專利名稱：預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重組疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疫苗及其制備方法，尤其是用于預防鉤端螺旋體病的三價基因重 組疫苗及其制備方法。
背景技術：
由致病的問號鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)感染所引起的鉤端螺旋體 病是全世界流行的自然疫源性人獸共患傳染病，尤其好發(fā)于水稻種植地區(qū)，因而我國是鉤 端螺旋體病流行的主要疫區(qū)之一。問號鉤端螺旋體自然宿主動物眾多，感染后無癥狀或癥狀輕微，通常不死亡，但可 從尿液中排出問號鉤端螺旋體，直接污染水源或經(jīng)土壤污染水源(疫水)。由于問號鉤端螺 旋體在多種水系中能存活較長時間并可經(jīng)疫水迅速傳播，故鉤端螺旋體病是洪澇、地震等 自然災害時重點防疫的傳染病之一。我國地域遼闊，自然災害頻繁，因而始終存在著鉤端螺 旋體病暴發(fā)流行的危險。2005年，鉤端螺旋體病被列為國家重點監(jiān)測的13種重大傳染病之 一，最近又被列入國家計劃免疫項目之中。接種疫苗是預防和控制鉤端螺旋體病最為經(jīng)濟和有效的措施。目前國際上有兩種 鉤端螺旋體疫苗產(chǎn)品多價全菌死疫苗和多價外膜疫苗，目前以前者應用為主。然而，上述 疫苗在預防鉤端螺旋體病中存在的問題是①問號鉤端螺旋體血清群眾多，不同地區(qū)流行 的鉤端螺旋體血清群可有差別，多價全菌死疫苗或多價外膜疫苗對疫苗中不包含的問號鉤 端螺旋體血清群感染僅有微弱保護力甚至無保護力；②鉤端螺旋體病病人主要是農(nóng)民，由 于多價鉤端螺旋體全菌死疫苗、多價鉤端螺旋體外膜疫苗均含脂多糖內毒素，故副作用很 大，接種者數(shù)日內不能進行體力勞動，嚴重影響了免疫接種的積極性。因此，研制對不同血 清群鉤端螺旋體有廣泛交叉保護作用通用型疫苗，對于鉤端螺旋體病預防和控制具有極為 重要的意義并有廣闊的應用前景?；蚬こ桃呙缫匀斯ぶ亟M表達的蛋白分子為抗原，免疫成分明確，無明顯的毒副 作用，因而是當今新型疫苗研制的主要方向。病毒的抗原構造十分簡單，其基因工程疫苗的 免疫保護效果較好，如乙型肝炎病毒的重組表面抗原疫苗。但細菌的抗原構造復雜，單一抗 原的基因工程疫苗往往免疫保護效果不佳，這是目前尚無細菌單一抗原基因工程疫苗產(chǎn)品 的主要原因，采用多抗原是提高基因工程疫苗免疫保護效果的有效途徑之一。屬特異性抗原是所有鉤端螺旋體血清群均含有的一類抗原。我們發(fā)現(xiàn)，外膜脂 蛋白LipL32和LipL21及穿膜蛋白OmpLl是我國15群15型鉤端螺旋體參考標準株、鉤 端螺旋體分離株均表達的外膜蛋白抗原，其中LipL21編碼基因只有一個基因型，OmpLl和 LipL32編碼基因分別有3個(ompLl/1、ompLl/2和ompLl/3)和2個基因型(lipL32/l禾口 lipL32/2)，但各基因型表達產(chǎn)物抗血清對我國15群15型問號鉤端螺旋體參考標準株均 有不同程度的交叉凝集，表明OmpLl和LipL32也是屬特異性表面蛋白抗原。黃疸出血群 是我國主要流行的問號鉤端螺旋體血清群，70%鉤端螺旋體病例均為感染問號鉤端螺旋體黃疸出血群所致，其余30%鉤端螺旋體病例為感染問號鉤端螺旋體流感傷寒群、秋季群、波 摩那群、澳洲群、犬群、七日熱群等所致。上述問號鉤端螺旋體各血清群lipL32基因型均 為lipL32/l型，問號鉤端螺旋體黃疸出血群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日熱群ompLl基因 型為ompLl/2型，流感傷寒群、秋季群為ompLl/Ι型。因此，我們采用黃疸出血群賴型賴株 LipL32/l、LipL21和OmpLlA作為問號鉤端螺旋體通用性三價基因重組新疫苗的抗原
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是要填補現(xiàn)有問號鉤端螺旋體多價全菌死疫苗和多價外膜疫苗的 缺陷，提供一種能有效預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染且制造成本較低的通用型三價 基因重組疫苗及其制備方法。本發(fā)明提供的預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重組疫 苗，是一種同時含三種不同的問號鉤端螺旋體屬特異性外膜抗原LipL32/l、LipL21和 0mpLl/2的基因重組疫苗；它從黃疸出血群賴型賴株問號鉤端螺旋體基因組中克隆了 lipL32/l、lipL21和ompLl/2三個基因，通過基因工程技術制備了上述三個基因的融合基 因^？！^？/！-^？！^丨 ！^！^/^彳所述的融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^具有序列5所 示的核苷酸序列和氨基酸序列)，為了保證融合基因原核重組表達產(chǎn)物中三個蛋白抗原有 良好的空間構型，lipL32/l與lipL21、lipL21與ompLl/2基因之間用序列4所示的相同的 兩條柔性肽序列(Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser)連 接，構建了 lipL32/l-lipL21-ompLl/2 融合基因原核表達載體 pET42alipU2/1_lipm_°_V2，轉化入 大腸桿菌 E. coli BL21DE3 中，建立了重組原核表達系統(tǒng) E. coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-°mpL1/2, 其表達產(chǎn)物 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 分子中同時含有 rLipL32/l、rLipL21、r0mpLl/2 三 種重組蛋白抗原，從而能對不同血清群問號鉤端螺旋體感染具有免疫預防效果，不需要分 別重組表達rLipL32/l、rLipL21和r0mpLl/2，降低了生產(chǎn)成本，同時使制備方法更為簡便 可靠。本發(fā)明預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重組疫苗的制 備方法及其效果鑒定步驟1)黃疸出血群賴型賴株問號鉤端螺旋體lipL32/l、lipL21 和ompLl/2基因的克隆和測序及其原核表達系統(tǒng)構建；2)lipL32/l-lipL21-ompLl/2融 合基因及其原核表達系統(tǒng)構建和測序；3)含IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導目的重組蛋白抗原 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2表達，SDS-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)確定表達情況 和產(chǎn)量；4)利用lipL32/l-lipL21-ompLl/2融合基因3’端預先設置的His標簽序列，其 表達產(chǎn)物rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2可用Ni-NTA親和層析柱一次性提純，提純的產(chǎn)物用 SDS-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)確定純度；5)提純的rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^直 接與氫氧化鋁混合制備成注射液；6)采用問號鉤端螺旋體金地鼠感染模型、金地鼠血清特 異性抗體顯微鏡凝集效價檢測等方法，測定和確定問號鉤端螺旋體通用型三價基因重組疫 苗rLipL32-LipL21-0mpLl免疫保護作用及其特異性抗體產(chǎn)生情況。