專利名稱：一種控制植物花粉育性的pdf1基因及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種控制植物花粉育性的 PDFl基因，同時還涉及一種控制植物花粉育性的PDFl基因的制備方法，還涉及一種控制植 物花粉育性的PDFl基因的用途。
背景技術(shù)：
PDFl (protodermal factor 1)基因全長1. 421kp，存在于擬南芥第二條染色體上， PDFl基因編碼的306個氨基酸中有大約57個為脯氨酸，是一個富含脯氨酸的蛋白。通常 這種蛋白能夠形成一種特殊的四級結(jié)構(gòu)，與其他蛋白質(zhì)相互作用，從而起到調(diào)控作用。有報 道指出一些棉花的富含脯氨酸蛋白(proline-richproteins，PRPs)的表達(dá)具有發(fā)育階段 性和組織特異性，這些基因的表達(dá)也受到病原菌感染和外界環(huán)境因素的影響。它們的功能 被認(rèn)為與特定細(xì)胞的初級細(xì)胞壁的構(gòu)建有關(guān)，也可能在植物發(fā)育和防衛(wèi)中起作用(黃耿青 棉花GhPRP3、GhPRP4、GhPRP5、GhPRP6和GhPRPll基因克隆和表達(dá)分析華中師范大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版)2005，73)。同時，也有人發(fā)現(xiàn)水稻花發(fā)育相關(guān)基因RA68和OsUBPl也編碼富 含脯氨酸的蛋白，它們在分生組織中特異表達(dá)，在花發(fā)育過程中起作用(吳孝槐水稻花發(fā) 育相關(guān)基因RA68和OsUBPl的分離與功能分析中國科學(xué)院研究生院(植物研究所)2004論 文編號28887086)。但是關(guān)于PDFl基因的功能目前還沒有相關(guān)報道。細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)是指細(xì)胞主動的有序的死亡， 是一種生命現(xiàn)象，在高等植物中調(diào)節(jié)植物的發(fā)育，但對這種調(diào)控的機(jī)制了解甚少。植物 PCD的類型十分復(fù)雜，不同的PCD有不同的時期和獨特的調(diào)控因子和死亡形式。在植物當(dāng) 中，PCD是植物生命周期中從生到死的一個重要的發(fā)育程序(BeersEP. Programmed cell death during plant growth and development. Cell Death andDifferentiation, Vol 4,649-661,1997)。與動物細(xì)胞中發(fā)生的P⑶相同，植物的P⑶也往往發(fā)生在遇到病原物 (過敏性反應(yīng))禾口脅迫時(Pennell RI，Lamb C. Programmedcell death in plants. The Plant Cell 9，1157-1168，1997.)。幾乎所有的植物細(xì)胞的可見死亡都有著PCD的發(fā)生， 因此PCD很容易與其它的死亡形式相混淆。對細(xì)胞死亡方式的鑒定，以及找尋什么是細(xì)胞 死亡的決定因素，對明確PCD的發(fā)生是非常重要的(Lockshin RA,Zakeri Z. . Apoptosis, autophagy, and more. TheInternational Journal of Biochemistry and Cell Biology 36，2405-2419，2004)。目前的研究已經(jīng)獲得了 一些植物中細(xì)胞程序性死亡發(fā)生的證據(jù)。 例如，雖然沒有在擬南芥中發(fā)現(xiàn)Capases (動物種一種重要的PCD相關(guān)蛋白)，但是分離 出了 Caspase-Iike分子，在植物發(fā)生P⑶時這些分子發(fā)生了剪切(Warthmann N, Chen H, Ossowski S, Weigel D, HerveP. . Highly specific gene silencing by artificial miRNAsin rice. PLoS ONE. 3 :el829.，2008)；另外，植物中還發(fā)現(xiàn)了 DNA的剪切等一些和程 i^ti^EtW^WSia (Danon A,Delorme V,MaiIhac N,Gallois P. Plantprogrammed cell death -.a common way to die. Plant Physiology and Biochemistry 38，647—655. 2000)。 因此，植物細(xì)胞程序性死亡與動物有相似之處，但是也存在著不同。
3
植物的PCD至少分為三種類型自吞噬、AL-PCD(apoptotic_like PCD)和壞死 P⑶。在一些情況下，P⑶可以導(dǎo)致直接的細(xì)胞死亡的同時還會引起間接的非生理性的細(xì) 胞死亡一些細(xì)胞在P⑶時發(fā)生自發(fā)的死亡，而另一些細(xì)胞則是由于P⑶產(chǎn)生后導(dǎo)致的營 養(yǎng)物質(zhì)缺乏等原因?qū)е麻g接死亡(David L. Vaux, StanleyJ. Korsmeyer. Cell death in development. Cell, Vol. 96,245-254，1999)。DNA的降解和蛋白酶的啟動是大多數(shù)高等 植物發(fā)生POT的主要現(xiàn)象，而凋亡小體的產(chǎn)生(DNALaddering)并不是在所有組織中都能 夠看到。Caspase-like機(jī)制也在某些文獻(xiàn)中有報道，但是不足以解釋細(xì)胞凋亡的所有現(xiàn) 象。目前有兩種機(jī)制解釋植物PCD的產(chǎn)生，一種是液泡膜的崩裂機(jī)制，另一種為活性氧的 產(chǎn)生機(jī)制。對前一種機(jī)制還了解得很少，但是活性氧(AOS)的產(chǎn)生是非常普遍的現(xiàn)象。在 兩種不同的機(jī)制中，組織不兼容性和絨氈層的降解是通常認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)雄性不育的 一個原因(Hilary J. Rogers. Cell death and organ development in plants. Current topics indevelopmental biology. Vol. 71,2005)。在 2007 年對一種壁形野草 Brachiaria 研究中報道，典型的PCD現(xiàn)象在Brachiaria的種間雜交時后代的小孢子發(fā)生中，敗育的 花粉母細(xì)胞出現(xiàn)大量的胞膜起泡，細(xì)胞質(zhì)聚集在細(xì)胞周邊，細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)降解而最終 導(dǎo)致整個核的降解，細(xì)胞質(zhì)縮水，細(xì)胞死亡等現(xiàn)象(V. A. Fuzinatto, M. S. Pagliarini and C.B.Valle. Evidence of programmed cell death duringmicrosporogenesis in an interspecific Brachiaria hybrid. Genetics and MolecularResearch 6(2) :308_315, 2007)。