專利名稱：富硒靈芝中硒蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
硒具有許多生物學(xué)功能，人體的低硒狀態(tài)及硒的營(yíng)養(yǎng)狀況與關(guān)節(jié)炎、癌癥、心血管 病、白內(nèi)障、膽汁郁積、克羅恩氏病、嬰兒猝死綜合癥、囊腫性纖維化、糖尿病、甲狀腺腫、免 疫缺陷、大骨節(jié)病、克山病、淋巴細(xì)胞性貧血、肌肉萎縮癥、中風(fēng)和潰瘍性結(jié)腸炎等40余種 疾病的發(fā)病率密切相關(guān)。而靈芝自古被譽(yù)為延年益壽之佳品，具有多種生物學(xué)功能(黃偉 光等，1993)，然而正常靈芝菌中有機(jī)硒含量較低，如果在富含無(wú)機(jī)硒的培養(yǎng)基中接入靈芝 菌種，利用靈芝菌的富硒能力將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，并使其富集較高含量的有機(jī)硒(控 制在人體安全吸收范圍內(nèi))，這種靈芝即為富硒靈芝，富硒靈芝融靈芝和有機(jī)硒之長(zhǎng)，其藥 用價(jià)值更高。因此開(kāi)發(fā)富硒靈芝將具有廣闊的應(yīng)用前景和極高的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益，其中富硒 靈芝中硒蛋白作為有效成分，被作為主要的研究對(duì)象，現(xiàn)有富硒靈芝中硒蛋白的制備方法 多是以富硒靈芝為原料，用堿提的方法得到堿溶性蛋白，然后對(duì)堿溶性蛋白進(jìn)行純化來(lái)制 備硒蛋白，但是該方法所得到的硒蛋白中硒含量?jī)H為3mg/g左右，且采用SDS-PAGE檢驗(yàn)硒 蛋白的純度，所得到的電泳圖不是單一條帶，純度較低，極大的限制了硒蛋白的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有方法得到的硒蛋白純度低的問(wèn)題，而提供了富硒靈 芝中硒蛋白的制備方法。本發(fā)明富硒靈芝中硒蛋白的制備方法按照以下步驟進(jìn)行一、l(Tl5g的富硒靈芝 子實(shí)體浸泡于去離子水中，在(Tl0°c的條件下攪拌7 10小時(shí)，然后抽濾得到濾液A，用去離 子水清洗抽濾后的殘?jiān)玫綖V液B，將濾液A和濾液B混合得到混合液，再向混合液中加入 醋酸至PH為4. (T4. 5，而后加入占混合液質(zhì)量百分比為20% 30%的硫酸銨，在3飛。C的條件 下靜置10 14小時(shí)，而后在450(T5500r/min的條件下離心15 25min去沉淀，然后向離心上 清液中加入占離心上清液質(zhì)量百分比為70% 90%的硫酸銨，在3飛。C的條件下靜置1(T14小 時(shí)，而后在450(T5500r/min的條件下離心15 25min，將離心后的沉淀加入10(T200mL濃度 為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，再經(jīng)過(guò)孔徑為0. 22 y m的微孔濾膜過(guò)濾 后，濾液用截留分子量為3000的膜進(jìn)行超濾過(guò)濾，重復(fù)超濾過(guò)濾4飛次得到蛋白質(zhì)溶液，蛋 白質(zhì)溶液再經(jīng)真空冷凍干燥，即得到富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白；二、廣10mg的富硒靈 芝子實(shí)體水溶性粗蛋白和lmL的濃度為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，然 后在1100(Tl300(k的條件下離心2(T30min，離心后的上清液經(jīng)孔徑為0. 22 y m的膜過(guò)濾 得到濾液；三、將2mL步驟二得到的濾液放入到葡聚糖凝膠柱中，在流速為lmL/min、檢測(cè)波 長(zhǎng)為280nm的條件下進(jìn)行洗脫，洗脫液是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液， 收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白I ；四、將2mL富硒靈 芝子實(shí)體水溶性粗蛋白I加入到陰離子交換層析柱中，然后在流速為lmL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下進(jìn)行線形梯度洗脫，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實(shí)體 水溶性粗蛋白II ；五、將2mL富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白II加入到疏水層析柱中，在流速 為0. 5^1. 5mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下進(jìn)行線性梯度洗脫，收集抗氧化活性的蛋白 洗脫液，即得到富硒靈芝中的硒蛋白。本發(fā)明以富硒靈芝子實(shí)體為原料，首先制備水溶性粗蛋白，并進(jìn)一步通過(guò)硫酸銨 沉淀蛋白、葡聚糖凝膠層析、陰離子交換層析、疏水層析對(duì)水溶性粗蛋白進(jìn)行純化，即制備 得到硒含量為6mg/g左右的硒蛋白，與現(xiàn)有方法制備得到的硒蛋白相比較，本發(fā)明方法制 備得到的硒蛋白中硒含量高，同時(shí)采用凝膠過(guò)濾法檢驗(yàn)本發(fā)明制備得到的硒蛋白的純度， 洗脫曲線呈現(xiàn)單一蛋白峰，本發(fā)明制備得到的硒蛋白純度好。