本發(fā)明的有益效果是1)本發(fā)明通過人工融合基因及其原核表達的三價融合重 組蛋白rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^提供一種能預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的皮 內注射多價抗原基因工程疫苗，并采用金地鼠感染模型、血清特異性抗體測定等方法，證實 該基因重組疫苗皮下注射免疫后可使83. 3% 91. 7%金地鼠能抵抗三種不同血清群問號鉤端螺旋體致死性感染而存活，存活金地鼠血清中含有能與我國15群15型問號鉤端螺旋 體參考標準株產(chǎn)生效價為1 50 1 400的顯微鏡交叉凝集抗體，因此能有效預防不同 血清群問號鉤端螺旋體感染而弓I起的鉤端螺旋體病，從而解決了當今使用的問號鉤端螺旋 體多價全菌死疫苗和多價外膜疫苗無交叉保護的缺點；2)本發(fā)明方法制備的多價重組蛋 白rLipL32/l-LipL21-OmpLl/2是一種對人體無害的細菌融合蛋白，不僅制備方法安全可 靠，同時也解決了當今使用的問號鉤端螺旋體多價全菌死疫苗副作用大的缺點；3)本發(fā)明 預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重組疫苗，是以基因工程技術一次 性表達和提純三種抗原融合的蛋白分子，故減少了制備環(huán)節(jié)而成本較低，有利于推廣應用。
具體實施例方式序列表說明序列1 (SEQ ID NO 1)是問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株lipL32/l基因核苷酸和氨基酸序列(問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株購自北京中國藥品生物制品檢定 所，每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列，lipL32/l基因去除信號肽序列及終止 密碼TAA)。序列2 (SEQ ID NO 2)是問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株lipL21基因核苷酸 和氨基酸序列(問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株購自北京中國藥品生物制品檢定所， 每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列，lipL21基因去除信號肽序列及啟動密碼 ATG和終止密碼TAA)。序列3 (SEQ ID NO 3)是問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株ompLl/2基因核苷 酸和氨基酸序列(問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株購自北京中國藥品生物制品檢定 所，每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列，ompLl基因去除信號肽序列及及啟動 密碼ATG)。序列4(SEQ ID NO 4)是用于連接各目的基因的柔性肽序列(柔性肽序列為自行 設計，每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列)。序列5(SEQ ID NO :5)是問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株人工融合 lipL32/l-lip21-ompLl/2基因核苷酸和氨基酸序列(問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴 株購自北京中國藥品生物制品檢定所，每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列，下 劃橫線區(qū)為柔性肽序列，有方框區(qū)為表達載體自行攜帶、用于Ni-NTA親和層析提取重組融 合抗原rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^的8XHis標簽，*表示終止密碼TAA)。以下結合實施例進一步說明實施例1、本實施例預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗是采用基因工 程技術，首先分別獲得lipL32/l、lipL21與ompLlA基因克隆，然后采用相同的兩條柔性 肽序列分別連接問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株lipL32/l與lipL21基因、lipL21 與ompLl/2基因，構建出同時含外膜脂蛋白LipL32/l、LipL21和穿膜蛋白0mpLl/2三 種問號鉤端螺旋體屬特異性表面抗原的人工融合基因1 ipL32/1 -1 ipL21 -ompLl/2及其 原核表達系統(tǒng)E. coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-°mpL1/2,提純的該表達系統(tǒng)的重組表達產(chǎn)物 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 作為疫苗抗原。本發(fā)明預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗對抗原及其基因的選擇依據(jù)70%我國鉤端螺旋體病例均為感染問號鉤端螺旋體黃疸出血群所致，其余30%鉤端螺 旋體病例為感染問號鉤端螺旋體流感傷寒群、秋季群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日熱群等 所致。上述問號鉤端螺旋體各血清群lipL32基因型均為lipL32/l型，問號鉤端螺旋體黃 疸出血群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日熱群ompLl基因型為ompLl/2型，流感傷寒群、秋季 群為ompLl/1型。然而，不同lipL32和ompLl基因型表達產(chǎn)物抗血清對我國15群15型問 號鉤端螺旋體參考標準株均有不同程度的交叉凝集。因此，黃疸出血群賴型賴株LipL32/l、 LipL21和OmpLl/2可作為問號鉤端螺旋體通用性三價基因重組新疫苗的抗原。