雖然目前研究關(guān)于PCD導(dǎo)致的雄性不育有很多的報道，如MSl基因的突變體誘 導(dǎo)PCD的過早產(chǎn)生，導(dǎo)致絨氈層的液泡化，小孢子在四分體時期后的降解，最終產(chǎn)生沒有 生殖力的花粉(Zoe A. Wilson, Shaun Μ. Morrol 1, Janet Dawsonl Ranjan Swarup and Paddy J. Tighe. The Arabidopsis MALE STERILITY1(MSl) gene is a transcriptional regulator of male gametogenesis, with homology tothe PHDfinger family of transcription factorsThe plant journal. 28(1),27士39,2001)。MMDl(male meiocyte deathl)特異性地表達(dá)在小孢子減數(shù)分裂時期，它的突變體導(dǎo)致小孢子的死亡。mmdl突 變體的減數(shù)分裂細(xì)胞表現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，如染色體行為的異常，細(xì)胞質(zhì)收縮， 染色體出現(xiàn)片斷化，然后伴隨著細(xì)胞激酶的數(shù)量增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡(Xiaohui Yang, Christopher A. Makaroff, and Hong Ma. (2003). The ArabidopsisMALE MEIOCYTE DEATHlGene EncodesaPHD-Finger Protein That Is Required for Male Meiosis. The Plant Cell, Vol. 15，1281-1295，2003)。擬南芥 fbrl2 (fumonisin Bl-resistantl2)突變 體表現(xiàn)出植株生長和發(fā)育的缺陷，導(dǎo)致無生殖力的雌蕊和雄蕊細(xì)胞，小孢子出現(xiàn)非正常的 分裂和生長，這一基因的沉默導(dǎo)致PCD的異常發(fā)生。FBR12基因?qū)χ仓昙?xì)胞的分化、生長和 死亡起至丨J重要的調(diào)控作用(Haizhong Feng, Qingguo Chen, Jian Feng, JianZhang, Xiaohui Yang, and Jianru Zuo. . Functional Characterization of the ArabidopsisEukaryotic Translation Initiation Factor 5A_2 That Plays a Crucial Role in PlantGrowth and Development by Regulating Cell Division, Cell Growth, and Cell Death. Plant Physiology, Vol. 144，pp. 1531-1545. ,2007) 在水稻中，Yoshikazu Tanaka 等克隆到人 類的DADl的cDNA的同源基因。在水稻中的這個同源基因的突變體可以捕獲細(xì)胞凋亡導(dǎo)致 的死亡細(xì)胞，表明這個基因是程序性細(xì)胞死亡的一個抑制因子(Yoshikazu Tanaka,Tomoko Makishima, Michiko Sasabe, Yuki Ichinose, TomonoriShiraishi, Takeharu Nishimotoand Tetsuji Yamada. dad_l, A Putative Programmed CellDeath Suppressor Gene in Rice. Molecular biology. Vol. 38, No. 3 379-383,1997)。但是對 PCD 發(fā)生在小孢子形成過 程中導(dǎo)致的雄性不育機(jī)制還了解很少。有研究證明酵母0st2(for oligosaccharyltransferase-2)基因可以抑制倉鼠 細(xì)胞的PCD的發(fā)生，同時在擬南芥和水稻中的同源序列也具有相同的功能(Sugimoto，Α.， Hozak, R. R. , Nakashima, Τ. , Nishimoto, Τ. , and Rothman, J. H. Dad-I, anendogenous programmed cell death suppressor in Caenorhabditis elegans andvertebrates. EMBO J. 14,4434-4441,1995)，因此人們認(rèn)為0st2的同源基因也同樣參與了 PCD信號途徑，而 且這個途徑相對比較保守。但是至今在其他植物物種中還沒有發(fā)現(xiàn)參與PCD途徑的其他 基因。這可能是因為參加PCD的基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平較低，或者是這些參與PCD的基因的 保守性很差(Roger I. Pennell and Chris Lamb. Programmed Cell death in plants. The plant cell，Vol. 9，1157-1168. 1997)。PCD在控制育性和植株的生長發(fā)育中起作用。近年來，基于微RNA(microRNA，miRNA)作用原理而發(fā)展的人工微RNA (artificial miRNA, amiRNA)技術(shù)是一種新型的RNA干擾技術(shù)。它利用目標(biāo)基因的特定序列置換植 物miRNA的莖序列(一般為21-22nt)，構(gòu)建amiRNA表達(dá)載體來干擾目標(biāo)基因的表達(dá)。該 技術(shù)不僅能夠像傳統(tǒng)RNAi技術(shù)一樣同時干擾沉默所有目標(biāo)序列或基因，同時也可以精 確的干擾基因家族或者等位基因中的單個特殊目標(biāo)基因，具有高度的特異性和高效性， 克服了基因代謝補(bǔ)償作用，而且能夠克服傳統(tǒng)RNAi技術(shù)(效應(yīng)分子為小干擾RNA，small interfering RNA, si RNA)在實驗操作過程中出現(xiàn)的“脫靶”等問題(Ossowski S，Schwab R, Weigel D. Genesilencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs. Plant J. 53 =674-690.，2008)，有效的提高了基因干擾的效率。油菜作為中國主要的油料作物，在長江流域廣泛種植，對國計民生具有重要影響。 油菜雜種優(yōu)勢明顯，利用細(xì)胞核雄性不育配制雜種優(yōu)勢組合是雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。 目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)了多種類型的細(xì)胞核雄性不育材料，并在理論和應(yīng)用方面取得了重要進(jìn) 展，而新型不育源的發(fā)現(xiàn)和研究一直是雜種優(yōu)勢研究的基礎(chǔ)，并以此創(chuàng)造出更多的天然和 人工不育材料，為育種和生產(chǎn)所應(yīng)用。因此，本發(fā)明開發(fā)了一種與P⑶(細(xì)胞程序性死亡)和花粉育性相關(guān)的基因。通過 熒光定量PCR檢測該基因在可育植株的花藥中高量表達(dá)。通過應(yīng)用microRNA干擾手段抑 制此基因的表達(dá)水平。實驗結(jié)果證實，PDFl基因是一個新的TCD抑制因子，它的正確表達(dá) 保證了細(xì)胞的正常分裂、分化和生長；而抑制它的表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生異常的PCD，細(xì)胞核 提前降解，細(xì)胞發(fā)育受阻。在雄性生殖細(xì)胞中就表現(xiàn)為小孢子敗育。申請人的結(jié)果預(yù)示著 該基因及其同源序列在控制植物花粉育性，創(chuàng)造雄性不育轉(zhuǎn)基因新材料中具有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用 前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種控制植物花粉育性的PDFl基因，該基因?qū)χ仓?和細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程中的PCD過程具有抑制作用。通過抑制該基因的表達(dá)，促使小孢子在發(fā)育 早期提前發(fā)生PCD，導(dǎo)致花粉敗育，降低植物花粉的育性，從而獲得雄性不育植株，應(yīng)用于雜 交育種。
