專利名稱：重組4A β 15在畢赤氏酵母中的高效分泌表達及純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組4Αβ 15在畢赤氏酵母中的高效分泌表達及純化方法。通過構建畢赤氏酵母重組工程菌株，使酵母高效分泌表達重組四價 A β 15，經(jīng)UNOsphere陰離子交換柱的一步純化可得到純度大于85%的重組四價A β 15。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進行性的記憶喪失、意識障礙 及人格變化為臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，也是最常見的一種老年癡呆。目前有 證據(jù)表明，β-淀粉樣蛋白(i3-amyloid，Ai3)沉積是AD病理的中心環(huán)節(jié)。因此，以Αβ為 靶的免疫治療方法成為AD研究的熱點。已有的研究表明A β 42全肽疫苗臨床試驗在防治 AD方面切實有效，但出現(xiàn)一些副反應而被終止。通過去除可能引起副反應的A β 42C末端序 列，并將ΑβΝ末端B細胞表位串聯(lián)形成多價Αβ疫苗，可達到有效且安全的免疫目的。四 價Αβ 15是4個Αβ42Ν端1_15氨基酸的串聯(lián)體，目前國內(nèi)生產(chǎn)的重組四價Aβ 15，主要是 大腸桿菌表達產(chǎn)物，其工藝缺陷是4Αβ 15基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)中為胞內(nèi)表達，表達 量低，且主要以包涵體形式存在。在生產(chǎn)的過程中，包涵體形式的蛋白質需要變性和復性， 純化困難，增加成本。而且為了便于純化，人們往往在4Αβ 15基因的下游帶有一個組氨酸 標簽序列，使得四價4Αβ 15在作為疫苗免疫人體的過程中可能產(chǎn)生一些非特異的抗體，從 而產(chǎn)生一些副作用。畢赤酵母(Picha pastoris)是最近迅速發(fā)展的一種真核表達宿主，營養(yǎng)要求不 高，適合于高密度發(fā)酵的大規(guī)模生產(chǎn)，尤其是以GAP為啟動子的畢赤氏酵母組成型表達體 系，表達外源蛋白時無需添加甲醇為碳源，可避免環(huán)境污染(甲醇是易揮發(fā)的有毒物質)和 減少下游產(chǎn)物純化的步驟。此外Picha. patoris可將表達產(chǎn)物分泌于細胞外，而且自身蛋 白的分泌卻很少，非常有利于下游的純化。目前國內(nèi)外未見采用以GAP為啟動子的畢赤氏 酵母表達體系表達重組四價A β 15的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組4Αβ 15在畢赤氏酵母中的高效分泌表達及純化方 法，是選用以GAP為啟動子的畢赤氏酵母組成型表達體系進行重組四價A β 15的表達，并且 通過在引物中引入XhoI酶切位點和XbaI酶切位點以及Kex2信號肽切割位點和終止密碼 子TCA，保證了酵母分泌表達的重組4Αβ 15的天然氨端和羧端。本發(fā)明所采用的技術原理是將4Αβ 15基因插入含有α -factor信號肽的組成型 酵母表達載體PGAPZ α A中，線性化后電擊導入畢赤氏酵母菌株GSl 15 (購自Invitrogen公 司)，經(jīng)搖瓶發(fā)酵獲得工程菌株該工程菌株于2010年1月29日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保 藏中心”，地址湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學，保藏登記號為CCTCCN0 :M2010034, 命名為6115Ζ20004Αβ 15，分類命名為畢赤氏酵母(Pichapastoris)，實現(xiàn)重組四價A β 15 在發(fā)酵上清中的分泌表達。收集發(fā)酵上清，用SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)有重組蛋白質的表達，其分子量為181((1，與四價4 0 15的理論值8KD不一致。Westernblot分析顯示重組蛋白能夠與Αβ 42抗體結合，具有免疫反應性。