本發(fā)明預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗同時采用rLipL32/l、 rLipL21和rOmpLl/2三種蛋白抗原的理由是增加抗原種類，更有效地刺激機體產(chǎn)生高效 價抗體；增加抗體作用靶位，提高疫苗免疫保護效果。本發(fā)明預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗采用 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 融合蛋白抗原的理由是單一的 rLipL32/l、rLipL21 和r0mpLl/2需分別構建相應的三個原核表達系統(tǒng)，分別三次誘導重組抗原表達和 提純，若將lipL32/l、lipL21和ompLl/2三個基因用柔性肽序列連接后成為一個 lipL32/l-lipL21-ompLl/2融合基因，然后構建該融合基因原核表達系統(tǒng) E. coliBL21DE3pET42a-lipL32"-lipL21_。mpL"2，可一次性表達和提純同時含有 rLipL32/l、rLipL21 禾口 rOmpLlA抗原的一個融合蛋白抗原分子rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2，減少了表達和提純 工序并由此降低了成本，同時抗原分子量增大可具有提高抗原性的效果。本實施例預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗的抗原制備方法包含以 下的步驟1)問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株lipL32/l、lipL21和ompLl/2基因克隆 和測序；2)lipL32/l-lipL21-ompLl/2人工融合基因及其原核表達系統(tǒng)構建和測序；3)三 價重組融合蛋白抗原rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^表達及提純。本實施例中的問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株可從我國法定菌種保藏單位 購得；本實施例中所用的一切實驗用材料和試劑及相關設備均可從各自國內外相關產(chǎn)業(yè)公 司或國外公司國內銷售代理公司購得。在微生物學、分子生物學等技術領域的專業(yè)人員，均 可重復本實施例中的制備方法并進行試用。上述問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株lipL32/l、lipL21和ompLl/2基因的克 隆和測序的方法是1)取用購自北京中國藥品生物制品檢定所的問號鉤端螺旋體黃疸出 血群賴型賴株，問號鉤端螺旋體拉丁文名是L印tospira interrogans (L. interrogans)；問 號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株接種于EMJH或含8%兔血清的柯氏液體培養(yǎng)基中，普通 大氣中28°C培養(yǎng)7 10天；12000轉/分、4°C離心收集問號鉤端螺旋體沉淀，懸浮于滅菌 生理鹽水問中，按上法反復離心、懸浮2次；2)分別取離心沉淀的問號鉤端螺旋體，用苯酚 (pH7. 8-8.0)-氯仿(1 1，V V)提取、0. 1倍3mol乙酸鈉和2倍體積無水乙醇沉淀獲得 基因組DNA ；3)以問號鉤端螺旋體基因組DNA為模板，采用PCR分別擴增lipL32/l、lipL21 和ompLl/2基因，各上下游引物序列中均分別設置限制性核酸內切酶位點Nde I和Xhol， PCR 參數(shù):94°C 5 分鐘；940C 30 秒、50°C 30 秒、72°C 90 秒，30 個循環(huán)；72°C 10 分鐘；4) PCR 產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外線下觀察目的DNA擴增條帶；5)采用多家公司均可 提供的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，根據(jù)其操作說明書，先提取目的DNA擴增條帶；然后采用多家 公司均可提供的T-A克隆試劑盒，根據(jù)其操作說明書，用T4DNA連接酶16°C作用12小時將提純的DNA條帶與克隆質粒如pUC-M-T連接，反應總體積20 μ 1 ；6)取用可購自多家分子生物學試劑公司大腸桿菌DH5 α株，大腸桿菌拉丁文名是Escherichia coli (Ε. coli)，該菌 (Ε. C0Ii DH5 α )接種于LB培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)24小時，5000轉/分4°C離心15分鐘，收集 細菌沉淀懸于冰浴預冷的Iml 0. lmol/L CaCl2溶液中冰浴30分鐘，4000轉/分4°C離心10 分鐘，收集細菌沉淀懸于冰浴預冷的100 μ 1上述CaCl2溶液中，冰浴30分鐘，制備成感受態(tài) Ε. coli DH5a ；7)在上述100 μ 1感受態(tài)E. coli DH5 α懸液中加入上述連接產(chǎn)物2 μ 1，輕 輕混勻后冰浴30分鐘，42°C水浴熱激90秒，再冰浴2分鐘后加入SOC培養(yǎng)液500 μ 1，37°C 旋轉培養(yǎng)(160-180轉/分)培養(yǎng)1小時；8)在含100 μ g/ml氨芐青霉素LB瓊脂平板上分 別用濃度為20mg/ml的X-gal溶液40μ l、100mmol/L IPTG 20 μ 1均勻涂布，37°C干燥30分 鐘，然后涂布接種上述SOC培養(yǎng)物37°C培養(yǎng)24小時后觀察菌落產(chǎn)生情況；9)選取白色菌落 在含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37°C旋轉培養(yǎng)(160-180轉/分)培養(yǎng)4_6小時， 采用多家公司均可提供的細菌質粒提取試劑盒，按說明書操作進行質粒提取，提取的質粒 按上述方法進行Nde I和XhoI酶切、1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外線下分別確認有目 的DNA片段lipL32/l、lipL21或ompLl/^后，委托上海Invetrogen等專業(yè)公司采用雙末端 脫氧法測定克隆片段的核苷酸序列，序列正確者即為重組質粒pUC-M-T1—2^1、PUC-M-Tlipm 或 pUC-M-T。mpL1 氣 上述人工融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^的制備方法是1)上述含有重組 質粒 pUC-M-TlipL32/\pUC-M-TlipL21 或 pUC-M-TompL"2 的 E. coli DH5 α 分別在含 100 μ g/ml 氨 芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37V旋轉培養(yǎng)(160-180轉/分)培養(yǎng)4_6小時，采用多家公司 均可提供的細菌質粒提取試劑盒，按說明書操作，分別提取E. coli DH5a中的重組質粒 pUC-M-TlipL32/1、pUC-M-TlipL21 或 pUC-M-T。