本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種控制植物花粉育性的PDFl基因(蕓薹屬 三個物種甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜中PDFl同源基因)的制備方法。根據(jù)本實驗室 進(jìn)行甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜基因組測序結(jié)果提供的基因片段序列信息，通過BLAST 比對擬南芥、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜的EST數(shù)據(jù)庫，獲得甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜 型油菜全長序列的電子克隆后，應(yīng)用簡單的PCR方法即可以獲得該基因的序列。甘藍(lán)PDFl 基因具有如SEQ. ID. No. 1所示的核苷酸序列和SEQ. ID. No. 4所示的氨基酸序列；甘藍(lán)型油 菜PDFl基因具有如SEQ. ID. No. 2所示的核苷酸序列和SEQ. ID. No. 5所示的氨基酸序列；白 菜型油菜PDFl基因具有如SEQ. ID. No. 3所示的核苷酸序列和SEQ. ID. No. 6所示的氨基酸 序列。以及上述DNA片段編碼的蛋白或經(jīng)過改造修飾的具有相同功能的蛋白。本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種控制植物花粉育性的PDFl基因在控制花 粉育性中的應(yīng)用。通過沉默該基因的表達(dá)，發(fā)明人可以人工創(chuàng)造雄性不育材料，在雜交育種 生產(chǎn)中應(yīng)用。PDFl基因是一種可以控制植物花粉發(fā)育、花藥育性的PCD(細(xì)胞程序性死亡) 抑制因子基因。PDFl通過調(diào)控細(xì)胞的PCD過程來控制植物花藥發(fā)育、花粉育性。采用轉(zhuǎn)基 因的方式，將構(gòu)建的該基因的人工微RNA干擾載體轉(zhuǎn)化擬南芥，可以獲得具有雄性不育表 型的轉(zhuǎn)基因擬南芥。本發(fā)明再有一個目的是在于提供了一種抑制植物細(xì)胞程序性死亡的PDFl基因作 為PCD(細(xì)胞程序性死亡)抑制因子的應(yīng)用。采用轉(zhuǎn)基因的方式，將構(gòu)建的該基因的人工微 RNA干擾載體轉(zhuǎn)化擬南芥，可以獲得具有矮化表型的轉(zhuǎn)基因擬南芥。為了完成上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為了獲得本發(fā)明，發(fā)明人對花粉發(fā)育過程中的相關(guān)基因進(jìn)行了深入和全面的研 究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個新基因，在可育植株的花藥中高效表達(dá)，而在不育植株中幾乎不表達(dá)， 因此該基因和植物花粉的育性調(diào)控有關(guān)。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炓沧C實了這一點抑制該基因的表達(dá) 會造成植物花藥發(fā)育異常，導(dǎo)致雄性不育。同時，在研究此基因控制花藥育性的分子生物學(xué) 機(jī)制時，申請人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該基因是一個PCD抑制因子。抑制該基因的表達(dá)，使小孢子提前 發(fā)生PCD，導(dǎo)致花藥敗育，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)小孢子敗育的表型。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，上述目的可以通過提供植物花藥高效表達(dá)基因以及蕓薹 屬同源基因來實現(xiàn)，所述基因含有SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3核苷酸序列或 與它們實質(zhì)上同源的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供植物花藥高效表達(dá)蛋白以及蕓 薹屬同源蛋白來實現(xiàn)，所述蛋白含有SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5、SEQ IDNo. 6氨基酸序列或 與它們實質(zhì)上同源的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的通過提供含有PDFl基因靶標(biāo) (AATUTUTATATUUTGTUGAG)序列的人工微RNA干擾重組載體(micro-PDFl)來實現(xiàn)對植物體 中PDFl基因表達(dá)量的抑制。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體(micro-PDFl) 轉(zhuǎn)化的微生物(根癌農(nóng)桿菌EHA105，購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)來實現(xiàn) 對擬南芥以及其他植物的轉(zhuǎn)化，從而抑制擬南芥以及其他植物中PDFl基因的表達(dá)量。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述微生物(包含有 micro-PDFl重組載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物來實現(xiàn)對花藥育性的調(diào)控，獲得雄性不育轉(zhuǎn)基因植株。甘藍(lán)PDFl (BoPDFl)，甘藍(lán)型油菜PDFl (BnPDFl)和白菜型油菜PDFl (BrPDFl)三個 同源基因的研究，一種控制植物花粉育性的PDFl基因，其步驟是1、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜PDFl同源基因的克隆在液氮中分別將甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜幼嫩葉片樣品研磨至粉狀，利用 Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，以下相同)的要求進(jìn)行總RNA的提取。提取 的總RNA溶于無RNase的雙蒸水中。DNase I (購自Promega公司，以下相同)去除可能殘 留的DNA。