專利名稱：高表達(dá)量的溶血素基因及其分泌表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工改造合成的高表達(dá)量的化膿鏈球菌溶血素基因nslo，屬于 醫(yī)學(xué)微生物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及一種依上述基因構(gòu)建的分泌型表達(dá)載體及其應(yīng) 用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
溶血素主要來自鏈球菌、金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌等。來自化膿鏈球菌 (Streptococcuspyogenes)的溶血素(Streptolysin O，SLO)是膽固醇依賴性的，能夠與人及
其它動物的細(xì)胞膜上的膽固醇相結(jié)合，結(jié)合到細(xì)胞膜上的SLO蛋白分子會形成環(huán)狀寡聚 體，形成大的孔道，導(dǎo)致細(xì)胞膜溶解，而且介導(dǎo)一些大分子(如NADase)通過細(xì)胞膜， 所以SLO是鏈球菌感染宿主過程中的重要毒素蛋白。SLO在醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用價值，首先在醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中， SLO作為成孔蛋白，被用作打孔工具；其次，在診斷醫(yī)學(xué)中，作為檢測試劑，用來檢測 被Streptococcuspyogenes感染的患者體內(nèi)的抗SLO的抗體(anti-SLO)；再其次，可以用 做細(xì)胞自殺基因和自殺蛋白，研究其在控制腫瘤細(xì)胞繁殖中的應(yīng)用。從天然鏈球菌中獲得SLO的工藝成本高，得率低，具有不安全性。自1984年 以來，前人一直研究SLO在大腸桿菌原核系統(tǒng)中的表達(dá)，至目前，國內(nèi)外研究人員已經(jīng) 在原核系統(tǒng)中實現(xiàn)了 SLO與maltose-binding protein、GST-tag和6His_tag等表達(dá)標(biāo)簽的 融合表達(dá)。但是，在目前SLO的重組表達(dá)方法中，存在的顯著缺點是表達(dá)產(chǎn)量始終比較 低，在0.3mg/mL以下，導(dǎo)致后期純化應(yīng)用難度較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是提供一種人工改造合成的，可在大腸桿菌中 高效表達(dá)的新的化膿鏈球菌溶血素基因nslo及其表達(dá)載體，該人工改造合成的nslo基 因，具有SEQ IDN0.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列使用了使用了大腸桿菌偏愛性密碼子。使用所述溶血素基因nslo構(gòu)建的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體為分泌型載體，優(yōu)選為pET_20b(+)。使用所述溶血素基因nslo或表達(dá)載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或基因工程菌。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種所述溶血素基因nslo或含有溶血 素基因nslo的表達(dá)載體在醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷和SLO抗體制品生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計并合成了編碼化膿鏈球菌溶血素的新基因nslo，構(gòu)建了含該nslo基因 的分泌型表達(dá)載體和含該分泌型表達(dá)質(zhì)粒的工程菌。表達(dá)結(jié)果表明，溶血素蛋白產(chǎn)量可 以達(dá)到3mg/ml，酶活達(dá)到2.4xl06HU/mL，Western和Elisa實驗表明其抗原性顯著，實 現(xiàn)了 SLO蛋白在原核生物大腸桿菌中高效率分泌性表達(dá)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。



圖lnslo/pET_20b (+)酶切鑒定圖1 .DNA Marker ； 2.nslo/pET_20b (+) ； 3.nslo/pET_20b (+)雙酶切。圖2nslo/pET_20b (+)物理圖譜圖3重組表達(dá)SLO搖瓶發(fā)酵的SDS-PAGE圖譜1.蛋白 Marker ； 2.pET_20b (+) /BL21 (DE3)的胞內(nèi)上清；3.nslo/pET_20b (+) / BL21(DE3)的胞內(nèi)上清。