圖1為具體實(shí)施方式
十一得到的硒蛋白凝膠過(guò)濾層析圖，圖2中為具體實(shí)施方式
十一得到的硒蛋白對(duì)羥自由基(H0* )和超氧自由基(02-* )的清除活性的回歸方程曲線 圖，圖中■表示羥自由基的回歸方程曲線表亍超氧自由基的回歸方程曲。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的 任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式富硒靈芝中硒蛋白的制備方法按照以下步驟進(jìn)行 一、l(Tl5g的富硒靈芝子實(shí)體浸泡于去離子水中，在(T10°C的條件下攪拌7 10小時(shí)，然后 抽濾得到濾液A，用去離子水清洗抽濾后的殘?jiān)玫綖V液B，將濾液A和濾液B混合得到混 合液，再向混合液中加入醋酸至PH為4. (T4. 5，而后加入占混合液質(zhì)量百分比為209^30% 的硫酸銨，在3 5°C的條件下靜置10 14小時(shí)，而后在450(T5500r/min的條件下離心 15 25min去沉淀，然后向離心上清液中加入占離心上清液質(zhì)量百分比為70% 90%的硫酸 銨，在3 5°C的條件下靜置10 14小時(shí)，而后在450(T5500r/min的條件下離心15 25min，將 離心后的沉淀加入10(T200mL濃度為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，再經(jīng) 過(guò)孔徑為0. 22 y m的微孔濾膜過(guò)濾后，濾液用截留分子量為3000的膜進(jìn)行超濾過(guò)濾，重復(fù) 超濾過(guò)濾4飛次得到蛋白質(zhì)溶液，蛋白質(zhì)溶液再經(jīng)真空冷凍干燥，即得到富硒靈芝子實(shí)體 水溶性粗蛋白；二、廣10mg的富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白和lmL的濃度為0. 05mol/L、pH 為8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，然后在11000 13000穿的條件下離心2(T30min，離心后的 上清液經(jīng)孔徑為0. 22 pm的膜過(guò)濾得到濾液；三、將2mL步驟二得到的濾液放入到葡聚糖凝 膠柱中，在流速為lmL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下進(jìn)行洗脫，洗脫液是濃度為50mmol/ L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實(shí)體 水溶性粗蛋白I ；四、將2mL富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白I加入到陰離子交換層析柱中， 然后在流速為lmL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下進(jìn)行線形梯度洗脫，收集抗氧化活性的 蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白II ；五、將2mL富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗 蛋白II加入到疏水層析柱中，在流速為0. 5^1. 5mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下進(jìn)行線 性梯度洗脫，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝中的硒蛋白。本實(shí)施方式步驟一中富硒靈芝子實(shí)體由菌種培育得到，具體步驟如下在栽培料中，添加亞硒酸鈉，通過(guò)靈芝菌在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)無(wú)機(jī)硒的吸收，富集，然后轉(zhuǎn)化為含有機(jī)態(tài) 硒的生物富硒靈芝子實(shí)體。采集的富硒靈芝子實(shí)體，測(cè)定其含硒量為72. 