而且進一步采用基質輔助激光解吸附電離飛行時間 質譜分析測定了重組蛋白的分子量和N端的氨基酸序列。質譜結果顯示重組蛋白的分子量 為8KD，與理論值一致，N端的氨基酸序列亦與Αβ15Ν端的序列相同。重組蛋白被證實為 Αβ 15后，搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵上清經(jīng)UNOsphere陰離子交換柱的一步純化可得到純度大于85% 的重組四價A β 15。本發(fā)明所采用的技術方案一種重組4Αβ 15在畢赤氏酵母中的高效分泌表達及純化方法，其步驟如下1、4Αβ15基因的克隆以含有4Αβ 15基因的質粒ρ415為模板，設計引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)回 收后與PMD18T載體連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5 α，挑取單菌落進行測序，確定陽性克 隆。引物序列如下Pl :5，-CCG CTC GAG AAA AGA GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3，P2 5' -GC TCT AGA TCA TTG ATG ATG AAC TTC ATA-3，2、構建重組表達質粒對含有4Αβ 15基因的pMD18T載體進行XhoI和XbaI的雙酶切，回收小片段，同樣 用XhoI和XbaI酶切pGAPZ α A質粒，回收大片段，然后再用T4DNA連接酶連接，構建成含有 α -factor信號肽的組成型酵母表達載體pGAPZaA_4A0 15。3、篩選重組工程菌株將組成型酵母表達載體pGAPZaA_4Ai3 15經(jīng)AvrII酶切，然后采用電擊方式將酶切 產(chǎn)物轉化畢赤氏酵母GS115，將轉化液涂布含有Zeocin 25，50，100 μ g/mL的YPD平板，培養(yǎng) 后獲得抗性菌株，挑取ZeocinlOO μ g/mL抗性菌株進行PCR鑒定，選取陽性克隆即為工程菌 株，命名為 G115Z20004A3 15。4、搖瓶發(fā)酵將高表達的重組工程菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28°C _30°C培養(yǎng)48_96h，使畢 赤氏酵母GSl 15分泌表達4Αβ 15。對上述重組4Α β 15進行檢測(I)SDS-PAGE檢測收集發(fā)酵上清，用12% SDS-PAGE檢測發(fā)酵上清中重組4Α β 15 的表達。(2) Western blotting檢測將丙酮沉淀后，將發(fā)酵上清加樣進行12 %聚丙烯酰 凝膠電泳，然后用電轉移至硝酸纖維膜上，用BSA封閉硝酸纖維膜，然后依次加入一抗 (Α β 42抗體)和二抗(羊抗小鼠HRP標記IgG)，TBST洗滌5次，HRP-DAB底物顯色試劑盒 顯色。(3)質譜分析從考染凝膠上切下重組蛋白帶，送中山大學中山醫(yī)學院蛋白質組 中心進行基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析。5、重組四價A β 15的純化。離心收集分泌型4Α β 15重組酵母工程菌株G115Z20004Ai3 15的發(fā)酵上清，然后用 IN NaoH 調節(jié) pH 值至 7. 5-8. 5，載樣于 UNOsphere 陰離子交換柱(1ml，Biorad. America), 先用 5-10ml 20mmolTris. cl (pH7. 5-8. 5)平衡 UNOsphere 陰離子交換柱，然后用 0-lmol/L線性梯度的NaCl洗滌與交換柱結合的蛋白質，收集0.3-0. 4mol/L NaCl目標洗脫峰，得到 純度大于85%的重組四價Aβ 15。本發(fā)明利用以GAP為啟動子的畢赤氏酵母組成型表達體系進行重組四價Αβ 15的 表達，并且通過在引物中引入XhoI酶切位點和XbaI酶切位點以及Kex2信號肽切割位點和 終止密碼子TCA，保證了酵母分泌表達的重組4A β 15的天然氨端和羧端，大大提高工程菌 株發(fā)酵上清中目標蛋白的含量。