用紫外檢測儀(DU 650BECKMAN,USA)分別檢測RNA在260納米和280納米光吸 收值，結(jié)合(質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為 模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，購自Promega公司，以下相同)的要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn) 錄，得到的eDNA分裝后于_20°C保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中擬南芥PDFl基因序列(gi =4929130)，在NCBI網(wǎng)站上用 BLASTN(http://www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)與本實驗室測序獲得的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜 和白菜型油菜基因片段序列進(jìn)行比對，分別獲得與擬南芥PDFl基因序列5'端同源的甘 藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜的⑶S(Coding sequence，編碼序列，以下相同)序列以及和擬 南芥PDFl基因序列3'端同源的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜的CDS序列。然后根據(jù)獲 得的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜PDFl基因的CDS序列與擬南芥PDFl基因起始密碼子和 終止密碼子同源區(qū)域設(shè)計引物(引物序列見表一)，從而確保擴(kuò)增產(chǎn)物為全長序列。以根 據(jù)前面所述得到的各甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜葉片cDNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；?收并純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，連接到pMDIS-T載體上(購自Promega公司，以下相同)，用凍 融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三 版)科學(xué)出版社，96-99)，涂布于含有氨芐青霉素50 μ g/mL的LB固體(配方如下分別稱 取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于 1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X104Pa下高壓消毒15分鐘。4°C冷 藏備用)平板上，37°C培養(yǎng)過夜，各挑選白斑三個，做菌落PCR檢測所用引物序列為M13F 5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 ；M13R 5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，以下相同)，反應(yīng)體 系為=IOXTaq 酶反應(yīng)緩沖液 2ul、25mMMgCL2l. 2ul、2mM dNTP 1. 5ul、10uM 引物 0. 2ul、0. 3 單位Taq酶，加無菌水至20 μ 1。反應(yīng)程序為94°C變性5min，94°C 45s、55°C 45s、72°C 2min 32循環(huán)，72°C延伸5min (以下相同)。以M13F/M13R為引物(前面已述)，將連接過的pMD18T 載體進(jìn)行序列測定，分析結(jié)果，獲得了蕓薹屬三個物種分離的(甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型 油菜)PDFl基因全長序列，S卩一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID No. 1所示的核苷酸序 列；一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列；一種分離的蛋白質(zhì)，其序 列為SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 5所示的氨基 酸序列；一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ IDNo. 3所示的核苷酸序列；一種分離的多肽，其 序列為SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列。根據(jù)獲得的上述氨基酸序列(SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2,SEQ IDNo. 3)設(shè)計的 PDFl 基因人工微 RNA 靴標(biāo)序列(AATUTUTATATUUTGTUGAG)，通 過構(gòu)建micro-PDFl植物表達(dá)重組載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，申請人獲得63株具有雄性不育表型的 轉(zhuǎn)基因擬南芥，同時這些轉(zhuǎn)基因植株還具有矮化的表型，轉(zhuǎn)基因植株的高度只有同時期野 生型高度的50-80%左右。說明PDFl基因具有控制植物花藥育性和株高的功能。
將經(jīng)過測序獲得的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜的序列，與NCBI上擬南芥PDFl 基因序列進(jìn)行Blast比對。證實經(jīng)過測序獲得了甘藍(lán)PDFl基因的全長⑶S序列，長度為 1209bp，命名為SEQ ID No. 1 ；獲得了甘藍(lán)型油菜PDFl基因的全長CDS序列，長度為1299bp， 命名為SEQID No. 2 ；獲得了白菜型油菜PDFl基因的全長⑶S序列，長度為1335bp，命名為 SEQ ID No. 3。圖1顯示的是通過PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物的電泳圖，所獲產(chǎn)物電泳條帶都是1. Okb 左右，符合預(yù)期。利用NCBI的開放閱讀框?qū)ふ页绦?ORF founder)確定PDFl基因的開放閱讀框， 推導(dǎo)出蛋白質(zhì)序列編碼的氨基酸，獲得甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜PDFl蛋白序列，分 別命名為 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6。分別利在線基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)(GeneStructure Display Server,GSDS, http:// Rsds. cbi. puk. edu. en/Chinese, php)對擬南芥、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜PDFl的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行比 較；利用TCoffee在線軟件(http://www. tcoffee. org/)對擬南芥、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、白菜 型油菜PDFl基因的組織定位序列進(jìn)行比較；應(yīng)用SOPMA對上述四個物種PDFl基因編碼蛋 白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測、在線軟件 ProtScale (http://www, expasy. ch/tools/protscale. html)對各蛋白序列進(jìn)行親疏水性分析、TMHMM在線軟件(http //www. cbs. dtu. dk/ services/TMHMM/)對四個PDFl蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析。