專(zhuān)利名稱(chēng)：人tau蛋白外顯子2、外顯子3、外顯子10多克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
傳染病的診斷與研究。
背景技術(shù)：
tau 是一組微管蛋白相關(guān)蛋白(Microtubule-associated protein,MAP)，由人 17 號(hào)染色體上的基因共同編碼。由于轉(zhuǎn)錄后的mRNA剪切方式不同，成人腦中存在6種tau蛋 白的異構(gòu)體，大小從352-441個(gè)氨基酸不等，由C末端含3個(gè)或4個(gè)重復(fù)序列(是否含外 顯子10)，以及N末端有0個(gè)、1個(gè)(外顯子幻或2個(gè)(外顯子2及外顯子幻插入序列的 ON-tauUN-tau 或 2N_tau 組合而成。tau蛋白大多存在于神經(jīng)元細(xì)胞中，也存在于一些少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠 質(zhì)細(xì)胞中。tau蛋白參與了許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如阿爾氏海默病 (Alzheimer disease，AD)、與17號(hào)染色體相關(guān)的額顳葉癡呆和帕金森病(Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17, FTPD-17)、皮克病(Pick' s disease, PD)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(Corticobasal degeneration, CBD)、進(jìn)行性核上癱 (Progressivesupranuclear palsy，PSP)，以及克雅氏病(CJD)和吉斯綜合癥(GSQ等可傳 播性海綿樣腦病(TSEs)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備人微管相關(guān)蛋白tau外顯子2 (E2)、外顯子3 (E2)、外顯子 10 (E2)特異性多克隆抗體。因外顯子自身表達(dá)蛋白后相對(duì)分子質(zhì)量較小，均為3KD，難于分離和純化，同時(shí)難 以保證其免疫原性。故針對(duì)上述問(wèn)題，申請(qǐng)人在表達(dá)和免疫時(shí)采用融合了谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn) 移酶(GST)蛋白。而在后期的抗體純化過(guò)程中，采用親和層析法成功地將GST抗體組分除 掉，經(jīng)蛋白免疫印跡試驗(yàn)和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)證實(shí)獲得了特異性強(qiáng)，效價(jià)高的抗人tau 蛋白外顯子2、外顯子3、外顯子10的多克隆抗體，并且此制備的多克隆抗體在對(duì)重組tau 蛋白各異構(gòu)體的檢測(cè)中能夠得到較好的應(yīng)用。


圖1十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定純化后的蛋白純度泳道1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2 融合蛋白GST-E2 ；泳道3 融合蛋白GST-E3 ；泳道4 融 合蛋白GST-ElO ；泳道5 對(duì)照GST蛋白圖2蛋白免疫印跡(WesternBlot)方法鑒定純化后蛋白泳道1 融合蛋白GST-E2 ；泳道2 融合蛋白GST-E3 ；泳道3 融合蛋白GST-E10 ；泳 道4 對(duì)照GST蛋白圖3間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定兔源、鼠源多克隆抗體的效價(jià)圖4蛋白免疫印跡法(WesternBlot)鑒定純化后的人tau各外顯子抗體的特異性
泳道1 :GST-E2 ；泳道2 :GST_E3 ；泳道3 :GST_E10 ；泳道4 :GST蛋白，各抗體見(jiàn)圖上方。圖5蛋白免疫印跡法(WesternBlot)鑒定所制備抗體的應(yīng)用情況具體實(shí)施例1免疫原的制備由于外顯子自身表達(dá)蛋白后相對(duì)分子質(zhì)量較小，均為3千道爾頓(KD)，難于分離 和純化，同時(shí)難以保證其免疫原性，故申請(qǐng)人在表達(dá)和免疫時(shí)融合了谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶 (GST)蛋白。發(fā)明結(jié)果顯示在大腸埃希菌中以可溶形式表達(dá)出目的蛋白，并利用親和層析的純 化方法純化出人tau蛋白外顯子2、外顯子3、外顯子10重組融合蛋白GST-E2、GST-E3及 GST-E10，相對(duì)分子質(zhì)量約為29KD(圖1、2)。