44y g/g，用自來(lái)水 洗凈，雙重蒸餾水沖淋，切片，冷凍干燥粉碎制成實(shí)驗(yàn)樣品，冷凍保藏備用。本實(shí)施方式步驟一中攪拌采用電動(dòng)攪拌機(jī)進(jìn)行。本實(shí)施方式步驟三中葡聚糖凝膠柱在使用前用濃度為50mmol/L、pH為8. 0的 Tris - HC1緩沖液平衡后再使用，其中葡聚糖凝膠柱采用的是S印hadexG-75葡聚糖凝膠。本實(shí)施方式步驟四中陰離子交換層析柱在使用前用濃度為50mmol/L、pH為8. 0的 Tris-HCl緩沖液平衡后再使用，其中陰離子交換層析柱采用的是Mono-Q強(qiáng)陰離子交換樹(shù) 脂。本實(shí)施方式步驟五中疏水層析柱在使用前用濃度為50mmol/L的硫酸銨-Tris -HC1溶液平衡后使用，其中硫酸銨-Tris - HC1溶液中溶質(zhì)是濃度為0. 5mol/L硫酸銨，溶劑 是濃度為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，疏水層析柱采用的是PhenylSuperose 樹(shù)脂。本實(shí)施方式步驟三、步驟四、步驟五中收集含有抗氧化活性的蛋白洗脫液方法均 為用洗脫液洗脫時(shí)，每個(gè)試管3飛mL的洗脫液(含有蛋白的洗脫液)，測(cè)定每個(gè)蛋白峰在相 同濃度下的抗氧化活性，收集具有最高抗氧化活性的洗脫液，即得到了具有抗氧化活性的 硒蛋白。本實(shí)施方式步驟五中收集抗氧化活性的蛋白洗脫液可經(jīng)過(guò)進(jìn)一步濃縮或者干燥 得到硒蛋白固形物。對(duì)本實(shí)施方式制備得到的硒蛋白的結(jié)合離子進(jìn)行測(cè)定，具體內(nèi)容為用電感偶 合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-AES)(莫定琪等，1999年)測(cè)定了該硒蛋白中的硒(Se)、鉻 (Cr)、錳(Mn)、鐵(Fe)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鉀(K)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、鈷(Co)、鎳(Ni)、鋇(Ba)、 鍶(Sr)、鉬(Mo)、鍺(Ge)、砷(As)等16種元素的含量；檢測(cè)結(jié)果為在所測(cè)定的16種金屬元 素中，該硒蛋白只與硒元素(Se )結(jié)合，結(jié)合量為6mg/g左右。對(duì)本實(shí)施方式制備得到的硒蛋白進(jìn)行羥自由基(H0 )和超氧自由基(02_ ) 的清除活性測(cè)定，具體內(nèi)容如下采用順磁共振自旋捕集技術(shù)(EPR)檢測(cè)本實(shí)施方式 制備得到的硒蛋白的羥自由基和超氧自由基的清除活性，研究結(jié)果顯示，該硒蛋白具 有很強(qiáng)的H0*和02-*清除活性，清除率與硒蛋白之間存在劑量依賴關(guān)系。而且對(duì) 02_ 和的清除率與其濃度之間存在一定的對(duì)數(shù)回歸關(guān)系。對(duì)于H0 而言，該回 歸方程為Y=-0. 0001X2+0. 2187X - 1. 0420，R2=0. 9970 ；對(duì)于02- 而言，該回歸方程為 Y=-0. 0001X2+0. 2417X+0. 7317，R2=0. 9981。即，清除反應(yīng)體系產(chǎn)生的 50% 的 H0 和 02_ 需 要的該硒蛋白的濃度分別為264. 15 u g/mL和218. 03 u g/mL。本實(shí)施方式以富硒靈芝子實(shí)體為原料，首先制備水溶性粗蛋白，并進(jìn)一步通過(guò)硫 酸銨沉淀蛋白、葡聚糖凝膠層析、陰離子交換層析、疏水層析對(duì)水溶性粗進(jìn)行純化，即制備 得到硒含量為6mg/g左右的硒蛋白，現(xiàn)有方法制備得到的硒蛋白相比較，本實(shí)施方式制備 得到的硒蛋白中硒含量高，同時(shí)采用凝膠過(guò)濾層析檢驗(yàn)本實(shí)施方式制備得到的硒蛋白的純 度，洗脫曲線呈現(xiàn)單一蛋白峰，本實(shí)施方式制備得到的硒蛋白純度好。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中12 14g的富 硒靈芝子實(shí)體浸泡于去離子水中，在2 8°C的條件下攪拌8、小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中13g的富硒 靈芝子實(shí)體浸泡于去離子水中，在5°C的條件下攪拌8. 