。一般而言，合適的載體或者可以選自商售 的那些，也可以應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的標準重組DNA技術(shù)構(gòu)建。(見，如Molecular Cloning =A Laboratory Manual :2n edition,Sambrook etal. , 1989,Cold Spring Harbor LaboratoryPress.)術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”指向細胞內(nèi)導入核酸。可以使用本領(lǐng)域熟知的方法或此處 描述的方法將核酸導入植物或動物細胞，或原核或真核細胞。術(shù)語“分離的”指使用不是自然發(fā)生的方式，從其他核酸序列中分離的脫氧核糖核 酸、核糖核酸、或多聚核苷酸的核酸類似物。分離的核酸包括使用本領(lǐng)域的標準技術(shù)部分或 全部化學地或重組地合成和/或純化的核酸。涉及啟動子的術(shù)語“變種”指如果變種具有啟動子活性，則與啟動子序列全長或其 互補鏈全長基本上具有同一性的核苷酸序列。只要其長度至少有1250個核苷酸β -肌動蛋白啟動子的變種可以與SEQ ID NOs 1、2或3的核苷酸序列同樣長、或短。只要其具啟動子活性rpS21啟動子的變種可以與SEQ ID NOs :39的核苷酸序列同樣長、或短。β-肌動蛋白啟動子的變種可以是自然發(fā)生的， 如從除人和雞以外的物種分離的自然發(fā)生的肌動蛋白，或人工生成的肌動蛋白啟 動子。當被最優(yōu)比對時，在SEQ ID NO 1序列的核苷酸1-3007的全長上，SEQ ID NO 1列 出的倉鼠β -肌動蛋白啟動子與其變種之間的同一性至少為45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、 70%、75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%。相似地， 在SEQID NO 2列出的序列的核苷酸1-2493的全長上，SEQ ID NO 2的大鼠β -肌動蛋白 啟動子與其變種之間的同一性至少為60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、或 99%。SEQ ID NO :3 序列的核苷酸 1-2953 的全長上，SEQ ID NO :3的小鼠3_肌動蛋白啟動子與其變種之間的同一性至少為55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。相似地，在 SEQ ID NO 39列出的序列的核苷酸1-1958的全長上，SEQ ID NO 39的倉鼠rpS21啟動子與其變種 之間在最優(yōu)比對時的同一性，至少為40%,50%,55%,60%,65%,70%,80%,90%,91%, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%。β _肌動蛋白啟動子的變種可以，例如，包括其他物種中的β _肌動蛋白啟動子的 同源物(orthologs)，其他物種包括嚙齒動物和其他哺乳動物，但除外人和雞β -肌動蛋白 啟動子及其已知的變種。本發(fā)明的啟動子的變種還可以在其他嚙齒動物中被發(fā)現(xiàn)，如豚鼠、 花白旱獺、麝鼠、沙鼠、松鼠、花栗鼠、土撥鼠、海貍、豪豬和野鼠。術(shù)語“變種”進一步包括具有啟動子活性的任何一個或多個本發(fā)明啟動子的片段。 β-肌動蛋白啟動子的變種具有至少1250核苷酸的長度。例如，可通過5’端切斷SEQ ID NO :1中列出的的倉鼠β -肌動蛋白啟動子的而衍生出本發(fā)明的β -肌動蛋白啟動子。在一 些實施方案中，β-肌動蛋白啟動子的變種包括SEQ ID NO :1的核苷酸50-3000、100-3000、 150-3000、200-3000、250-3000、500-3000、1000-3000、或 1500-3000 的序列。在另一些實施 例中，可通過5’端切斷SEQ ID NO :2中序列而衍生出β -肌動蛋白啟動子，例如包括SEQ ID NO 2 的核苷酸 50-2490、100-2490、150-2490、200-2490、250-2490、500-2490、或 1000-2490 的序列。還可通過5’端切斷SEQ ID NO :3中序列而衍生出β -肌動蛋白啟動子，其包括 例如，SEQ ID NO :3 的核苷酸50-2950、100-2950、150-2950、200-2950、250-2950、500-2950、 1000-2950或1500-2950的序列。例如，可以通過切斷SEQ ID NO :7中較長的倉鼠啟動子 核苷酸序列的5’端而衍生出倉鼠β-肌動蛋白啟動子的長片段。此種變種包括，如，核苷 酸 50-3668、100-3668、150-3668、200-3668、250-3668、500-3668 或 600-3668 的序列。