mpL1/2 ;2)根據(jù)柔性肽(Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly Gly Ser)核苷酸序列，設計分別擴增 lipL32/l、lipL21 或ompLl/2基因片段的引物，其中l(wèi)ipL32/l、lipL21基因下游引物含柔性肽正鏈序列， lipL21、ompLl/2基因上游引物含柔性肽負鏈序列，lipL32/l基因上游引物不含柔性肽序 列但設置限制性核酸內切酶Nde I位點，ompLl/2基因下游引物不含柔性肽序列但設置限 制性核酸內切酶XhoI位點，各引物委托上海Irwetrogen等專業(yè)公司合成，然后分別以重 組質粒pUC-M-TlipL32\ pUC-M-TlipL21或pUC-M-T°mpLV2為模板，采用PCR擴增出帶有柔性肽序 列的 lipL32/l、lipL21 和 ompLl/^2 基因片段，PCR 參數(shù)94°C 5 分鐘；94°C 30 秒、50°C 30 秒、72°C 90秒，30個循環(huán)；72°C 10分鐘；3)各PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在 紫外線下確認分別有l(wèi)ipL32/l、lipL21或ompLlA基因擴增片段后，采用多家分子生物學 試劑公司均可提供的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，按說明書操作，提純各目的擴增片段后用紫外 分光廣度法測定各提取物DNA濃度；4)將IOOng提純的lipL32/l基因擴增片段和IOOng 提純的lipL21基因擴增片段混合，加入除引物外的其它PCR試劑進行反應(反應參數(shù) 940C 5分鐘；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 60秒，10個循環(huán))，利用柔性肽正、負鏈互補性形成 lipL32/l-lipL21復合模板，然后加入lipL32/l基因上游引物及l(fā)ipL21基因下游引物進行 PCR 擴增(PCR 參數(shù)94°C 5 分鐘；94°C 30 秒、50°C 30 秒、72°C 120 秒，30 個循環(huán)；72°C 10 分 鐘)，按上述方法進行PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、紫外線下觀察、提純1 ipL32/1-1 ipL21 擴增片段、測定提取物DNA濃度；5)將IOOng提純的lipL32/l_lipL21擴增片段與IOOng 提純的ompLl/2基因擴增片段混合，加入除引物外的其它PCR試劑進行反應(反應參數(shù)94°C 5分鐘；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 60秒，10個循環(huán))，利用柔性肽正、負鏈互補性形 成lipL32/l-lipL21-ompLl/2復合模板，然后加入lipL32/l基因上游引物及ompLl/2基 因下游引物進行PCR擴增(PCR參數(shù)94°C 5分鐘；94°C 30秒、50°C 30秒、72°C 150秒，30 個循環(huán)；72°C 15分鐘)，按上述方法進行PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、紫外線下觀察、提 純lipL32/l-lipL21-ompLl/2擴增片段；6)采用多家公司均可提供的T-A克隆試劑盒，根 據(jù)其操作說明書，用T4 DNA連接酶16°C作用12小時將提純的lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^ 片段與克隆質粒如pUC-M-T連接，反應總體積20μ 1 ;6)E. coli DH5 α接種于LB培養(yǎng)液 中37°C培養(yǎng)24小時，5000轉/分4°C離心15分鐘，收集細菌沉淀懸于冰浴預冷的Iml
0.lmol/L CaCl2溶液中冰浴30分鐘，4000轉/分4°C離心10分鐘，收集細菌沉淀懸于冰 浴預冷的100 μ 1上述CaCl2溶液中，冰浴30分鐘，制備成感受態(tài)E. coli DH5 α ；7)在上 述100 μ 1感受態(tài)Ε. coli DH5 α懸液中加入上述連接產(chǎn)物2 μ 1，輕輕混勻后冰浴30分鐘， 42°C水浴熱激90秒，再冰浴2分鐘后加入SOC培養(yǎng)液500 μ 1，37°C旋轉培養(yǎng)(160-180轉 /分)培養(yǎng)1小時；8)在含100μ g/ml氨芐青霉素LB瓊脂平板上分別用濃度為20mg/ml 的X-gal溶液40μ l、100mmol/L IPTG 20 μ 1均勻涂布，37°C干燥30分鐘，然后涂布接種 上述SOC培養(yǎng)物37°C培養(yǎng)24小時后觀察菌落產(chǎn)生情況；9)選取白色菌落在含100 μ g/ml 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37°C旋轉培養(yǎng)(160-180轉/分)培養(yǎng)4_6小時，采用多家公司 均可提供的細菌質粒提取試劑盒，按說明書操作進行質粒提取，提取的質粒按上述方法進 行Nde I和XhoI酶切、1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外線下分別確認有目的DNA片段 lipL32/l-lipL21-ompLl/2后，委托上海Invetrogen等專業(yè)公司采用雙末端脫氧法測定克 隆片段的核苷酸序列，序列正確者即為含人工融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^片段的
puc-M-TiipL32/i^iipL2i"ompLi/2。
上述原核表達系統(tǒng) E. coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-°mpL1/2 的制備方法是1)含有重 組質粒pUC-M-Tiipu/i-iipLShmpu/2的E. coli DH5 Q在含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液
中37°C旋轉培養(yǎng)(160-180轉/分)培養(yǎng)4-6小時，采用多家公司均可提供的細菌質粒提 取試劑盒，按說明書操作，提取E. coli DH5a中的重組質粒pUC-M-TlipL32/1-lipL21-°mpW2 ;2)提 取的質粒用8-16單位的限制性核酸內切酶Nde I和XhoI 37°C酶切12小時，酶切產(chǎn)物經(jīng)