根據(jù)上述分析和比較，證 實本發(fā)明獲得的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜的序列確實是擬南芥PDFl的同源基因。將 獲得的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜的PDFl同源基因分別命名為BoPDFl，BnPDFl和 BrPDFl。2、油菜BnPDFl基因的表達(dá)模式本發(fā)明所用油菜為甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)顯性核不育雜合不育系 J03AB (原名803AB) (Msmsrfrf^msmsrfrf)。系經(jīng)多年回交和姐妹交而育成，其中可育株代 號為J03B，不育株代號為J03A(以下相同)。二者可視為一對近等基因系，僅存在不育位點 差異。(胡勝武，于澄宇，趙惠賢，路明，油菜顯性核不育材料Shaan-GMS純合兩型系803AB 的選育。西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，ii (4) :25-2)。供試材料播種于大田，正常田間管理。從同一大田生長條件相同的可育植株上取根、莖、葉、花蕾、角果，從花蕾中解剖分 離雌蕊和花藥，每種材料至少取三個重復(fù)，每個重復(fù)至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速 放置于液氮中，-80°C保存。利用Trirol提取試劑盒(前面已述)的要求進(jìn)行RNA的提取。 在大田分別從油菜可育植株和不育植株上取花蕾，帶回實驗室后，在冰盒上分別挑取可育 植株和不育植株花蕾中的花藥和雌蕊，每種材料至少取三個重復(fù)，每個重復(fù)至少一株，取樣 后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，-80°C保存。利用Trirol提取試劑盒(前面已述)的 要求進(jìn)行RNA的提取。熒光定量PCR儀為RTTM-Cycler (博奧)，采用油菜Actin作為內(nèi)標(biāo)基 因(登錄號 AFl 11812)，Actin 基因引物為 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘ 禾口 5 ‘ -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG -3 ‘ 。 BnPDFl 基因 引物為 5 ‘ -AACAAGGCTAATGAGGGAGTCTG-3 '和 5 ‘ -TCCAAAGCGTAGTCAGGATAGG-3 ‘。熒光定量 PCR 反應(yīng)每組實驗均完成三個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)至少做三次技術(shù)重復(fù)。分別檢測 BnPABP5在油菜組織(根、莖、葉、花、角果、花藥、雌蕊)中的表達(dá)(以下相同)。用比較Ct法(Δ ACt)計算基因的相對表達(dá)量。通過2_ΔΔ"估算目的基因的相對表達(dá)量禾口系統(tǒng)誤差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001,Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time QuantitativePCR and the 2_Δ ΔεΤ Method. METHODS 25,402-408.)。在計算相對表達(dá)量時，以角果的樣本為參照，即將其值轉(zhuǎn)換成 1(標(biāo)準(zhǔn)值)，其它樣品再與其比較，獲得相對表達(dá)值。結(jié)果如圖二所示，PDFl是一個在花器 官和雄蕊中高量表達(dá)的基因。3、PDFl基因人工微RNA干擾載體(microRNA_PDFl)的構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌菌株 EHA105轉(zhuǎn)化(購于上海滬尚生物科技有限公司)載體參照“擬南芥的2010計劃”中所列方法構(gòu)建(http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi ？ page = Home ；project = stdwmd)。選取的革巴序列為 AATUTUTATATUUTGTUGAG,相應(yīng)的 Oligo DNA 為TTAGAGACTATAGGACAGCTC。構(gòu)建的 microRNA-PDFl載體結(jié)構(gòu)如圖3所示。然后利用凍融法(前面已述)將microRNA-PDFl轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105(購自 大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)，涂布于含有50 μ g/mL氨芐青霉素和利福平 (50 μ g/mL)的LB固體(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化 鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C， 6.859X104Pa下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)平板上，37°C培養(yǎng)過夜，各挑選白斑三 個，做菌落PCR檢測(前面已述)。并對獲得的載體進(jìn)行測序以驗證準(zhǔn)確性。本發(fā)明所使用的研究PDFl基因功能的人工微RNA干擾手段和重組植物表達(dá)載體， 含有所述PDFl基因的靶標(biāo)核苷酸序列，通過對特定的靶標(biāo)位點進(jìn)行干擾，從而在轉(zhuǎn)錄水平 減弱PDFl基因的表達(dá)水平。該載體大小適合，在植物中易與轉(zhuǎn)化，所帶有的除草劑標(biāo)記基 因Bar表達(dá)強(qiáng)度高，容易檢測。通過這個載體轉(zhuǎn)化擬南芥可以獲得花藥敗育的具有雄性不 育表型的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。4、microRNA-PDFl人工微RNA干擾載體的遺傳轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化(Zhang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana usingthe floral dip method. Nature,2006, 1 :1-6)。制備含有構(gòu)建好載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105(前面已述)菌液，在轉(zhuǎn)化前一天轉(zhuǎn)入 含有卡那霉素50yg/ml、利福平50yg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)。