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可以通過5，和/或3，端的切斷SEQ ID NO :39的序列來衍生rpS21啟動子的變種。 此變種包括，例如，核苷酸 50-1958、100-1958、150-1958、200-1958、250-1958、500-1958、 1000-1958、1-1900、1-1850、1-1800、1-1750、1-1700、1-1600 或 1-1500 的序列。在某些實施方案中，本發(fā)明的β-肌動蛋白啟動子包括來自于SEQID NOs :1、2或3 的至少 1250、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2500 或 3000 個核苷酸的相鄰的分支。此SEQ ID NOs :1、2和3的相鄰分支還可以包括一個突變(插入 或缺失)，前提是突變序列保留了至少原始序列的一些功能以及在低、中等或高度嚴格的條 件下可以分別與SEQ ID NOs :1、2或3雜交的能力?？梢酝ㄟ^5’切斷SEQ ID NOs :1、2、3 或7或上述其變種的任何序列的而衍生出β-肌動蛋白啟動子的相鄰分支。在其他實施方案中，本發(fā)明的rpS21啟動子包括來自SEQ ID NO 39的至少500、 600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1850 或 1900 個核 苷酸的相鄰分支。本發(fā)明的β-肌動蛋白啟動子的變種進一步包括可以和SEQ IDNOs :1、2或3中所 示的β-肌動蛋白啟動子或其互補序列全長雜交的核苷酸序列，兩者具有最多0、1、2、3、4、 5、10、15、20、25、30、35、40、45%的堿基對錯配。本發(fā)明的rpS21啟動子序列包括可與SEQID NOs :39中所示的全長rpS21啟動子序列或其互補序列雜交的核苷酸序列，兩者具有最多0、 1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、45、50、55、60%的堿基對錯配。可使用本領(lǐng)域公知的或此處描 述的技術(shù)測定堿基對的錯配率。在此處用于修飾核酸的術(shù)語“異源的”是指除可操作地連 接到自然發(fā)生的基因組的啟動子核酸以外的核酸。例如，術(shù)語“異源的”指當此核酸被可操 作地連接到倉鼠肌動蛋白啟動子時，除倉鼠肌動蛋白基因以外的任何核酸。同樣 地，當此核酸被可操作地連接到大鼠β-肌動蛋白啟動子時，術(shù)語“異源的”指除大鼠β-肌 動蛋白基因以外的任何核酸。相似地，當此核酸被可操作地連接到小鼠肌動蛋白啟動 子時，術(shù)語“異源的”指任何核酸。類似地，當此核酸被可操作地連接到倉鼠rpS21啟動子 時，此術(shù)語可以指除倉鼠rpS21基因以外的任何核酸。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指含有基因操作細胞的任何動物，其中本發(fā)明的啟動子不再被可操 作地連接如天然發(fā)生的基因組中的相同的核酸上。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”包括，例如，含有具有整 合到動物染色體中的本發(fā)明的啟動子或其變種的細胞的動物。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”還包括含有 在染色體外具有由本發(fā)明的啟動子或其變種組成的復制的DNA序列的細胞的動物。轉(zhuǎn)基因 動物可以是如嚙齒動物或人的哺乳動物。本發(fā)明部分基于新的β-肌動蛋白和rpS21基因的啟動子的發(fā)現(xiàn)和分離。特別 地，本發(fā)明的特征為包括但不局限于倉鼠、大鼠和小鼠的嚙齒動物β-肌動蛋白啟動子，以 及倉鼠rpS21啟動子。