1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外線下確認有目的DNA片段lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^ 后，采用多家分子生物學試劑公司均可提供的DNA膠回收試劑盒，按說明書操作，切膠回收 lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^片段；3)原核表達載體pET42a購自Novagen公司，用8-16單位 的限制性核酸內切酶Nde I和XhoI 37°C酶切12小時，酶切產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分 離線性化的pET42a，采用多家分子生物學試劑公司均可提供的DNA膠回收試劑盒，按說明 書操作，回收線性化pET42a片段；4)根據(jù)lipL32/l-lipL21-ompLl/2與線性化pET42a片段 在瓊脂糖凝膠中紫外線照射下的熒光強度估計其濃度，然后lipL32/l-lipL21-ompLl/2與 線性化pET42a片段按3 1的比例混合，加入T4 DNA連接酶37°C連接12小時，反應總體 積20 μ 1 ；5)取用購自Novagen公司的大腸桿菌BL21DE3株(E. coli BL21DE3)，該菌接種于 LB培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)24小時，5000轉/分4°C離心15分鐘，收集細菌沉淀懸于冰浴預冷 的Iml 0. lmol/L CaCl2溶液中冰浴30分鐘，4000轉/分4°C離心10分鐘，收集細菌沉淀懸 于冰浴預冷的100 μ 1上述CaCl2溶液中，冰浴30分鐘，制備成感受態(tài)Ε. coli BL21DE3 ；6) 在上述100 μ 1感受態(tài)E. coli BL21DE3懸液中加入上述連接產(chǎn)物2μ 1，輕輕混勻后冰浴30分鐘，42°C水浴熱激90秒，再冰浴2分鐘后加入SOC培養(yǎng)液500 μ 1，37°C旋轉培養(yǎng)(160-180 轉/分)培養(yǎng)1小時；7)在含100 μ g/ml氨芐青霉素LB瓊脂平板上涂布接種上述SOC培 養(yǎng)物，37°C培養(yǎng)24小時；8)挑取菌落在含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37°C旋轉 培養(yǎng)(160-180轉/分)培養(yǎng)4-6小時，采用多家公司均可提供的細菌質粒提取試劑盒，按 說明書操作進行質粒提取，提取的質粒按上述方法進行Nde I和XhoI酶切，1. 5%瓊脂糖凝 膠電泳分離后，在紫外線下確認有目的DNA片段lipL32/l-lipL21-ompLl/2后，委托上海 Invetrogen等專業(yè)公司采用雙末端脫氧法測定目的片段的核苷酸序列，序列正確者即為目 的原核表達系統(tǒng) E. C0liBL21DE3pET42a-lipL32-lipL21-。mpU。
上述重組表達產(chǎn)物rLipL32-LipL21-OmpLl的表達和提純方法是1)在LB液 體培養(yǎng)液中接種 E. Co 1 iBL2lDE3pET42a-lipL32"lipL21-ompL1, 30 V 或 37 300 轉 / 分旋轉培養(yǎng) 4小時，加入0. 5mol/L的IPTG，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)4 6小時；2)上述培養(yǎng)物5000 轉/分4 °C離心15分鐘，收集細菌沉淀用超聲破碎(電壓300V，破碎3秒后間歇3秒，共200 次)，采用多家公司均可提供的Ni-ΝΓΑ親和層析柱，根據(jù)說明書操作，將破碎產(chǎn)物過Ni-NTA柱， 利用重組表達產(chǎn)物rLipL32/l-LipL2WtapLl/2羧基端SXHis標簽進行分離、洗脫、收集目的重 組表達產(chǎn)物 rLipL32/l-LipL2LLl/2。實驗結果如下:1)E. coli BL21DE3pET42riipL32/1"lipI21"onpL1/2 能 有效表達rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2，經(jīng)SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢 測，rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2產(chǎn)量可達細菌總蛋白的36. 5 % ；2)Ni-NTA親和層析后 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 可達到電泳純。為證實目的重組表達產(chǎn)物rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^的抗原性和免疫反應性， 用rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2為抗原免疫家兔并檢測其誘導血清特異性抗體產(chǎn)生情況； 以rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2為抗原，檢測其與問號鉤端螺旋體全菌兔抗血清(購自北京 中國藥品生物制品檢定所)的免疫結合反應性。目的重組表達產(chǎn)物rLipL32-LipL21-OmpLl的抗原性和免疫反應性佐劑 活性實驗分別描述如下1)抗原性檢測選用體重2. 5 3. Okg家兔，先將0. 5ml 含Img rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2與等量弗氏完全佐劑混合，背部皮內多點注 射，間隔一周注射一次，共4次；末次注射后第10天，抽取免疫家兔心血、分離 血清，以rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2為抗原，用瓊脂雙擴散法鑒定血清中有無 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2特異性抗體及其效價；2)免疫反應性檢測以每孔50ng rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2為抗原、1 500-10000稀釋的問號鉤端螺旋體全菌兔抗血清 (購自北京中國藥品生物制品檢定所)為一抗、多家公司均可提供的1 2000稀釋的HRP 標記羊抗兔IgG為二抗，采用Western Blot檢測rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^的免疫結合反 應性。上述實驗結果如下l)rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2免疫家兔后可產(chǎn)生特異性抗體， 其瓊脂雙擴散法效價為1 4;2)稀釋度高達1 5000的問號鉤端螺旋體全菌抗體能識別 rLipL32-LipL21-0mpLl并與之結合，形成明顯的特異性黑褐色雜交條帶。實施例2、本實施例是將提純的重組表達產(chǎn)物rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^為抗原 與氫氧化鋁為佐劑1 10混合(W W)后成為預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組 疫苗，通過金地鼠保護試驗及免疫金地鼠血清特異性抗體檢測，確定預防鉤端螺旋體病的 通用型三價基因重組疫苗通過皮下注射途徑免疫金地鼠后，免疫金地鼠對抗不同血清群問 號鉤端螺旋體致死性感染的免疫保護效果及血清抗體效價。