5小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施 方式一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是步驟一中占 混合液質(zhì)量百分比為25%的硫酸銨，在4°C的條件下靜置12小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體 實(shí)施方式一至三之一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是步驟一中向 離心上清液中加入占離心上清液質(zhì)量百分比為80%的硫酸銨，在4°C的條件下靜置12小時(shí)。 其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟一中重 復(fù)超濾過(guò)濾5次。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至六之一不同的是步驟一中冷 凍干燥條件為絕對(duì)氣壓為20Pa，冷阱溫度為_(kāi)55°C，樣品厚度為l(T24mm。其它步驟及參 數(shù)與具體實(shí)施方式
一六之一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至七之一不同的是步驟二中在 12000g的條件下離心25min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至七之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至八之一不同的是步驟四中線 性梯度洗脫時(shí)間為40min，洗脫液A是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，洗 脫液B是濃度為Imol/LNaCl-Tris - HC1溶液，線性梯度洗脫設(shè)定的程序?yàn)?9Tl00%B，其中 洗脫液B中NaCl為溶質(zhì)，濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液為溶液。其它步 驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至八之一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至九之一不同的是步驟五中線 性梯度洗脫時(shí)間為40min，洗脫液C是濃度為0. 5mol/L的硫酸銨Tris - HC1溶液，洗脫液D 是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，線性梯度設(shè)定的程序?yàn)?009T0%D，其 中洗脫液C中硫酸銨為溶質(zhì)，Tris - HC1緩沖液為溶液。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至九之一相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式富硒靈芝中硒蛋白的制備方法按照以下步驟進(jìn) 行一、10. 36g的富硒靈芝子實(shí)體浸泡于去離子水中，在5°C的條件下攪拌8小時(shí)，然后抽 濾得到濾液A，用去離子水清洗抽濾后的殘?jiān)玫綖V液B，將濾液A和濾液B混合得到混合 液，再向混合液中加入醋酸至PH為4. 3，而后加入占混合液質(zhì)量百分比為25%的硫酸銨，在 3 5°C的條件下靜置13小時(shí)，而后在5000r/min的條件下離心20min去沉淀，然后向離心 上清液中加入占離心上清液質(zhì)量百分比為80%的硫酸銨，在4°C的條件下靜置12小時(shí)，而 后在5000r/min的條件下離心20min，將離心后的沉淀加入150mL濃度為0. 05mol/L、pH為 8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，再經(jīng)過(guò)孔徑為0. 22 y m的微孔濾膜過(guò)濾后，濾液用截留分子 量為3000的膜進(jìn)行超濾過(guò)濾，重復(fù)超濾過(guò)濾5次得到蛋白質(zhì)溶液，蛋白質(zhì)溶液再經(jīng)真空冷 凍干燥，即得到富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白；二、8mg的富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白和 lmL的濃度為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，然后在1200Q§"的條件下離 心25min，離心后的上清液經(jīng)孔徑為0. 