如實施例中所描述的，本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)和證實本發(fā)明的β-肌動 蛋白啟動子具有高于CMV的啟動子活性的基礎(chǔ)上。本發(fā)明進一步基于當用于表達某些基因 時，倉鼠rpS21啟動子的活性至少與倉鼠β-肌動蛋白啟動子的活性相同的發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上。本發(fā)明提供了包括倉鼠、大鼠和小鼠的嚙齒動物β-肌動蛋白啟動子的核苷酸序 列，以及其應(yīng)用方法。本發(fā)明進一步提供了鑒別和分離本發(fā)明的啟動子變種的方法，包括具 有啟動子活性的啟動子的同源物或片段。另外，本發(fā)明提供了用于倉鼠rpS21啟動子的核 苷酸序列及其使用方法。在導致本發(fā)明的實驗中，倉鼠β-肌動蛋白啟動子的基因克隆被稱為基因表達的系列分析技術(shù)或 “SAGE”(Valculesco et al. (1995) Science，270 :484_487 和 Valculesco et al. (1987)Cell，88 =243-251)鑒定為活性啟動子在識別后從CHO細胞中分離出來。SAGE 技術(shù)可被用于整個基因組的轉(zhuǎn)錄圖譜中。使用SAGE技術(shù)，β-肌動蛋白啟動子被鑒定為是 CHO細胞中最具活性的啟動子之一。因此從CHO細胞中克隆β-肌動蛋白啟動子?？蓱?yīng)用 相似的方法從CHO細胞中克隆倉鼠rpS21啟動子。該方法可被用于其他基因組的轉(zhuǎn)錄圖 譜以確認在其他基因組中相應(yīng)的β-肌動蛋白啟動子或rpS21啟動子的活性。可使用本領(lǐng) 域公知的標準技術(shù)或此處描述的技術(shù)克隆這些啟動子。可以通過將其與一個或多個SEQID NOs :1、2、3或39列出的啟動子序列雜交的方法鑒別本發(fā)明的啟動子的變種。同源性每降低 1%，雙鏈核酸的熔點(Tm)就降低1-1. 5°C是公知的(見，如Bormer et al. (1973) J. Mol. Biol. ,81 :123)。因此，例如可以將公認的核苷酸序列與SEQ ID NOs :1、2、3或39或其變種 序列雜交，并將此雜化物的熔點和SEQ ID NOs :1、2、3或39或其變種序列與其互補序列的 雜化物的熔點相比較，從而鑒定物種間的同源性。然后可以計算待測雜化物的堿基對錯配 數(shù)。因此，待測雜化物的熔點與含有任何SEQ ID NOs :1、2、3或39的公認同源物的雜化物 的熔點的差別越小，表明公認的核苷酸序列與本發(fā)明的啟動子序列之間的同源性越大。例 如，在其他嚙齒動物如，豚鼠、花白旱獺、麝鼠、沙鼠、松鼠、花栗鼠、土撥鼠、海貍、豪豬和野 鼠中的變種可以表現(xiàn)為與本發(fā)明的啟動子及其變種具有更高的同源性。已知多種因子影響核酸雙鏈的雜交效率。其包括，例如，核酸序列的長度，鹽濃度 和序列的G/C含量。例如，為了雜交DNA的長片段，Howley et al. (1997) J. Biol. Chem.， 254 :4876，確定了使50% DNA與互補鏈雜交的熔點為Tm = 81. 5+16. 61ogM+41(% G+% C) -500/L-0. 62F,其中，M是單價陽離子的摩爾濃度；(%G+%C)是序列中G和C核苷酸各自的份額，L是雜合DNA的長度；
F是甲酰胺的摩爾濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以如 Ausubel et al. (1995) Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，的第2、4和6部分列舉的通過最少的實驗來選擇恰當?shù)碾s交 條件。另夕卜，嚴格的雜交條件在 Sambrooket al. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd ed.，Cold SpringHarbor Press，第 7、9 禾口 11 章中描述。低嚴格的雜交條件的非限制性的例子如下。含有DNA的濾紙在40°C下，在含有 35%甲酰胺、5父55(、501111111^8-!1(1化!17.5)、51111 EDTA, 0. 1% PVP.O. 1 % Ficoli U% BSA, 和500ug/ml變性的鮭魚精子DNA的溶液中預處理6小時。雜交在具有以下變動的相同的 溶液中進行0. 