本發(fā)明預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗中采用氫氧化鋁作為佐劑的理由是氫氧化鋁是實際應用多年、安全而有明確效果的注射用佐劑。本發(fā)明預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗采用皮下注射的理由是問 號鉤端螺旋體侵入人體后引起鉤端螺旋體血癥，因此血清抗體是主要保護性抗體，采用皮 下注射是誘導血清抗體產(chǎn)生的最為有效的途徑。本實施例預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗的金地鼠保護試驗及血 清特異性抗體檢測包含以下的步驟1)問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群 臨型臨6株、波摩那群波摩那型羅株對金地鼠(8 9周齡，120 150g體重)100%最低致死 量的確定；2)預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗(rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 與氫氧化鋁混合物)對金地鼠的免疫保護作用，即了解該疫苗免疫金地鼠對抗上述三種問 號鉤端螺旋體2倍100%最低致死量攻擊后的存活率；3)攻擊后存活的金地鼠血清抗體效 價測定。本實施例中的問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群臨型臨6株、波 摩那群波摩那型羅株分別可從北京中國藥品生物制品檢定所及其它我國法定菌種保藏單 位購得；實施例中所用的金地鼠可從多個國內大學、中國科學院、中國疾病預防控制中心、 各省實驗動物中心等單位購得，氫氧化鋁和牛血清白蛋白等材料國內多家公司或國外公司 國內代理商均可提供。在醫(yī)學微生物學、實驗動物學等技術領域的專業(yè)人員，均可重復本實 施例中的實驗方法并進行試用。上述不同血清群問號鉤端螺旋體對金地鼠100%最低致死量的測定方法是1)問 號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群臨型臨6株、波摩那群波摩那型羅株腹腔 內接種金地鼠，感染2-3天后采集心血分離各群問號鉤端螺旋體，在含8%兔血清的柯氏培 養(yǎng)液中增菌，以達到問號鉤端螺旋體增強毒力的效果；2)新鮮培養(yǎng)的問號鉤端螺旋體黃疸 出血群賴型賴株、流感傷寒群臨型臨6株、波摩那群波摩那型羅株15°C中12000轉/分離心 15分鐘，收集沉淀的問號鉤端螺旋體，用滅菌生理鹽水懸浮，配制成不同濃度的問號鉤端螺 旋體懸液；3)每只金地鼠分別腹腔注射不同濃度不同問號鉤端螺旋體懸液1ml，共6只，常 規(guī)飼養(yǎng)條件下觀察7天；4)以觀察期限內所有金地鼠均死亡的最低問號鉤端螺旋體濃度為 該血清群問號鉤端螺旋體100%最低致死劑量。上述實驗結果如下問號鉤端螺旋體黃疸 出血群賴型賴株、流感傷寒群臨型臨6株、波摩那群波摩那型羅株100%最低致死劑量分別 為 1. 5X IO8,3. OXlO9 ^P 1. 5X109。上述預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗對金地鼠免疫保護作用的 測定方法是1)按1 10(w W)的比例，分別將rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^與氫氧化 鋁、牛血清白蛋白與氫氧化鋁混合后形成兩種混合物，一種混合物中含200yg/0. Iml的 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 和 2mg/0. Iml 的氫氧化鋁，另一種混合物含 200 μ g/0. Iml 的 牛血清白蛋白和2mg/0. Iml的氫氧化鋁；3)將金地鼠分成1_6組，每組12只，第1 3組 于一側腹股溝皮下注射rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^與氫氧化鋁混合物0. 1ml，第4 6組 于一側腹股溝皮下注射牛血清白蛋白與氫氧化鋁混合物0. Iml ；兩周后第1 3組、第4 6組在另一側腹股溝皮下注射與第一次成分、劑量完全相同的混合物；4)末次注射后第四 周，第1和第4組金地鼠腹腔注射2倍100%最低致死劑量的問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴 型賴株(3.0X108)懸液lml，第2組和第5組金地鼠腹腔注射2倍100%最低致死劑量的問號鉤端螺旋體流感傷寒群臨型臨6株(6. OX 109)懸液1ml，第3組和第6組金地鼠腹腔 注射2倍100%最低致死劑量的問號鉤端螺旋體波摩那群波摩那型羅株(3.0X109/ml)懸 液1ml ；5)上述金地鼠常規(guī)飼養(yǎng)條件下觀察7天，記錄各組死亡情況。實驗結果見表1。表1鉤端螺旋體病通用型三價基因重組疫苗金地鼠免疫保護試驗結果 上述預防鉤端螺旋體病的通用型三價基因重組疫苗免疫金地鼠經(jīng)問號鉤端螺旋 體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群臨型臨6株、波摩那群波摩那型羅株1/2倍的100% 最低致死劑量攻擊后存活者的血清抗體效價測定方法是1)按1 10(W W)的比例，分 別將rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2與氫氧化鋁形成混合物，該混合物中含200 y g/0. lml的 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2和2mg/0. lml的氫氧化鋁；2)將金地鼠分成3組，每組12只， 各組于一側腹股溝皮下注射rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2與氫氧化鋁混合物0. 1ml，兩周后 另一側腹股溝皮下注射與第一次成分、劑量完全相同的混合物；3)末次注射后第四周，第 1組金地鼠腹腔注射1/2倍的100%最低致死劑量的問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株 (0. 75X 108)懸液1ml，第2組金地鼠腹腔注射1/2倍的100%最低致死劑量的問號鉤端螺 旋體流感傷寒群臨型臨6株(1.5X109)懸液lml，第3組金地鼠腹腔注射1/2倍的100%最 低致死劑量的問號鉤端螺旋體波摩那群波摩那型羅株(0. 75X 109/ml)懸液lml ；4)上述金 地鼠常規(guī)飼養(yǎng)條件下觀察7天，第8天采集各存活金地鼠心血2ml、分離血清；5)采用顯微 鏡凝集試驗檢測血清中特異性凝集抗體，先將各血清用生理鹽水進行對倍稀釋(1 50 1 1600)，取0. lml各稀釋血清與0. lml我國15群15型問號鉤端螺旋體參考標準株新鮮 培養(yǎng)物混合，37°C震蕩孵育1小時，然后在400倍暗視野顯微鏡下觀察問號鉤端螺旋體凝集 情況，以引起50%問號鉤端螺旋體凝集的血清最高稀釋度為效價判斷標準。上述實驗結果 見表2。表2問號鉤端螺旋體通用型三價基因重組疫苗免疫金地鼠顯微鏡凝集試驗結果