22 y m的膜過(guò)濾得到濾液；三、將2mL步驟二得到的濾液放入到葡聚糖凝膠柱中，在流速為lmL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下進(jìn)行洗脫，洗 脫液是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脫 液，即得到富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白I ；四、將2mL富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白I加 入到陰離子交換層析柱中，然后在流速為lmL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下進(jìn)行線形梯 度洗脫，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白II ’五、 將2mL富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白II加入到疏水層析柱中，在流速為lml/min、檢測(cè)波長(zhǎng) 為280nm的條件下進(jìn)行線性梯度洗脫，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈 芝中的硒蛋白。本實(shí)施方式步驟一中攪拌采用電動(dòng)攪拌機(jī)進(jìn)行。本實(shí)施方式步驟三中葡聚糖凝膠柱在使用前用濃度為50mmol/L、pH為8. 0的 Tris - HC1緩沖液平衡后再使用，其中葡聚糖凝膠柱采用的是S印hadexG-75葡聚糖凝膠。本實(shí)施方式步驟四中陰離子交換層析柱在使用前用濃度為50mmol/L、pH為8. 0的 Tris-HCl緩沖液平衡后再使用，其中陰離子交換層析柱采用的是Mono-Q強(qiáng)陰離子交換樹(shù) 脂。本實(shí)施方式步驟五中疏水層析柱在使用前用濃度為50mmol/L的硫酸銨-Tris -HC1溶液平衡后使用，其中硫酸銨-Tris - HC1溶液中溶質(zhì)是濃度為0. 5mol/L硫酸銨，溶劑 是濃度為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，疏水層析柱采用的是PhenylSuperose 樹(shù)脂。本實(shí)施方式步驟三、步驟四、步驟五中收集含有抗氧化活性的蛋白洗脫液方法均 為用洗脫液洗脫時(shí)，每個(gè)試管5mL的洗脫液(含有蛋白的洗脫液)，測(cè)定每個(gè)蛋白峰在相同 濃度下的抗氧化活性，收集具有最高抗氧化活性的洗脫液，即得到了含有抗氧化活性的洗 脫液。本實(shí)施方式步驟四中線性梯度洗脫時(shí)間為40min，洗脫液A是濃度為50mmol/L、 pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，洗脫液B是濃度為Imol/LNaCl-Tris - HC1溶液，線性梯度 洗脫設(shè)定的程序?yàn)?9Tl00%B，其中洗脫液B中NaCl為溶質(zhì)，濃度為50mmol/L、pH為8. 0的 Tris-HCl緩沖液為溶液。本實(shí)施方式步驟五中線性梯度洗脫時(shí)間為40min，洗脫液C是濃度為0. 5mol/L的 硫酸銨Tris - HC1溶液，洗脫液D是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，線性 梯度設(shè)定的程序?yàn)?009T0%D，其中洗脫液C中硫酸銨為溶質(zhì)，Tris - HC1緩沖液為溶液。采用凝膠過(guò)濾層析檢驗(yàn)本實(shí)施方式制備得到的硒蛋白的純度，檢測(cè)結(jié)果如圖1所 示，圖1中為單一蛋白峰，由此可知，本實(shí)施方式制備得到的硒蛋白純度好。對(duì)本實(shí)施方式制備得到的硒蛋白進(jìn)行結(jié)合離子測(cè)定和抗氧化活性測(cè)定，具體內(nèi)容 如下
1、結(jié)合離子測(cè)定用電感偶合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-AES)(莫定琪等，1999年)測(cè) 定了該硒蛋白中的硒(Se)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鐵(Fe)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鉀(K)、鈣(Ca)、鎂 (Mg)、鈷(Co)、鎳(Ni)、鋇(Ba)、鍶(Sr)、鉬(Mo)、鍺(Ge)、砷(As)等16種元素的含量；檢測(cè) 結(jié)果為在所測(cè)定的16種金屬元素中，該硒蛋白只與硒元素(Se)結(jié)合，結(jié)合量為5. 98mg/g。2、羥自由基(H0 )和超氧自由基(02- )的清除活性