02% PVP,0. 02% Ficoli 、0. 2% BSAUOOug/ml 變性的鮭魚精子 DNA、10% (wt/vol)硫酸葡聚糖以及使用5-20X 10632P-標記的探針。濾紙在40°C下，在雜交混合液 中孵育 18-20 小時，然后在 55°C 的含 2XSSC、25mM Tris-HCl (pH7. 4)、5mM EDTA 禾Π 0. 1% SDS 的溶液中洗脫1.5小時。用新鮮溶液替換洗脫液并在60°C下繼續(xù)賦育1.5小時。吸干濾 紙，使其暴露于射線自顯儀。也可以使用本領(lǐng)域公知的其他的低嚴格條件(如，種間雜交所 用的)。一個高度嚴格的雜交條件的非限制性的示例如下所述。含有DNA的濾紙的預雜交 在含有6X SSC、50mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)、ImM EDTA.O. 02% PVP.O. 02% Ficoll ,0. 02% BSA和500ug/ml變性的鮭魚精子DNA的緩沖液中，在65°C處理8小時至過夜。濾紙在65°C下， 含有100ug/ml變性的鮭魚精子DNA和5-20X 106cpm的32P-標記的探針的雜交液中雜交48 小時。在37°C下，含有2X SSC、0. 01% PVP,0. 01% Ficoll 和0. 01% BSA的溶液中洗脫濾 紙1小時，之后在50°C，0. IXSSC溶液中洗脫45分鐘。一個中度嚴格的雜交條件的非限制性的例子包括在5X SSC.0. 5% SDSU. OmM EDTA，pH8. 0的溶液中預洗脫；在50%甲酰胺、6XSSC的溶液中42°C進行雜交；在0. 5X SSC、 0. 1% SDS的條件下，60°C進行洗脫。還可以通過公認變種的核苷酸序列和SEQ ID NOs :1、2、3或39中的序列或其互補 鏈間同一性的百分比鑒定本發(fā)明啟動子的變種。同一性百分比可以通過，例如，可見觀測或 本領(lǐng)域公知的或?qū)嵤├忻枋龅母鞣N計算機程序來確定。例如，可以通過使用Devereux等 (1984)Nucl. Acids. Res. , 12 387中描述的并從威斯康星州大學的基因計算機組(UffGCG) 中可獲得的GAP計算機程序比較序列信息來確定兩核苷酸序列的同一性百分比。還可以 通過使用如 Tatusove et al. (1999)FEMS Microbiol. Lett.，174 :247 中描述的 BLAST 程序(www.ncbi.nl m. nih. gov/BLAST)比對兩核苷酸序列以確定同一性百分比。例如，使 用BLAST 程序進行核苷酸序列比對時，默認參數(shù)設(shè)定如下匹配回報為2，不匹配懲罰 為-2，開口間隙和延伸間隙懲罰分別為5和2，間隙Xdropoff為50，預期值為10，字大小為 11，過濾器關(guān)閉。通過序列同一性鑒別的本發(fā)明的啟動子包括，例如，SEQ ID NOs 2和3序列分別 列出的大鼠和小鼠β-肌動蛋白啟動子的序列，顯示出與SEQ ID NOl列出的倉鼠β-肌動 蛋白啟動子序列的1-3007核苷酸相比具有67%和80%的同一性。應(yīng)用此處描述的和本領(lǐng) 域熟知的多種技術(shù)可以很容易地鑒別其他變種。可以通過所描述的方法確定倉鼠β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID Ν01)與已知的 β-肌動蛋白啟動子間的同一性百分比。例如，當用默認參數(shù)的BLAST 序列比對對SEQ ID NOl與人β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID Ν05)進行對比時，顯示出在SEQ ID NOl的全長 上僅有大約10%的同一性。相似地，當SEQ ID NOl與雞β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID Ν06) 對比時，顯示出在SEQ ID NOl的全長上僅有大約的同一性。由于同源性的水平如此 低，因此不認為人和雞的β-肌動蛋白啟動子是SEQ ID NOl列出的倉鼠β-肌動蛋白啟動 子的變種。而且，SEQ ID NOl的3’部分顯示出與倉鼠β _肌動蛋白基因序列的5’部分( Genbank 接收號No。U20114;SEQ ID NO 4)具有顯著的同源性。特別地，如圖3所示，SEQ ID NO 4的前1232個核苷酸顯示出與SEQ ID NOl的3，部分具有98%的同一性。