圖1是本發(fā)明的重組表達質粒pGAPZaA_4A β 15的構建圖。圖2是本發(fā)明的酵母轉化子的PCR的鑒定。1. DL-2000Marker ；2.宿主菌GS115 ； 3. GS115/pGAPZaA ；4.GS115/pGAPZaA_4Aβ 15。圖3是本發(fā)明的SDS-PAGE電泳圖譜。1.蛋白質分子量標準；2. GS115誘導表達96 小時上清；3. GS115/pGAPZaA誘導表達96小時上清；4_7. GS115/pGAPZaA_4A β 15誘導表達 24小時，48小時，72小時，96小時上清。圖 4 是本發(fā)明的 Western blotting 檢測。1、3. GS115/pGAPZaA_4A β 15 發(fā)酵上清； 2、4.GS115/pGAPZaA發(fā)酵上清；5.預染的蛋白質分子量。圖5是本發(fā)明的重組4A β 15的質譜分析。圖6是UNOsphere陰離子交換柱對發(fā)酵上清的純化。1.標準蛋白質分子量； 2. GS115/pGAPZaA-4A3 15 發(fā)酵上清；3.穿透鋒 4-8. NaCl 洗脫峰；7、8 為 0. 3mol/L NaCl 目 標洗脫峰，重組四價A β 15的純度為90%。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例一14Αβ 15基因的克隆與測序以本研究室前期構建的pQE4A β 15為模板，設計的特異引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn) 物經(jīng)瓊脂糖凝膠分析，大小為220bp左右，與理論值一致。產(chǎn)物回收后克隆到PMD18T載體， 送去上海生工進行序列測定，測序結果表明4A β 15基因已成功克隆到pMD18T載體中。引物 序列如下P1-5， CCG CTC GAG AAA AGA GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3’XhoI Lys-Arg (Kex2 位點)P2-5， GC TCT AGA TCA TTG ATG ATG AAC TTC ATA-3，XbaI2酵母組成型分泌表達載體的構建對含有4Αβ 15基因的pMD18T載體進行XhoI和XbaI的雙酶切，回收小片段，同樣 用XhoI和XbaI酶切pGAPZ α A質粒，回收大片段，然后再用T4DNA連接酶連接，連接后轉化 TOPlO菌株，獲得Zeocin抗性的轉化子，從轉化子中提取重組表達質粒，酶切鑒定和DNA序 列測定，證明重組表達質粒的構建完全正確。(載體構建如圖1)。3重組表達質粒電轉化畢赤氏酵母GSl 15
挑取畢赤氏酵母GS115單菌落，接種至YPD培養(yǎng)基，28°C_30°C至0D600達到1. 3 1. 5，離心收集菌體，用冰預冷的無菌水和lmol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀各洗滌兩次，最 后用ImL冰預冷的lmol/L的山梨醇溶液懸浮，制成感受態(tài)細胞。將10 μ g的經(jīng)AvrII線性 化的4Αβ 15基因與80 μ 1的感受態(tài)細胞混勻，在1300V，25 μ F，200 Ω條件下電擊轉化，用 ImL冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，在30°C孵育2小時，然后將菌液涂布于含有25，50， 100 μ g/mL zeocin 的 YPD 平板上，28°C _30°C培養(yǎng) 36 小時左右，結果在含 25，50，100 μ g/mL 分別得到40，32，20個抗性單菌落。4酵母陽性轉化子的PCR鑒定