具體操作為用Fenton體系產(chǎn)生H0 ，分別取5 u L0. 5mol/LDMP0,5 u L試樣或PBS (磷酸緩沖液)、5 y L4mmol/LDETAPAC(二乙三胺五乙酸)、5 y L0. lmmol/LFeS04混合均勻后，加 A 5 u L0. 0125%H202，120s后即刻采用EPR測(cè)量，中心磁場(chǎng)強(qiáng)度336. 5mT,響應(yīng)時(shí)間0. ls，調(diào) 制幅度0. 2mT,掃場(chǎng)寬度10. OmT,掃描時(shí)間2min，微波功率10. Omff,調(diào)制頻率9. 44GHz，試樣 對(duì)HO 的清除率如公式(2-3)所示 其中&-體系中加入試樣前EPR圖譜中第二個(gè)峰的峰高；
hx-體系中加入試樣后EPR圖譜中第二個(gè)峰的峰高。超氧陰離子(02_ )的產(chǎn)生和清除用次黃嘌呤(HPX)-黃嘌呤氧化酶(X0D)體 系產(chǎn)生(V (Finkelsteinete7.，1980；Gradyete7.，1989)，分別取 5ii LI. Omol/LDMPO、 5 u L6mmol/LHPX,5 u L4mmol/LDETAPAC 禾口 5 ii L i式樣或 PBS 混合均勾后，力口入 5 ii L50mU/ mLXOD, 80s后即刻采用EPR測(cè)量，中心磁場(chǎng)強(qiáng)度336. 3mT,響應(yīng)時(shí)間0. ls，調(diào)制幅度 0. 079mT,掃場(chǎng)寬度5. OmT,掃描時(shí)間2min,微波功率10. Omff,調(diào)制頻率9. 44GHz，試樣對(duì) 02_ 的清除率計(jì)算方法同上對(duì)H0 的清除率，不同的是和hx分別為體系加入試樣前后 EPR圖譜中第一個(gè)峰的峰高。檢測(cè)結(jié)果顯示，該硒蛋白具有很強(qiáng)的H0 和02_ 清除活性，清除率與硒蛋白之間 存在劑量依賴關(guān)系。而且對(duì)02_的清除率與其濃度之間存在一定的對(duì)數(shù)回歸關(guān) 系。對(duì)于H0 而言，該回歸方程為Y=-0. 0001X2+0. 2187X- 1. 0420，R2=0. 9970，如圖2所示； 對(duì)于02- 而言，該回歸方程為Y=-0. 0001X2+0. 2417X+0. 7317，R2=0. 9981，如圖2所示。即 清除反應(yīng)體系產(chǎn)生的50%的H0 和02_ 需要的該硒蛋白的濃度分別為264. 15 u g/mL和 218. 03y g/mL。
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權(quán)利要求
富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于富硒靈芝中硒蛋白的制備方法按照以下步驟進(jìn)行一、10~15g的富硒靈芝子實(shí)體浸泡于去離子水中，在0~10℃的條件下攪拌7~10小時(shí)，然后抽濾得到濾液A，用去離子水清洗抽濾后的殘?jiān)玫綖V液B，將濾液A和濾液B混合得到混合液，再向混合液中加入醋酸至pH為4.0~4.5，而后加入占混合液質(zhì)量百分比為20%~30%的硫酸銨，在3~5℃的條件下靜置10~14小時(shí)，而后在4500~5500r/min的條件下離心15~25min去沉淀，然后向離心上清液中加入占離心上清液質(zhì)量百分比為70%~90%的硫酸銨，在3~5℃的條件下靜置10~14小時(shí)，而后在4500~5500r/min的條件下離心15~25min，將離心后的沉淀加入100~200 mL濃度為0.05mol/L、pH 為8.0的 Tris–HCl緩沖液混合，再經(jīng)過(guò)孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，濾液用截留分子量為3000的膜進(jìn)行超濾過(guò)濾，重復(fù)超濾過(guò)濾4~6次得到蛋白質(zhì)溶液，蛋白質(zhì)溶液再經(jīng)真空冷凍干燥，即得到富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白；二、1~10mg的富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白和1mL的濃度為0.05mol/L、pH 為8.0的 Tris–HCl緩沖液混合，然后在11000~13000g的條件下離心20~30min，離心后的上清液經(jīng)孔徑為0.22μm的膜過(guò)濾得到濾液；三、將2mL步驟二得到的濾液放入到葡聚糖凝膠柱中，在流速為1 