此同一 性位于倉鼠β-肌動蛋白基因的第一內(nèi)含子區(qū)內(nèi)。整體上看，在SEQ ID NOl的全長上，SEQ ID NO 4僅顯示出40%的同源性。而且，SEQ ID NO 4或其片段并不具有啟動子活性。應(yīng)用具有默認參數(shù)的BLAST 序列比對發(fā)現(xiàn)在先前知道的人rpS21啟動子( Genbank 接收號No AJ250907的核苷酸1-2344)與SEQ ID N039的倉鼠rpS21啟動子的 核苷酸1-1958之間沒有同一性。在SEQ ID N039的倉鼠rpS21啟動子和跨越小鼠rpS21基 因的小鼠基因組DNA( Genbank 接收號No NT_039212)之間有很低的同一性。在小鼠的 序列中有兩個具同源性的區(qū)域。第一個是SEQ ID NO 39的核苷酸1775-1945 (172個核苷 酸中有137個相匹配)。第二個是SEQ ID NO 39的核苷酸580-851 (274個核苷酸中有208 個相匹配)。這兩個具同一性的區(qū)域在倉鼠序列(SEQ ID NO 39)中被923個核苷酸分開，在小鼠基因組序列(NT_039212)中被1745個核苷酸分開。在一些實施方案中，具有啟動子活性的分離的啟動子或其變種包括SEQ ID NO 39 中的核苷酸1775-1945和/或SEQ ID NO 39中的核苷酸580-851的核苷酸序列。可選擇 的，此啟動子或變種進一步包括從SEQ ID NO 39的全部或如核苷酸852-1774所示的部分 序列。SEQ ID NOs :1、2、3或39所示的核苷酸序列或其變種可用作探針以用于篩選基因 組庫的，以便分離與一個或多個SEQ ID NOs :1、2、3或39所示序列或其變種的基因組序列。根據(jù)本發(fā)明的啟動子或其變種被可操作地連接到被其所表達的異源核酸上。啟動 子既可單獨使用，也可以與其他調(diào)節(jié)元件，如增強子和抑制子聯(lián)合使用?？晒┻x擇地，此啟 動子可被整合到宿主細胞或動物的基因組上，從而在宿主細胞中表達內(nèi)源性基因。根據(jù)本 發(fā)明的啟動子可被用在表達異源核酸的載體中。在某些實施方案中，異源核酸編碼治療性 蛋白。治療性蛋白的例子包括，但不局限于α-葡萄糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、胰島素、組織血 漿酶原激活劑、促甲狀腺素α注射液刺激的激素(thyrogen stimulating hormon)、紅細 胞生成素、葡糖腦苷脂酶、α -半乳糖苷酶和各種抗體?？贵w的例子包括但不局限于結(jié)合如 TGF-β _1、2和3TGF-β族成員的抗體。本發(fā)明進一步提供了含有具有啟動子活性的本發(fā)明的啟動子或其變種的載體。在 一些實施方案中，本發(fā)明的載體包括位于啟動子下游的合適的限制性酶切位點，其可用于 插入異源的核酸。該限制性酶切位點可以包括用于一種限制性酶的一個限制性位點或其可 包括用于多種限制性酶的多個限制性位點，從而有助于插入多個不同異源的核酸。本發(fā)明 的載體還可以包括異源核酸插入點下游的一個多腺苷序列。含有本發(fā)明啟動子的載體還可 以含有用于細菌復制的原核DNA元件和用于載體在細菌細胞中生長和選擇的抗生素選擇 標記，以及一個控制轉(zhuǎn)錄過程的另外的DNA元件，如終止信號。載體可以進一步包含指導蛋 白質(zhì)向細胞外分泌的DNA序列。在某些實施方案中，含有本發(fā)明的啟動子序列的載體是雙順反子載體。設(shè)計成雙 順反子載體可以使兩個核酸被轉(zhuǎn)錄而生成一個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通常含有翻譯成一個 蛋白的第一部分和翻譯成另一個蛋白的第二部分。一個蛋白可以是興趣蛋白，如治療蛋 白，另一個蛋白可以被用作可供選擇的標記。雙順反子載體通常含有一個啟動子和一個內(nèi) 部的核糖體進入位點或位于兩個核酸間的IRES。這使得兩個核酸轉(zhuǎn)錄為一個雙順反mRNA。 在這種方式下，可將載體構(gòu)建成含有本發(fā)明的肌動蛋白啟動子或其變種和在兩個異源 核酸間的IRES。含有本發(fā)明的β -肌動蛋白啟動子或其變種的雙順反子載體可被用于表達 連接報告基因的治療蛋白，例如，酸性鞘磷脂酶或α-葡萄糖苷酶。本發(fā)明進一步提供了鑒定具有啟動子活性的本發(fā)明的肌動蛋白和rpS21啟動 子的變種的方法。