權利要求
預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重組疫苗，其特征在于所述融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO5所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重 組疫苗，其特征在于所述融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^的柔性肽序列如SEQ ID NO 4所示。
3.預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重組疫苗的制備方法，以問 號鉤端螺旋體外膜脂蛋白LipL32/l、LipL21和穿膜蛋白OmpLlA為抗原，采用基因工程技 術構建lipL32/l、lipL21和ompLl/^的人工融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^及其原核 表達系統(tǒng)，采用提純的同時含三種不同蛋白分子重組表達產(chǎn)物rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^ 為抗原的問號鉤端螺旋體基因工程疫苗。
4.根據(jù)權利要求3所述的預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重 組疫苗的制備方法，包含以下的步驟1)問號鉤端螺旋體lipL32/l、lipL21和ompLlA基 因的克隆和測序；2) lipL32/l-lipL21-ompLl/2人工融合基因及其原核表達系統(tǒng)構建和測 序；3)含IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導三價重組蛋白抗原分子rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2表 達，SDS-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)確定表達情況和產(chǎn)量；4) Ni-NTA親和層析法提 純 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 ；5) rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 與氫氧化鋁(alum)混合后 組成可注射疫苗劑型。
5.根據(jù)權利要求4所述的預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重 組疫苗的方法，其特征在于所說的融合基因rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2與氫氧化鋁混合 液直接制備成注射液。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基 因重組疫苗的方法，其特征在于問號鉤端螺旋體lipL32/l、lipL21和ompLlA基因的克隆 方法是1)取用問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株，將其接種、培養(yǎng)后離心收集問號鉤 端螺旋體沉淀；2)分別取離心沉淀的問號鉤端螺旋體，用苯酚、-氯仿、提取、乙酸鈉和無 水乙醇沉淀獲得基因組DNA ；3)以問號鉤端螺旋體基因組DNA為模板，采用PCR分別擴增 lipL32/l、lipL21和ompLlA基因，各上下游引物序列中均分別設置限制性核酸內切酶位 點Nde I和XhoI ；4) PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，在紫外線下觀察目的DNA擴增條帶；5)采用PCR產(chǎn) 物純化試劑盒，先提取目的DNA擴增條帶；然后采用T-A克隆試劑盒，用T4 DNA連接酶將 提純的DNA條帶與克隆質粒如pUC-M-T連接；6)取用大腸桿菌DH5a株，將其接種、培養(yǎng)， 然后收集細菌沉淀，制備成感受態(tài)E. coli DH5a懸液；7)在上述感受態(tài)Ε. coli DH5 α懸 液中加入上述連接產(chǎn)物，加入SOC培養(yǎng)液培養(yǎng)；8)在LB瓊脂平板上涂布接種上述SOC培養(yǎng) 物；9)選取SOC培養(yǎng)物上的白色菌落在含LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，采用細菌質粒提取試劑盒進行 質粒提取，提取的質粒進行Nde I和XhoI酶切、電泳分離，在紫外線下分別確認有目的DNA 片段lipL32/l、lipL21或ompLl/2后，測定克隆片段的核苷酸序列，序列正確者即為重組質 粒 pUC-M-TlipL:W1、pUC-M-TlipL21 或 pUC-M-T。mpW2。
7.根據(jù)權利要求6所述的預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因 重組疫苗的方法，其特征在于上述人工融合基因lipL32/l-lipL21-ompLl/2的制備方法 是1)上述含有重組質粒 pUC-M-TlipL32\ pUC-M-TlipL21 或 pUC-M-T。mpW2 的 Ε. coli DH5 α 分 別在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)后，采用細菌質粒提取試劑盒，分別提取Ε. coli DH5a中的重組質粒PUC-M-Tlipcwi、pUC-M-Tlipm或pUC-M-T°mpW2 ；2)根據(jù)柔性肽核苷酸序列，設計分別擴增lipL32/l、lipL21或ompLl/2基因片段的引物，其中l(wèi)ipL32/l、lipL21基因下游引物含柔性 肽正鏈序列，lipL21、ompLl/2基因上游引物含柔性肽負鏈序列，lipL32/l基因上游引物不 含柔性肽序列但設置限制性核酸內切酶Nde I位點，ompLl/2基因下游引物不含柔性肽序 列但設置限制性核酸內切酶XhoI位點，然后分別以重組質粒pUC-M-TlipL32A、pUC-M-TlipL21或 pUC-M-TompL1/2為模板，采用PCR擴增出帶有柔性肽序列的lipL32/l、lipL21和ompLl/2基 因片段；3)各PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，在紫外線下確認分別有l(wèi)ipL32/l、lipL21或ompLl/2 基因擴增片段后，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，提純各目的擴增片段后測定各提取物DNA濃 