第二天，用 紫外分光光度計(SPEK0L 1300)于276nm納米波長下檢測的吸光值，當(dāng)菌液的吸光值達(dá)到 在1.6-2.0之間時取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000g離心lOmin，棄上清，將沉淀 懸浮于等體積的5%蔗糖(質(zhì)量體積比)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前 加入終濃度為0.02% (體積比)的Silwet 1_77(購自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)。 混勻后把待轉(zhuǎn)化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15s，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植 株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。 隔一周再做一次轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)一個月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將 轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子播在混有PNS營養(yǎng)液的蛭石中，(PNS營養(yǎng)液成份為每升含5ml IM KN03，2ml IM Ca (N03) 2 · 4H20, 2ml IM MgS04 · 7Η20，2· 5ml 20mM Fe. EDTA, 2. 5ml IM 磷酸 緩沖液(pH5. 5)，Iml MS微量元素)；4°C春化一星期，在21_22°C的生長間中自然生長兩星 期左右，待到達(dá)四葉期的早期進(jìn)行除草劑草胺磷(30mg/L)的噴灑第一次，一星期之后進(jìn)行 第二次噴灑。兩次噴灑后對存活的綠苗進(jìn)行PCR陽性檢測，獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性苗。
5. BnPDFl基因的功能分析5. 1、microRNA-PDFl人工微RNA干擾載體轉(zhuǎn)化苗的篩選及PCR鑒定根據(jù)本實驗室進(jìn)行的除草劑草胺磷濃度梯度篩選實驗，確定除草劑(草胺磷，購 自拜爾公司，以下相同)篩選濃度為30mg/L。Tl代植株在苗期(播種后10天)噴施30mg/ L 除草劑，得到成活植株。采用 CTAB 法(M. G. Murray and W. F. Thompson, Rapid isolation of high molecularweight plant DNA, _Nucleic Acids Research,1980, Vol. 8, No. 19 4321-4326，以下相同)提取篩選后存活的擬南芥以及野生型擬南芥葉片DNA。根據(jù)表達(dá)載 體上(micro-PDFl) 35S和NOS序列，設(shè)計Mi引物進(jìn)行PCR檢測(序列為F_5' -CATGGATC AAAGATTCAAATAGAGG-3 ‘，R-5 ‘ -CCCGATCTAGTAACATAGATGACACCG-3 ‘),預(yù)期擴(kuò)增長度為 1058bp。將經(jīng)過PCR檢測的陽性植株編號并標(biāo)記。5. 2、microRNA-PDFl人工微RNA干擾載體轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察在眾多轉(zhuǎn)基因擬南芥Tl代植株中都觀察到了矮化的表型，因此我們對經(jīng)過除草 劑篩選后獲得的T2代的多個轉(zhuǎn)基因株系的株高進(jìn)行了測量。在T2代株系播種后20天和 40天分別對它們的株高進(jìn)行了測量，每個株系測量20株，并設(shè)定了 3個重復(fù)(在3個培養(yǎng) 盒中分別點播)，同時播種野生型擬南芥并在同樣的時間點(播種后20天和40天)測量株 高，也測量20株，并設(shè)定了 3個重復(fù)。在開花期，選取各個分支頂端已經(jīng)漏白但未開放的花朵，撥開花蕾。在放大鏡(3 倍)以及體視顯微鏡(OLYMPUS SZ61TRC)下觀察花藥以及花粉。用解剖針分離出花藥，參照 亞歷山^dfet去(Alexander,M. P. Differential staining of aborted and non-aborted pollen. Stain Technol,, 44 :117_122.，1969，以下相同)，40°C水浴加熱亞歷山大染色液浸 泡的花藥過夜(10-15小時)，用壓片法在顯微鏡(OLYMPUS 1X71)下觀察小孢子。通過觀 察并統(tǒng)計正常小孢子(染成桔紅色)和敗育小孢子(染成綠色)的比例判斷小孢子的敗 育程度。擬南芥花藥冰凍切片和蘇木精染色方法參照陳丹、趙杰建立的擬南芥花器官冰凍 切片技術(shù)(陳丹，趙杰.適合于擬南芥花器官的冰凍切片技術(shù).武漢植物學(xué)研究，23 (3) 85-290，2005)。5. 3冰凍切片的DAPI染色經(jīng)過上述方法(步驟5. 2)獲得的擬南芥花藥冰凍切片，采用DAPI染色的方法對 花藥小孢子中細(xì)胞核的發(fā)育狀態(tài)進(jìn)行觀察，具體方法如下DAPI (4，6-二氨基-2-苯基吲哚，以下相同)是用于研究花粉細(xì)胞核發(fā)育是否 正常的非常有效的染料(Park SK，Howde η R, Twe 11 D. The Arabidopsi sthaliana gametophytic mutation gemini pol Ienl disrupts microsporepolarity, division asymmetry and pollen cell f ate. Development 125，3789-3799. 1998)，它特異地與核酸 結(jié)合，在紫外光下發(fā)出藍(lán)色熒光。野生型成熟花粉中有1個營養(yǎng)細(xì)胞核和2個精細(xì)胞核(精 子)，共3個細(xì)胞核。其中營養(yǎng)細(xì)胞核因處于轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)而染色彌散。生殖核因處于不轉(zhuǎn) 錄或轉(zhuǎn)錄活性很低的異染色質(zhì)狀態(tài)而染色致密明亮。DAPI的使用濃度是2微克/微升，溶 于7% (質(zhì)量體積比)的蔗糖溶液，避光-20度保存。本發(fā)明使用的是碧云天公司配置好的 DAPI染液(貨號C1006市場有購置，)?；罴?xì)胞以及新鮮材料要在室溫下黑暗中染色30分 鐘，而切片材料要在室溫下黑暗中染色5-10分鐘即可。觀察時在熒光顯微鏡(BK-FLC)的 紫外波段(544nm)激發(fā)，產(chǎn)生藍(lán)色熒光。染色觀察結(jié)果如圖7所示，轉(zhuǎn)基因擬南芥的小孢子發(fā)育到四分體階段細(xì)胞核開始降解，出現(xiàn)了異常的PCD現(xiàn)象。5. 4DNA ladder證實microRNA_PDFl干擾載體轉(zhuǎn)基因株系小孢子PCD (細(xì)胞程序性 死亡)的產(chǎn)生①收集花粉粒配置0. 5M NaCl+7% (質(zhì)量體積比)蔗糖溶液，作為分離花粉的溶 劑。取半管1. 5毫升的EP管，將盛開或?qū)⒁_放的40-50朵花放入溶劑中，室溫下(20-25 度，以下相同)在漩渦振蕩器(ΜΤ-31/ΜΤ-51，ΥΑΜΑΤ0)上振蕩1分鐘，靜置1分鐘，重復(fù)2次。 