具體實施例方式以下通過實施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實施例用于說明目的而非用于限制 本發(fā)明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆 手冊所述的條件進(jìn)行操作。實施例Insl0基因設(shè)計以 Streptococcus pyogenes NZ131 菌株 slo 基因序列 232_1673bp 為起始序列(1-231 序列編碼的氨基酸序列與SLO的溶血活性與抗原性不相關(guān))，在mRNA的二級結(jié)構(gòu)分析 的基礎(chǔ)上，用65個大腸桿菌偏愛密碼子替換slo基因內(nèi)部的大腸桿菌稀有密碼子，得到新 的人工改造設(shè)計的化膿鏈球菌溶血素基因nslo，序列見SEQIDN0.1，全長1485個核苷 酸，編碼495個氨基酸，替換的堿基和相關(guān)的密碼子在nslo和NZ131菌株slo基因的比對 圖(圖1)中進(jìn)行了標(biāo)記。實施例2nslo基因合成與克隆由于nslo基因與原slo基因相比，變動較大，不便于使用突變技術(shù)，因此使用 化學(xué)合成法一步合成nslo基因，將合成的nslo基因與pMD18T (Takara)載體連接，轉(zhuǎn)化 JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含lOOg/mL氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)過37°C培養(yǎng)過夜，得到單克 隆轉(zhuǎn)化子nslO/pMD18T/JM109，經(jīng)過菌落PCR鑒定，質(zhì)粒酶切鑒定和測序鑒定，表明新 合成的nslo基因全長為1485bp，編碼495氨基酸，測定的序列和設(shè)計序列完全相同。實施例3分泌表達(dá)SLO蛋白的載體構(gòu)建用于實現(xiàn)nslo基因在大腸桿菌中分泌性表達(dá)的載體是pET_20b⑴，該載體帶有 pelB信號肽和His-tag標(biāo)簽，將pET_20b(+)質(zhì)粒和nslo/pMD18T用NocI和NotI切，酶切 產(chǎn)物切膠回收，再用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過37°C 培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子，通過菌落PCR鑒定，質(zhì)粒酶切鑒定(見圖2)和測序鑒定，保存 鑒定的 nslo/pET_20b (+) /E.coli JM109 菌，提取 nslo/pET_20b (+)備用。實施例4分泌表達(dá)SLO蛋白的工程菌構(gòu)建將質(zhì)粒nslo/pET_20b (+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主BL21 (DE3)，再在100g/mL氨芐 青霉素的LB平板，經(jīng)過37°C培養(yǎng)過夜，經(jīng)過菌落PCR鑒定，得到單克隆轉(zhuǎn)化子nslo/ pET-20b (+) /BL21 (DE3)。實施例5發(fā)酵與SLO蛋白的分離純化1、搖瓶發(fā)酵
將nslo/pET-20b⑴/BL21 (DE3)接種在LB培養(yǎng)基中37 °C液體培養(yǎng)過夜，后接 入 TB (甘油 5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，K2HP04 12.54g/L, KH2P04 2.31g/L) 發(fā)酵液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)到細(xì)菌OD_到0.8，用0.5mM IPTG(異丙基硫代β-D半乳 糖苷)誘導(dǎo)，降溫至15°C培養(yǎng)，48h時產(chǎn)酶達(dá)3mg/mL以上，SDS電泳圖譜見圖4。2、分離純化將表達(dá)后的培養(yǎng)液離心，得到上清用0.45um膜過濾，過濾后的溶液按照1 1 的比例和 2X Binging buffer (IOmM 咪唑，lMNaCl，40mM Tris-HCL)混勻備用；His-tag 親和層析柱用5倍柱體積的IX charging buffer(50mM NiS04)處理后，再用倍柱體積IX Binding buffer(2.5mM 咪唑，0.5M NaCl, 20mM Tris-HCL)平衡；上樣品后用 10 倍柱體 積 IX Binging buffer 洗柱，再用 5 倍柱體積 IX Washing buffer (60mM 咪唑，0.5M NaCl, 20mM Tris-HCL)洗柱；用 6 倍柱體積 IX Elution buffer(lM 咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗脫。實施例6酶活測定、Western、Elisa鑒定重組表達(dá)的SLO蛋白抗原性SLO 樣品可用溶液 A(溶液 A 36mM H3PO4, 126mM NaCl, lg/L BSA(bovine seramalbumin)，pH 7.0)進(jìn)行系列梯度稀釋。將 0.5ml 的 I5OmM 2-mercaptoethanol 與 Iml