1人tau外顯子2、3、10原核載體的構(gòu)建以人外周血DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得人tau蛋白外顯子2、3及10序 列。所用引物包括外顯子2上游引物CGGGATCCGAATCTCCCCTGCAGACCC，外顯 子2下游弓丨物CGGAATTCTCATTCCGCTGTTGGAGTGCTC ，外顯子3上游引物 CGGGATCCGATGTGACAGCACCCTTAG ，外顯子 3 下游引物CGGAATTCTCATGTGGTTCCTTCTGGGAT CTCC ，外顯子10上游引物CGGGATCCGTGCAGATAATTAATAAGAATC ，外顯子10下游引物 CGGGATCCGTGCAGATAATTAATAAGAAGC,上游引物包括BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物包括EcoRI酶 切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)條件為 94°C 3min、94°C lmin、55°C 30sec、72°C Imin 和 72°C lOmin，循環(huán) 30次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆至pMD-18T克隆載體，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，用BamHI及EcoRI 游離克隆產(chǎn)物，亞克隆至原核表達(dá)載體PGEX-2T，構(gòu)成重組質(zhì)粒pGEX-2T-E2、pGEX-2T-E3及 PGEX-2T-E10。2人tau蛋白外顯子融合蛋白GST-E2、GST_E3、GST-ElO的表達(dá)、純化及鑒定將轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pGEX-2T-E2、E3、ElO的工程菌常規(guī)活化后按1 100接種入 IOOml Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中，37°C劇烈振搖培養(yǎng)至光密度值 600 (OD6tltl) =0.5-0.7 時(shí)，分別選取不同誘導(dǎo)時(shí)間(ai、3h、4h)，不同異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度(lmM、 0. 5mM、0. lmM、)，不同誘導(dǎo)溫度(37°C、30°C、25°C )，以摸索最佳表達(dá)條件，而后離心收菌 重懸于5ml PBS (加入100 μ ITriton Χ-100)中，冰浴下超聲破菌(功率400W，25次，每次 IOsec,間隔IOsec)，12，OOOrpm 4°C離心IOmin后分離上清和沉淀。沉淀用500 μ 1磷酸鹽 緩沖液(PBQ重懸。分別取上清和沉淀各20μ 1，按比例加入5Χ蛋白加樣緩沖液，100°C變 性5min，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，考馬斯亮藍(lán)染 色，鑒定蛋白的表達(dá)形式，結(jié)果見(jiàn)圖1。取anl 50%的谷胱甘肽瓊脂糖4B (Glutathoine Sepharose 4B)柱至離心管中， 4，OOOrpm離心5min，棄上清。再用5倍體積的PBS緩沖液洗兩次，備用。將預(yù)處理好的 Glutathoine Sepharose 4B加至待純化樣品中，在搖床上振搖4h，使融合蛋白與親和填料 充分結(jié)合。親和吸附結(jié)束后4，OOOrpm離心5min，收集Glutathoine Sepharose 4B并轉(zhuǎn)移 至5ml離心管中；然后加入2倍體積洗滌緩沖液室溫下振搖5min，4，OOOrpm離心5min，棄 上清，重復(fù)洗滌15次；最后加入2倍體積的洗脫緩沖液，室溫下振搖10min，4，OOOrpm離心 5min，收集洗脫液上清，并再次洗脫，重復(fù)洗脫約10次，分別收集洗脫液上清。將每次洗脫的蛋白各取20 μ 1，按比例與5Χ蛋白加樣緩沖液混和，100°C變性lOmin，進(jìn)行12%十二烷 基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色，觀察純化情況。把 純化的蛋白溶液置于透析袋中，在無(wú)菌的PBS中，4°C透析過(guò)夜。將每次洗脫的蛋白各取20 μ 1，按比例與5XLoading buffer混合，100°C變性 5min，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分離，60mA電流通電Ih將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5 % 脫脂奶封閉膜池，一抗(鼠源抗GST單克隆抗體，工作濃度1 4，000，用5%脫脂奶稀 釋)37°C作用濁，用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3次X5min，二抗(辣 根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，工作濃度1 5，000，用5%脫脂奶稀釋)371作用111，充 分洗滌后用增強(qiáng)化學(xué)顯色(ECL)法顯色，結(jié)果見(jiàn)圖2。