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm的條件下進(jìn)行洗脫，洗脫液是濃度為50mmol/L、pH為8.0的Tris–HCl緩沖液，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白Ⅰ；四、將2mL富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白Ⅰ加入到陰離子交換層析柱中，然后在流速為1mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下進(jìn)行線形梯度洗脫，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白Ⅱ；五、將2mL富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白Ⅱ加入到疏水層析柱中，在流速為0.5~1.5mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm的條件下進(jìn)行線性梯度洗脫，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝中的硒蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟一中12 14g 的富硒靈芝子實(shí)體浸泡于去離子水中，在2 8°C的條件下攪拌8、小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟一中占 混合液質(zhì)量百分比為25%的硫酸銨，在4°C的條件下靜置12小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟一中向離心 上清液中加入占離心上清液質(zhì)量百分比為80%的硫酸銨，在4°C的條件下靜置12小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟一中 重復(fù)超濾過(guò)濾5次。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟一中冷凍干 燥條件為絕對(duì)氣壓為20Pa，冷阱溫度為_(kāi)55°C，樣品厚度為l(T24mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或6所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟二 中在12000g的條件下離心25min。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟四中線性梯 度洗脫時(shí)間為40min，洗脫液A是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，洗脫液 B是濃度為Imol/LNaCl-Tris - HC1溶液，線性梯度洗脫設(shè)定的程序?yàn)?9Tl00%B，其中洗脫 液B中NaCl為溶質(zhì)，濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液為溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4、6或8所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步 驟五中線性梯度洗脫時(shí)間為40min，洗脫液C是濃度為0. 5mol/L的硫酸銨Tris - HC1溶 液，洗脫液D是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，線性梯度設(shè)定的程序?yàn)?009T0%D，其中洗脫液C中硫酸銨為溶質(zhì)，Tris - HC1緩沖液為溶液。
全文摘要
富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，它涉及一種蛋白質(zhì)的制備方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有方法得到的硒蛋白純度低的問(wèn)題。方法一、超濾、硫酸銨沉淀制備富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白；二、富硒靈芝子實(shí)體水溶性粗蛋白和Tris–HCl緩沖液混合，過(guò)濾；三、用葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離純化；四、用陰離子交換層析柱進(jìn)行分離純化；五、用疏水層析柱進(jìn)行分離純化即得到富硒靈芝中的硒蛋白。本發(fā)明制備得到硒蛋白中硒含量為6mg/g左右，與現(xiàn)有方法制備得到的硒蛋白相比較，本發(fā)明方法制備得到的硒蛋白中硒含量高，同時(shí)采用凝膠過(guò)濾法檢驗(yàn)本實(shí)施方式制備得到的硒蛋白的純度，洗脫曲線呈現(xiàn)單一蛋白峰，本發(fā)明制備得到的硒蛋白純度好。
文檔編號(hào)C07K1/20GK101851269SQ20101017911
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者杜明, 胡小松, 趙廣華 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)