挑取上述獲得的100 μ g/mL Zeocin抗性單菌落置于無菌水中，混勻，在微波爐中 加熱2分鐘，再置于-20°C冰箱中，冷凍5分鐘，重復此過程一次。離心后取上清液進行PCR， PCR反應條件按常規(guī)設置。引物序列如下pGAP forward primer :5，-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3，；3，-A0X1 primer :5，-GCAAAT GGCATTCTGACATCC-3，。(參見INVITR0GEN酵母手冊)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產(chǎn)物。結果 表明，以GS115基因組為模板的反應管中，沒有特異帶出現(xiàn)。在以GS115/pGAPZaA基因組 DNA為模板的反應管中，有約520bp的片段，是擴增自表達載體pGAPZaA本身的DNA片段。 而在以GS115/pGAPZa4Ai3 15基因組DNA為模板的管中有約740bp的DNA片斷出現(xiàn)，這表明 約220bp大小的4Αβ 15基因已整合到GS115的酵母基因組中。所得陽性克隆為重組工程 菌株 G115Z20004A β 15 (如圖 2)。5重組4Α β 15的檢測與鑒定5. 1 重組 4Α β 15 的 SDS-PAGE 分析挑陽性克隆單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，于28°C，250rpm/min培養(yǎng)；每24h取樣， 離心收集上清液，上清液用丙酮沉淀后進行12% SDS-PAGE分析，結果顯示在ISkD左右處產(chǎn) 生一條新的蛋白質條帶(見圖3)。5. 2 重組 4Αβ 15 的 Western blotting 鑒定將丙酮沉淀后上請加樣進行12%聚丙烯酰凝膠電泳，然后用電轉移至硝酸纖維 膜上，用BSA封閉硝酸纖維膜，然后依次加入一抗(Αβ42抗體)和二抗(羊抗小鼠 HRP標記IgG)，TBST洗滌5次，HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色。結果顯示在18KD左右處， 6115Ζ20004Αβ 15發(fā)酵上清有明顯的目的蛋白帶，而作為負對照的GS115/pGAPZaA發(fā)酵上 清則沒有特異帶的出現(xiàn)。這表明甲醇誘導表達的重組蛋白能夠與A β 42抗體結合，具有免 疫反應性(見圖4)。5. 3重組4Α β 15的質譜分析從考染凝膠上切下重組蛋白帶，送中山大學中山醫(yī)學院蛋白質組中心進行基 質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析。質譜結果顯示重組蛋白的分子量為8KD，與 4Αβ 15的分子量理論值一致，N端的氨基酸序列亦與4Αβ 15Ν端的序列相同，充分表明 6115Ζ20004Αβ 15發(fā)酵上清中的重組蛋白是4Αβ 15(見圖5)。6搖瓶發(fā)酵將高表達的重組工程菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28°C -30°C培養(yǎng)72h，使畢赤 氏酵母GSl 15分泌表達4A β 15。
7重組4A 3 15的純化離心收集分泌型4A0 15重組酵母工程菌株G115Z2OOO4A0 15的發(fā)酵72小時 上清，然后用IN NaoH調節(jié)pH值至8.0，載樣于UNOsphere陰離子交換柱(1ml，Biorad. America)，先用 5mL 20mmolTris. cl (pH8. 0)平衡UNOsphere 陰離子交換柱，然后用 0-lmol/ L線性梯度的NaCl洗滌與交換柱結合的蛋白質，收集0. 3mol/L NaCl目標洗脫峰，得到純度 為90 %的重組四價A 3 15 (如圖6)。實施例二1將實施例一獲得的高表達的重組工程菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28°C -30°C 培養(yǎng)48h，使畢赤氏酵母GS115分泌表達4A0 15。2、離心收集分泌型4A 0 15重組酵母工程菌株G115Z20004A 0 15的發(fā)酵48小時 上清，然后用IN NaoH調節(jié)pH值至7. 5，載樣于UNOsphere陰離子交換柱(1ml，Biorad. America)，先用 8mL 20mmolTris. cl (pH 7. 5)平衡 UNOsphere 陰離子交換柱，然后用 0-lmol/L線性梯度的NaCl洗滌與交換柱結合的蛋白質，收集0. 35mol/LNaCl目標洗脫峰， 得到純度為86%的重組四價A 0 15。實施例三1將實施例一獲得的高表達的重組工程菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28°C _30°C 培養(yǎng)96h，使畢赤氏酵母GS115分泌表達4A0 15。