具體實(shí)施例2免疫程序?qū)⒔?jīng)純化的GST-E2、GST-E3、GST-ElO融合蛋白與等量的弗氏完全佐劑混和乳 化，分別免疫新西蘭大白兔及Balb/c小鼠。兔分4點(diǎn)背部皮下注射，每只兔抗原注射量約 800 μ g，濃度1. Omg/ml ；Balb/c小鼠腹部皮下多點(diǎn)注射，每只鼠抗原注射量約100 μ g，濃度 0. 5mg/ml。首次免疫14d后，將等量抗原與弗氏不完全佐劑混和乳化進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每間隔 1周進(jìn)行1次，共四次。加強(qiáng)免疫時(shí)，每只兔抗原注射量約500 μ g，濃度1. Omg/ml ；每只鼠 抗原注射量約80 μ g，濃度0. 5mg/ml。最后1次加強(qiáng)免疫3d后，兔采取頸動(dòng)脈放血，Balb/ c小鼠采取心臟取血，分離血清，加入0. 疊氮鈉，-20°C凍存。具體實(shí)施例3多克隆抗體的純化及滴度測(cè)定1利用蛋白A(Protein Α)對(duì)多克隆抗體的純化用2 5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液(PBQ平衡ftOtein G柱，將鼠源抗血清用PBS 稀釋后與平衡后的ftOteinG柱結(jié)合。然后用5-10倍的洗滌液(150mmOl/L氯化鈉、2mmol/ L乙二胺四乙酸、磷酸鹽緩沖液，pH7. 0)進(jìn)行洗滌，用適當(dāng)體積的洗脫液(lOOmmol/L甘氨 酸，PH2.7)進(jìn)行洗脫。洗脫出的液體用中和液(lmol/L鹽酸三羥甲基氨基甲烷，pH9.0)進(jìn) 行中和，使PH值為7.0。根據(jù)西格瑪(SIGMA)試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，用10倍柱體積的4_羥乙基哌嗪乙磺 酸(HEPEQ緩沖液將脫鹽(Desalting)柱平衡，用10倍柱體積的綁定緩沖液平衡ftOteinA 柱，再將ftOteinA柱與脫鹽(Desalting)柱連接，將兔源抗血清用綁定緩沖液稀釋后與平 衡后的I^rotein A柱結(jié)合。然后用10倍的綁定緩沖液進(jìn)行洗滌，用5倍體積的洗脫液進(jìn)行 洗脫。洗脫出的液體即為PH值7.0純化后的IgG。所用的磷酸鹽緩沖液、洗滌液及洗脫液 均用0. 45 μ m濾器過(guò)濾后使用。對(duì)純化后的抗體分別命名為GR2、GR3、GM2、GM3、GMlO。2抗體中GST組分的去除(1)填料的準(zhǔn)備將溴化氰活化的瓊脂糖4B(CNBr-aCtiVated Sepharose 4B)干 粉用ImM鹽酸溶解成填料備用(Ig干粉可溶解成3. 5ml填料)。(2)抗原(蛋白)偶聯(lián)用偶聯(lián)緩沖液(0. IM碳酸氫鈉、0. 5M氯化鈉、ρΗ8· 3)溶解 GST蛋白(每mL填料可結(jié)合5-10mg蛋白)，并將混合好的偶聯(lián)緩沖液與填料混合，一般室 溫Ih或4°C過(guò)夜，溫和陣搖，勿用轉(zhuǎn)子劇烈搖動(dòng)，這樣會(huì)破壞瓊脂糖珠子，大大降低偶聯(lián)效果。
(3)用5倍體積偶聯(lián)緩沖液沖洗偶聯(lián)后的填料，將多余未偶聯(lián)的蛋白洗掉。(4)加入0. IM鹽酸三羥甲基氨基甲烷，pH8.0封閉多余活性位點(diǎn)。(5)用5倍柱體積的不同pH值洗液清洗偶聯(lián)后的填料，至少三次循環(huán)(0. IM乙酸 鈉，0. 5M氯化鈉，ρΗ4· 0/0. IM鹽酸三羥甲基氨基甲烷，0. 5Μ氯化鈉，ρΗ8· 0)。(6)向偶聯(lián)好的填料中加入ftOteinA純化后的抗體(小于1/2柱床體積)，室溫 Ih或4°C過(guò)夜，使填料中的GST蛋白與抗體中的抗性部分充分反應(yīng)。2100rpm,離心3min，即 為純化后的抗體。分別命名為R2c、R3c、M2c、M3c、M10c。