吸取液體，室溫下(前面已述)12000g離心1分鐘。收集下面沉淀的細(xì)胞。②用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞在收集的沉淀中加入400 μ 1的細(xì)胞裂解液，充分搖勻 后再加入蛋白酶K(10yg/ml)，置65°C水浴消化至少2小時或過夜(前面已述)。其中，細(xì)胞 裂解液的成分為20% (質(zhì)量體積比)SDS 2.5ml ；lmol/LTris-HCl 5ml ；5mol/L NaCl 2ml ； 0. 5mol/L EDTA (Ph8. 0)0. 2ml，用雙蒸水補(bǔ)足體積到 100ml.③處理蛋白加入75 μ 1 8mol/L KAc，4°C下放置15分鐘，再加入750 μ 1氯仿，充 分混勻后，室溫下以5000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘后，將上清移至一新的EP管中。④沉淀DNA 在上清中加入750μ 1的無水乙醇，輕柔搖勻即可看見乳白色沉淀，若 不明顯，可置于-20°C過夜之后，室溫下以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘后，倒掉液體， 收集沉淀，用70% (體積體積比)的乙醇洗沉淀DNA兩次。⑤溶解DNA:在超凈臺內(nèi)將沉淀吹干，待沉淀表面無液體時，表明酒精已揮發(fā)完 全，在EP管內(nèi)加50 μ 1無菌雙蒸水，37°C溶解DNA。⑥測定DNA的濃度。用紫外可見分光光度計(756MC/756CRT型，上海光學(xué)儀器 廠)260nm測量OD值。⑦電泳用2% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠，在80V電壓下電泳2小時，用EB染色 5分鐘在凝膠成像儀(Fine-do XI，上海天能科技有限公司)中觀察是否有DNA梯度出現(xiàn)。以野生型的DNA作陰性對照，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系提取的樣品都有DNA梯度的出 現(xiàn)，造成一系列的剪切片斷(圖8)。6、microRNA-PDFl RNA干擾載體轉(zhuǎn)基因擬南芥后代中PDFl基因的表達(dá)水平分析在表型觀察的基礎(chǔ)上，用野生型擬南芥對轉(zhuǎn)基因單株進(jìn)行授粉，單株收獲種子。在 生長間正常播種并于苗期噴灑除草劑經(jīng)行初篩，在進(jìn)行PCR鑒定后獲得轉(zhuǎn)基因T2代各個株 系的活苗。摘取這些活苗的花蕾，速凍于液氮中，用熒光定量-PCR(方法參照研究內(nèi)容二) 對目標(biāo)基因BnPDFl的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果如圖9所示五個轉(zhuǎn)基因株系時-1，1^-3，1^-78，1^-16，1^-55中目標(biāo)基因的 表達(dá)量均明顯低于野生型擬南芥，不到野生型植株表達(dá)量的50%。其中mi-1株系中AtPDFl 的表達(dá)水平最低，只有對照的20%，所有轉(zhuǎn)基因株系的平均抑制效率達(dá)到40%-80%。這 一結(jié)果表明microRNA的干擾效果明顯，目標(biāo)基因的表達(dá)顯著下調(diào)。本發(fā)明利用人工微RNA技術(shù)在擬南芥中抑制PDFl基因的表達(dá)水平，研究了該基因 的功能。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中PDFl基因的沉默在生殖生長期會引起擬南芥的花粉敗育，具體 表現(xiàn)為與野生型擬南芥相比，結(jié)實率降低或者不結(jié)實，角果數(shù)量減少和不飽滿，RNAi轉(zhuǎn)基 因擬南芥的花藥體積變小，花粉明顯減少，花粉的敗育水平明顯升高，小孢子數(shù)量減少，皺 縮，被亞歷山大染液染成綠色(圖6B)。選擇敗育程度較高的轉(zhuǎn)基因株系，制作冰凍切片觀 察轉(zhuǎn)基因植株的花粉敗育的觀察，并結(jié)合DAPI核染料染色觀察發(fā)現(xiàn)小孢子核提早消失或
11沒有明顯的核，只出現(xiàn)核區(qū)(圖6D. H)。表明抑制或降低PDFl基因的表達(dá)會引起植物花粉 敗育，使植物的結(jié)實能力下降或完全失去，得到雄性不育植株。此外，DNA Ladder實驗證實 在敗育的小孢子細(xì)胞中發(fā)生了典型的PCD現(xiàn)象。因此PDFl基因具有控制花粉育性的功能， 對于利用基因工程技術(shù)創(chuàng)造雄性不育材料具有應(yīng)用價值。本發(fā)明的優(yōu)點1通過克隆該基因，研究該基因在油菜花藥發(fā)育中的作用，明確了該基因具有控制 花藥發(fā)育的功能。通過干擾該基因的表達(dá)，申請人可以人工創(chuàng)造雄性不育材料，為實現(xiàn)人工 控制的授粉系統(tǒng)提供新的不育基因。2通過克隆該基因，研究該基因在調(diào)控POT的發(fā)生方面的應(yīng)用。即研究其在POT中 的作用機(jī)理，控制自然狀態(tài)發(fā)生的PCD和外源(如脅迫、病害等)狀態(tài)下發(fā)生的PCD，從而在 植物抗病害和抗脅迫中應(yīng)用。3通過構(gòu)建PDFl基因的人工微RNA載體micro-PDFl，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得高干擾效 率的轉(zhuǎn)基因植株，為研究基因功能提供了一個有效的方法。4、通過對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行的表型觀察鑒定，發(fā)明人獲得63株具有雄性不育表 型的轉(zhuǎn)基因擬南芥，同時這些轉(zhuǎn)基因植株還具有矮化的表型。說明PDFl基因具有高效控制 植物花藥育性和株高的功能。


圖IPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測Napus, oleraces, rapa分別表示甘藍(lán)型油菜，甘藍(lán)和白菜型油菜。箭頭所指為目 的片段。圖2PDF1基因在油菜中的表達(dá)模式的研究A 油菜不同組織中的表達(dá)量。以成熟角果的相對表達(dá)量作為參照，設(shè)為1。B:油 菜可育株與不育株三個發(fā)育階段中的表達(dá)量。J03S:減數(shù)分裂時期(敗育前期，花蕾長度 < lmm)，J03M:四分體至單核期(敗育中期，花蕾長度l-3mm)，J03L 三核期(敗育后期，花 蕾長度> 3mm)。以J03A-S的相對表達(dá)量作為參照，設(shè)為1。C.油菜花蕾雌雄蕊中的表達(dá) 量。J03AP 不育雌蕊，J03AS 不育雄蕊，J03BP 可育雌蕊，J03BS 可育雄蕊。以J03AP的 相對表達(dá)量作為參照，設(shè)為1。圖中可以看出PDFl是一個可育株花蕾中高量表達(dá)的基因。圖3人工微RNA植物表達(dá)載體(micro-PDFl)構(gòu)建4轉(zhuǎn)基因植株的PCR驗證“_”為陰性對照，“ + ”為陽性對照是構(gòu)建的RNAI質(zhì)粒，1-14分別為轉(zhuǎn)基因單株，M 為 Marker(DL2000)圖5轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察A圖為擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因植株mi-1的整株；B圖為野生型和轉(zhuǎn)基因mi_l的 結(jié)實情況；C圖為野生型(WT)、mi-16 (半不育)、mi-1 (完全不育)的角果；D圖為野生型 擬南芥在體視顯微鏡下的花；E圖為mi-1 (完全不育)在體視顯微鏡下的花，Bar表示的為 0. 