度；4)將提純的lipL32/l基因擴增片段和提純的lipL21基因擴增片段混合，加入除引物 外的其它PCR試劑進行反應，利用柔性肽正、負鏈互補性形成lipL32/l-lipL21復合模板， 然后加入lipL32/l基因上游引物及l(fā)ipL21基因下游引物進行PCR擴增；按上述方法進行 PCR產(chǎn)物電泳分離、紫外線下觀察、提純lipL32/l-lipL21擴增片段、測定提取物DNA濃度； 5)將提純的lipL32/l-lipL21擴增片段與提純的ompLlA基因擴增片段混合，加入除引物 外的其它PCR試劑進行反應，利用柔性肽正、負鏈互補性形成lipL32/l-lipL21-ompLl/2復 合模板，然后加入lipL32/l基因上游引物及ompLl/2基因下游引物進行PCR擴增，按上述 方法進行PCR產(chǎn)物電泳分離、紫外線下觀察、提純lipL32/l-lipL21-ompLl/2擴增片段；6) 采用T-A克隆試劑盒，用T4DNA連接酶將提純的lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^片段與重組質 粒連接，獲得連接產(chǎn)物；6)E. coli DH5a接種于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，離心收集細菌沉淀，制備 成感受態(tài)E. coli DH5a懸液；7)在上述感受態(tài)E. coli DH5 α懸液中加入上述連接產(chǎn)物，混 勻后加入SOC培養(yǎng)液培養(yǎng)；8)在LB瓊脂平板上分別用X-gal溶液、IPTG均勻涂布，然后涂 布接種上述SOC培養(yǎng)物培養(yǎng)、觀察；9)選取SOC培養(yǎng)物上的白色菌落在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 采用細菌質粒提取試劑盒進行質粒提取，提取的質粒按上述方法進行Nde I和XhoI酶切、 電泳分離，在紫外線下分別確認有目的DNA片段lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^后，測定克隆片 段的核苷酸序列；序列正確者即為含人工融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^片段的重組 質粒 pUC-M-TlipL32/l-lipL2l-ompLl/2。
8.根據(jù)權利要求7所述的預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重 組疫苗的方法，其特征在于上述原核表達系統(tǒng)E. coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-°mpL1/2的制備 方法是1)含有重組質粒PUC-M-TlipL32/1-lipL21-°mpW2的E.coli DH5a在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng) 后，采用細菌質粒提取試劑盒，提取E. coli DH5 α中的重組質粒ρυ^—τ —^Ρ.?！/2 . 2)提取的質粒用限制性核酸內切酶Nde I和XhoI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，在紫外 線下確認有目的DNA片段lipL32/l-lipL21-ompLl/2后，采用DNA膠回收試劑盒，切膠回 收lipL32/l-lipL21-ompLl/2片段；3)原核表達載體pET42a用限制性核酸內切酶Nde I 和XhoI酶切，酶切產(chǎn)物用電泳分離線性化的pET42a，采用DNA膠回收試劑盒，回收線性 化pET42a片段；4)根據(jù)lipL32/l-lipL21-ompLl/2與線性化pET42a片段估計濃度，然后 lipL32/l-lipL21-ompLl/2與線性化pET42a片段按3 1的比例混合，加入T4 DNA連接 酶連接，獲得連接產(chǎn)物；5)取用大腸桿菌BL21DE3株，接種于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，離心收集細 菌沉淀，制備成感受態(tài)E. coli BL21DE3懸液；6)在上述感受態(tài)懸液中加入上述連接產(chǎn)物， 再加入SOC培養(yǎng)液培養(yǎng)；7)在LB瓊脂平板上涂布接種上述SOC培養(yǎng)物培養(yǎng)；8)挑取SOC 培養(yǎng)物上的菌落在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4-6，采用細菌質粒提取試劑盒進行質粒提取，提取的質粒按上述方法進行Nde I和XhoI酶切、電泳分離后，在紫外線下確認有目的DNA片段 lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^，測定目的片段的核苷酸序列，序列正確者即為目的原核表達系 統(tǒng) E. coliBL21DE3pET42a-lipL32-lipL2卜卿L1。
9.根據(jù)權利要求8所述的預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重 組疫苗的方法，其特征在于上述重組表達產(chǎn)物rLipL32-LipL21-0mpLl的表達和提純方法 是1)在LB液體培養(yǎng)液中接種E. coliBL21DE3pET42a"lipL32"lipL21"ompL1培養(yǎng)，加入IPTG繼續(xù)培 養(yǎng)；2)上述培養(yǎng)物離心、收集細菌沉淀用超聲破碎，采用M-NTA親和層析柱，將破碎產(chǎn)物過 Ni-NTA柱，利用重組表達產(chǎn)物rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2羧基端8 X His標簽進行分離、洗 脫、收集目的重組表達產(chǎn)物rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預防鉤端螺旋體病的三價基因重組疫苗及其制備方法。目的是提供的疫苗及其制備方法能夠有效預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染且制造成本較低。技術方案是本發(fā)明提供的預防不同血清群問號鉤端螺旋體感染的通用型三價基因重組疫苗，是從黃疸出血群賴型賴株問號鉤端螺旋體基因組中克隆了lipL32/1、lipL21和ompL1/2三個基因，通過基因工程技術制備的融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2具有序列5所示的核苷酸序列和氨基酸序列，lipL32/1與lipL21、lipL21與ompL1/2基因之間用序列4所示的相同的兩條柔性肽連接。
文檔編號C07K19/00GK101874898SQ20101020646
公開日2010年11月3日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權日2010年6月21日
發(fā)明者嚴杰 申請人:嚴杰