例如，將本發(fā)明的啟動子或其變種插入合適載體的報告基因的上游，并且 報告基因的表達，擇確定啟動子活性的鑒定。例如，為鑒定本發(fā)明的具有啟動子活性的啟 動子變種，則將此變種克隆到報告基因的上游。報告基因可以編碼能催化產(chǎn)生視覺可辨別 信號的反應(yīng)的酶。此種信號基因的例子包括半乳糖苷酶和熒光素酶。其他信號基因 的例子包括堿性磷酸酶、胭脂堿合成酶、章魚堿合成酶、β “葡萄糖醛酸苷酶、氯霉素乙酰基 轉(zhuǎn)移酶(chloremphenicol acetyltransferase)。在下列實施例中，編碼?？?Discosoma striata)紅色熒光蛋白(RFP)的報告基因被用于檢測啟動子活性。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用任何適當?shù)膱蟾婊蚝头治黾夹g(shù)檢測啟動子活性。可以在體外表達系統(tǒng)或細胞內(nèi) (如體內(nèi))分析啟動子啟動的報告基因的表達。本發(fā)明進一步提供了被含有可操作地連接到異源基因的啟動子的本發(fā)明的載體 轉(zhuǎn)染的宿主細胞。此宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。宿主細胞可以是培養(yǎng)的，也可以 是動物中的細胞。培養(yǎng)的宿主細胞的例子包括，但不局限于Hela細胞、CHO細胞、NSO, HEK 細胞、BHK細胞、NIH-3T3、MDCK細胞和COS細胞。如實施例中所述的，培養(yǎng)中的宿主細胞可 以懸浮或在微載體中生長?？梢允褂迷S多恰當?shù)姆椒▽⒈景l(fā)明的核酸導入宿主細胞。含有本發(fā)明啟動子序列 的載體可以被導入原核或真核細胞。可以將核酸導入真核細胞的技術(shù)的例子包括，例如，磷 酸鈣沉淀、DEAE-右旋糖苷轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染、應(yīng)用病毒載體的轉(zhuǎn)導等?？梢杂迷S多恰當?shù)谋磉_系統(tǒng)來生成使用本發(fā)明的啟動子的蛋白質(zhì)。一個此種表 達系統(tǒng)應(yīng)用了二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，該基因被導入含有可操作地連接到異源核酸 的本發(fā)明啟動子或其變種的載體?？晒┻x擇地，如果使用DFHR缺陷細胞作表達，可將表達 DHFR的表達載體共同轉(zhuǎn)染到宿主細胞。當增加甲氨蝶呤(MTX)，一種主要的酶DHFR的競爭 性抑制劑的濃度被施加到轉(zhuǎn)染細胞時，僅僅具DHFR較高表達水平的細胞存活。進一步增加 MTX水平時，僅僅那些DHFR基因的拷貝數(shù)增幅的細胞存活。在這種方式下，通過增加含啟 動子的載體的拷貝數(shù)，可以增加異源核酸的表達，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。第二個表達系統(tǒng)使 用了谷氨酸合成酶(GS)基因，該基因被導入含有被可操作地連接到異源核酸的本發(fā)明的 啟動子或其變種的載體中。使用另外GS的競爭性抑制劑，如，硫代甲硫氨酸(methionine sulphoximine) (MSX)，以增加載體的拷貝數(shù)，實現(xiàn)增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。任何恰當?shù)脑嘶蛘婧吮磉_系統(tǒng)可被用來表達應(yīng)用本發(fā)明的啟動子蛋白質(zhì)。表達 系統(tǒng)的例子包括，但不局限于，植物、桿狀病毒、酵母、細菌、果蠅、哺乳動物或無細胞(cell free)表達系統(tǒng)。例如，在Ausubel (1995)，supra中提供了將表達載體導入哺乳動物、細菌、 酵母、昆蟲和植物細胞的標準方法。在某些實施方案中，本發(fā)明的啟動子及其變種被用于基因治療的方法中。例如，本 發(fā)明的啟動子及其變種被克隆到病毒或非病毒基因治療載體中，使其被可操縱的連接到興 趣基因上。當載體被運送到目的物，如人類病人時，啟動子啟動編碼治療蛋白的基因表達。以下實施例提供了本發(fā)明的說明性實施方案。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將意識到在 不改變本發(fā)明的主旨和范圍時，可進行多種修飾和改動。