06cmo圖6轉(zhuǎn)基因擬南芥小孢子發(fā)育的亞歷山大染色觀察圖A 野生型(WT)成熟小孢子數(shù)目比較多，基本判定為可育；圖B :mi-16 (半不育)植株的小孢子；圖C :mi-l (完全不育)植株的小孢子。圖中染成綠色的是敗育小孢子(箭 頭所示)。Bar顯示的為25um。圖7轉(zhuǎn)基因擬南芥花藥的冰凍切片DAPI染色圖A，B，E，F(xiàn)表示野生型，C，D，G，H是轉(zhuǎn)基因擬南芥的花的切片。A，B和E，F(xiàn)分別為 小孢子處于四分體時期野生型和轉(zhuǎn)基因的切片；C，D和G，H分別為小孢子處于發(fā)育第11期 的野生型和轉(zhuǎn)基因株系的小孢子切片。A，C，E，G是日光下觀察的圖像；B，D，F(xiàn)，H是在紫外 激發(fā)下觀察的圖像.Pe表示Petal花瓣；S表示spore小孢子；Vb表示藥隔維管束Vescular bundle ；Ta表示絨租層Tapetum0圖中Bar表示50 μ m.圖8轉(zhuǎn)基因小孢子細(xì)胞的DNA ladder檢測。WT是來自于野生型小孢子DNA。1_7來自于各個轉(zhuǎn)基因株系小孢子DNA，分別為 mi_l, mi_4, mi_55, mi_7, mi_16, mi_44, mi_120 M 是 1Kb Marker。圖9microRNA干擾轉(zhuǎn)基因擬南芥的PDFl基因的表達(dá)量比較以野生型為參照，表達(dá)量設(shè)為1，1-5為隨機(jī)挑選的五個株系，分別為mi-1，mi_3， mi-78, mi-16, mi_55。在這五個株系中AtPDFl的表達(dá)均受到明顯的抑制。
具體實施例方式實施例1.PDFl同源基因的克隆和BnPDFl表達(dá)模式分析UPDFl同源基因的克隆根據(jù)Trirol提取試劑盒(前面已述)的要求進(jìn)行總RNA的提取，具體方法如下 分別取0. 05-0. Ig的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜葉片樣品，在液氮中研磨至粉狀，根據(jù) Trirol提取試劑盒的要求進(jìn)行RNA的提取。提取的總RNA溶于60uL的無RNase的雙蒸水 中。DNase I (前面已述)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650 BECKMAN, USA)分 別檢測RNA在260納米和280納米下的光吸收值，結(jié)合(質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電 泳鑒定RNA的純度及濃度。以上述獲得的RNA為模板按下列方案進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄2 μ g RNA中 加 IyL 01土80((110，701溫育51^11，立即置于冰上51^11，短暫離心，加入5\]\1-]\0^ Buffer 4μ L, dNTP(10mmol/L) 1 μ L, RNase Inhibitor 20 單位，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(購自 Promega 公司)200單位，用DEPC處理過的無菌水補(bǔ)至總體積20 μ L，混勻，42°C溫育lh，70°C水浴 15min，得到的cDNA分裝后于_20°C保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中擬南芥PDFl基因序列(gi =4929130)在NCBI網(wǎng)站上用 BLASTN(http://www, ncbi. nlm. nih. rov/BLAST)與本實驗室測序獲得的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜 和白菜型油菜基因片段序列進(jìn)行比對，分別獲得與擬南芥PDFl基因序列5'端同源的甘 藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜的⑶S(Coding sequence，編碼序列，以下相同)序列以及和擬 南芥PDFl基因序列3'端同源的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜的CDS序列。然后根據(jù)獲 得的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜PDFl基因的CDS序列與擬南芥PDFl基因起始密碼子和 終止密碼子同源區(qū)域設(shè)計引物(引物序列見表一)，從而確保擴(kuò)增產(chǎn)物為全長序列。引物序 列和擴(kuò)增條件分別為表1所示。表1 :PDF1同源基因克隆所用引物
權(quán)利要求
一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
3.一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。
4.一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列。
5.一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列。
6.一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1或2或3所述的蛋白質(zhì)在控制花藥育性中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求4或5或6所述的多肽在控制花藥育性中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2或3所述的蛋白質(zhì)在POT抑制因子中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4或5或6所述的多肽在PCD抑制因子中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制植物花粉育性的PDF1基因及制備方法和用途，從甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜中獲得的一種分離的蛋白質(zhì)，其序列分別為SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。所述的核苷酸序列是以cDNA為模板克隆到的CDS序列，一種分離的多肽，其序列分別為SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。一種控制植物花粉育性的PDF1基因中的應(yīng)用。涉及控制小孢子發(fā)育和花藥育性的PDF1同源基因的分離克隆、表達(dá)分析和應(yīng)用。PDF1為PCD抑制因子，該基因在油菜花藥中呈顯著的優(yōu)勢表達(dá)。通過基因工程技術(shù)減弱PDF1基因的表達(dá)能夠使小孢子敗育，控制花粉的育性，創(chuàng)造雄性不育系材料和恢復(fù)系材料，可用于雄配子發(fā)育研究及農(nóng)作物品質(zhì)改良。
文檔編號C07K14/415GK101974081SQ20101019049
公開日2011年2月16日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者劉勝毅, 劉越英, 李振波, 王琢玉, 董彩華, 黃軍艷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所