2、離心收集分泌型4A015重組酵母工程菌株G115Z2OOO4A015的發(fā)酵96小時 上清，然后用IN NaoH調節(jié)pH值至8. 5，載樣于UNOsphere陰離子交換柱(1ml，Biorad. America)，先用 10mL 20mmolTris. cl (pH 8. 5)平衡 UNOsphere 陰離子交換柱，然后用 0-0. 5mol/L線性梯度的NaCl洗滌與交換柱結合的蛋白質，收集0. 4mol/LNaCl目標洗脫峰， 得到純度為88%的重組四價A0 15。對上述實施例所得產(chǎn)物進行檢測，所得結果列表如下
權利要求
一種重組4Aβ15在畢赤氏酵母中的高效分泌表達及純化方法，其特征在于，其步驟如下1)、4Aβ15基因的克隆以含有4Aβ15基因的質粒p415為模板，設計引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)回收后與pMD18T載體連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落進行測序，確定陽性克??；引物序列如下P15’-CCG CTC GAG AAA AGA GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3’P25’-GC TCT AGA TCA TTG ATG ATG AAC TTC ATA-3’2)、構建重組表達質粒對含有4Aβ15基因的pMD18T載體進行XhoI和XbaI的雙酶切，回收小片段，同樣用XhoI和XbaI酶切pGAPZαA質粒，回收大片段，然后再用T4DNA連接酶連接，構建成含有α-factor信號肽的組成型酵母表達載體pGAPZaA-4Aβ15；3)、篩選重組工程菌株將組成型酵母表達載體pGAPZaA-4Aβ15經(jīng)AvrII酶切，然后采用電擊方式將酶切產(chǎn)物轉化畢赤氏酵母GS115，將轉化液涂布含有Zeocin 25，50，100μg/mL的YPD平板，培養(yǎng)后獲得抗性菌株，挑取Zeocin100μg/mL抗性菌株進行PCR鑒定，選取陽性克隆即為工程菌株，命名為G115Z20004Aβ15；4)、搖瓶發(fā)酵將高表達的重組工程菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28℃-30℃培養(yǎng)48-96h，使畢赤氏酵母GS115分泌表達4Aβ15；5)、重組四價Aβ15的純化離心收集分泌型4Aβ15重組酵母工程菌株G115Z20004Aβ15的發(fā)酵上清，然后用1N NaoH調節(jié)pH值至7.5-8.5，載樣于UNOsphere陰離子交換柱，先用5-10ml 20mmolTris.c平衡UNOsphere陰離子交換柱，然后用0-1mol/L線性梯度的NaCl洗滌與交換柱結合的蛋白質，收集0.3-0.4mol/L NaCl目標洗脫峰，得到純度大于85％的重組四價Aβ15。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組4Aβ15在畢赤氏酵母中的高效分泌表達及純化方法，是將4Aβ15基因插入含有α-factor信號肽的組成型酵母表達載體pGAPZαA中，經(jīng)電擊轉化畢赤氏酵母菌株GS115，在YPD平板上進行培養(yǎng)后獲得工程菌株G115Z20004Aβ15，經(jīng)搖瓶發(fā)酵，在發(fā)酵上清中有高含量的4Aβ15的表達，發(fā)酵上清經(jīng)UNOsphere陰離子交換柱的一步純化可得到純度大于85％的重組四價Aβ15。本發(fā)明利用以GAP為啟動子的畢赤氏酵母組成型表達體系進行重組四價Aβ15的表達，并且通過在引物中引入XhoI和XbaI酶切位點以及Kex2信號肽切割位點和終止密碼子TCA，保證了重組4Aβ15的天然氨端和羧端，大大提高工程菌株發(fā)酵上清中目標蛋白的含量。
文檔編號C07K14/47GK101864424SQ20101016316
公開日2010年10月20日 申請日期2010年4月11日 優(yōu)先權日2010年4月11日
發(fā)明者姚志彬, 譚琳 申請人:中山大學