這些修飾和改動仍包括在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明。實施例以下描述了實施例中所用的物質(zhì)和方法A. CHO-Kl細胞的培養(yǎng)CHO-K 1 M Ifi JA American Type Culture Collection(Manassas, VA)(ATCC No. CRL-9618)獲得。在 250ml 含有 15g/L DE-52 微載體(Whatman，Kent, UK)、和 10%供 體小牛血清(DCS) (Invitrogen)的925細胞培養(yǎng)基中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)細胞。細胞在37°C下，使用 20-40% O2和5% CO2、并在大約60rpm下晃動6天。細胞在血清存在下生長后，每天用不含 血清的925培養(yǎng)基更換80% (ν/ν)培養(yǎng)基。細胞在不含血清的培養(yǎng)基中生長11天后從細 胞中提取RNA。為了確定mRNA的半衰期，將7mg/L的放射菌素D加入不含血清相中。
B. RNA的提取和分析使用Promega (Madison, WI)的 RNAgents 試劑盒從 CH0-K1 細胞中分離 RNA。 用RNA印記法分析基因表達。為進行RNA印記分析，應(yīng)用NorthernMax -Gly試劑盒 (Ambion, Ausein，TX)在變性的glycoxal/二甲基亞砜凝膠上電泳分離5ug RNA。而后將 RNA轉(zhuǎn)到尼龍膜上(Schleiche & Schuell，Dassel，德國)。用通過PCR擴增的下述基因 探針雜交斑點半乳糖結(jié)合蛋白(Genbank 接收號No.M96676，核苷酸14-383) ； β-肌 動蛋白(Genbank 接收號 No. U20114，核苷酸 238-381) ；EF-I ( Genbank 接收號 No. D00522，核苷酸 7-192) ；rpS21( Genbank 接收號 No. X79059，核苷酸 68-340)；鐵蛋白 (Genbank 接收號No. M99692，核苷酸182-303)或商業(yè)上可購得的甘油醛-3-磷酸脫氫 酶(GAPDH)片段(Ambion，Austin, TX)。使用隨機引物將每種PCR產(chǎn)物放射標記。用于擴 增每種基因的PCR引物在表一中列出。表權(quán)利要求
一種選自SEQ ID NOs1、2、3的核苷酸序列的分離的嚙齒動物β 肌動蛋白啟動子或其具有啟動子活性的變種。
2.—種SEQ ID NO :1中列出的分離的倉鼠β -肌動蛋白啟動子核苷酸序列，或其具有 啟動子活性的變種。
3.—種SEQ ID NO :2中列出的分離的大鼠β -肌動蛋白啟動子核苷酸序列，或其具有 啟動子活性的變種。
4.一種SEQ ID NO :3中列出的分離的小鼠β -肌動蛋白啟動子核苷酸序列，或其具有 啟動子活性的變種。
5.一個包括SEQ ID NO :1中列出的核苷酸序列的分離的核酸，或其具有啟動子活性的 變種。
6.一個包括SEQ ID NO :2中列出的核苷酸序列的分離的核酸，或其具有啟動子活性的 變種。
7.一個載體，其包括SEQ ID NO 1中的啟動子，或其具有啟動子活性的變種。
8.一個載體，其包括SEQ ID NO :2中的啟動子，或其具有啟動子活性的變種。
9.一個載體，其包括SEQ ID NO :3中的啟動子，或其具有啟動子活性的變種。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9的任何一項所述的載體，其中啟動子被可操作地連接到異源核酸上。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的β-肌動蛋白和核糖體蛋白S21(rpS21)啟動子的分離及應(yīng)用。特別地，本發(fā)明的特征為包括倉鼠、大鼠和小鼠的嚙齒動物β-肌動蛋白啟動子和倉鼠rpS21啟動子的序列。
文檔編號C07K14/47GK101942442SQ20101014561
公開日2011年1月12日 申請日期2004年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月24日
發(fā)明者S·D·埃斯蒂斯, W·張 申請人:建新公司