稀釋樣品混勻，30°C孵育15min，然后每管加0.5ml含綿羊紅細(xì)胞的A溶液(158X IO8ceIl/ ml)30°C下反應(yīng)20min，離心后，用541nm檢測上清中血紅蛋白的濃度。IU定義為在該 實驗條件下，引起上述反應(yīng)體系中50%紅細(xì)胞溶解的酶量所需要的酶量。經(jīng)測定，ImL 菌液的酶活為2.4x106HU以上。Western和Elisa實驗結(jié)果為陽性，表明其具有抗原性。實施例7nsl0基因在醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷中的應(yīng)用用nslo基因構(gòu)建SLO表達(dá)工程菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)SLO蛋白。SLO蛋白是醫(yī) 學(xué)研究和臨床使用的重要生物學(xué)試劑。利用SLO蛋白，作為抗原，可以檢測患者體內(nèi) ASO (抗SLO蛋白的抗體)，以此診斷鏈球菌感染引起的變態(tài)反應(yīng)和最近是否存在鏈球菌 感染。實施例Snslo基因SLO抗體制品生產(chǎn)中的應(yīng)用將純化得到的SLO蛋白，免疫動物，純化免疫血清，得到SLO抗體。nslo基因SLO抗體制品生產(chǎn)中的應(yīng)用可參考下列文獻(xiàn)1 .Kimoto H, Fujii Y，Hirano S，Yokota Y，Taketo A.Expression of recombinant StreptolysinO and specific antibody production.J Mol Microbiol Biotechnol.2005 ； 10(1) 64-8.2.Velazquez B, Massaldi H, Battistoni J, Chabalgoity JA.Construction and expression ofrecombinant streptolysin—o and preevaluation of its use in immunoassays.Clin Diagn Lab Immunol.2005 May ； 12(5) 683-4.
權(quán)利要求
1.一種人工改造合成的化膿鏈球菌溶血素基因nslo，具有SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶血素基因nslo，其特征在于所述核苷酸序列使用大腸桿菌 的偏愛性密碼子。
3.含有權(quán)利要求1所述溶血素基因nslo的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為分泌型載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于優(yōu)選為pET_20b(+)。
6.含有權(quán)利要求1所述溶血素基因nslo或權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求1所述溶血素基因nslo或權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的基因工程菌，優(yōu) 選為大腸桿菌BL21(DE3)。
8.權(quán)利要求1所述溶血素基因nslo或權(quán)利要求5所述表達(dá)載體在醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷 和溶血素抗體制品生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高表達(dá)量的溶血素基因及其分泌表達(dá)載體和應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明是以來自Streptococcus pyogenes NZ131菌株slo基因序列為模板(Streptococcuspyogenes NZ131，complete genomeNCBI accessionNC_011375.1)，利用大腸桿菌優(yōu)化密碼子替換其56個大腸桿菌稀有密碼子，設(shè)計并合成了編碼化膿鏈球菌溶血素的新基因nslo，構(gòu)建了含該nslo基因的分泌型表達(dá)載體和含該分泌型表達(dá)質(zhì)粒的工程菌。表達(dá)結(jié)果表明，蛋白表達(dá)產(chǎn)量可以達(dá)到3mg/mL以上，酶活可達(dá)到2.4×106HU/mL。本發(fā)明實現(xiàn)了nslo的高效表達(dá)，可廣泛引用于與醫(yī)學(xué)研究和疾病診斷，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07K16/06GK102010870SQ201010211058
公開日2011年4月13日 申請日期2010年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月28日
發(fā)明者康貽軍, 王歡莉, 趙慶新 申請人:鹽城師范學(xué)院