3純化后抗體的滴度測(cè)定(1)抗體的敏感性檢測(cè)應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法對(duì)純化后抗體的敏感性進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)包被液稀釋 后的GST-E2、GST-E3、GST-ElO融合蛋白及GST蛋白(約200ng/孔)加入酶標(biāo)板，4°C包被 過(guò)夜；5%脫脂奶37°C封閉4h ；將待測(cè)孔分別加入含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液倍比稀 釋純化后的抗體，用相應(yīng)的免疫前兔血清作陰性對(duì)照，PBS作空白對(duì)照，37°C 2h ；分別加入 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(l 16，000稀釋)，370C Ih ；TMB顯色，2mol/L H2SO4終 止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定(A45tlJOD值，結(jié)果見(jiàn)圖3。(2)抗體的特異性檢測(cè)應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western Blot)方法對(duì)純化后抗體的特異性進(jìn)行檢測(cè)。將 GST-E2、GST-E3、GST-E10融合蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分 離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維濾膜上，5%脫脂奶封閉膜lh。一抗(1 1，000稀釋的純化后多克隆抗 體)37°C作用池，二抗(1 5，000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG) 37°C作用lh， 充分洗滌后用ECL法顯色，結(jié)果見(jiàn)圖4。具體實(shí)施例4多克隆抗體G&、GR3、GM2、GM3、GM10的應(yīng)用效果試驗(yàn)應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western Blot)方法對(duì)純化后抗體的特異性進(jìn)行檢測(cè)。將重 組tau蛋白各異構(gòu)體(含HIS標(biāo)簽)經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維濾膜上，5%脫脂奶封閉膜lh。一抗(1 1，000稀釋的純化后多克隆 抗體)37°C作用池，二抗(1 5，000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG) 37°C作用 Ih,充分洗滌后用ECL法顯色，結(jié)果見(jiàn)圖5。通過(guò)對(duì)重組的六種人tau異構(gòu)體的蛋白免疫印跡試驗(yàn)來(lái)看，制備的多克隆抗體能 夠較好的識(shí)別含有相應(yīng)外顯子的重組異構(gòu)體蛋白，而不識(shí)別不含有相應(yīng)外顯子的重組異構(gòu) 體蛋白?？芍景l(fā)明的多克隆抗體特異性較好，能夠應(yīng)用于傳染病的診斷和研究。
權(quán)利要求
1.免疫原三種融合蛋白GST-E2、GST-E3、GST-E10。GST-E2代表GST蛋白與具有人 tau蛋白外顯子2氨基酸序列的E2融合表達(dá)的重組蛋白；GST-E3代表GST蛋白與具有人 tau蛋白外顯子3氨基酸序列的E3融合表達(dá)的重組蛋白；GST-ElO代表GST蛋白與具有人 tau蛋白外顯子10氨基酸序列的ElO融合表達(dá)的重組蛋白。
2.多克隆抗體五種特異性抗人tau蛋白外顯子2、外顯子3和外顯子10的鼠源和兔 源多克隆抗體。
3.免疫原及多克隆抗體的制備和純化方法。
全文摘要
人tau蛋白外顯子2、外顯子3、外顯子10多克隆抗體。屬于傳染病診斷與研究領(lǐng)域。因外顯子自身表達(dá)蛋白后相對(duì)分子質(zhì)量較小，均為3KD，難于分離和純化，同時(shí)難以保證其免疫原性。針對(duì)上述問(wèn)題，申請(qǐng)人在表達(dá)和免疫時(shí)采用融合了谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白。而在后期的抗體純化過(guò)程中，采用親和層析法成功地將GST抗體組分除掉，從而獲得了特異性強(qiáng)、效價(jià)高的鼠源和兔源的抗人tau蛋白外顯子2、外顯子3、外顯子10的多克隆抗體。為進(jìn)行tau蛋白在神經(jīng)退行性疾病中的作用研究及不同tau蛋白異構(gòu)體分布和對(duì)疾病的作用機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明中的抗體可制成試劑盒，用于疾病的診斷。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102070718SQ20101021063
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月23日
發(fā)明者田嬋, 石琦, 董小平, 陳操, 韓俊, 高晨 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所