專(zhuān)利名稱(chēng)：一種低分子量麥谷蛋白亞基的提取分離鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低分子量麥谷蛋白亞基的提取分離鑒定方法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟系闹饕Z食作物，是我國(guó)的第三大類(lèi)糧食作物，在人類(lèi)生存和國(guó)家 糧食安全中起著十分重要的作用。小麥籽粒含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其中蛋白質(zhì)約占籽粒營(yíng) 養(yǎng)成分的8% 10%，包括水溶性的清蛋白、鹽溶性的球蛋白、醇溶性的醇溶蛋白及溶于酸 或堿的麥谷蛋白類(lèi)。清蛋白和球蛋白主要存在于小麥種子的胚和糊粉層中，約占籽粒蛋白 的15%左右，在加工后得到的面粉中含量很少，對(duì)小麥面粉加工品質(zhì)的影響比較小。醇溶 蛋白和麥谷蛋白是小麥胚乳中的主要儲(chǔ)藏蛋白，約占籽粒蛋白的85 %，是小麥面粉中的主 要蛋白，與小麥面粉加工品質(zhì)密切相關(guān)。其中，醇溶蛋白是單體蛋白，主要影響面團(tuán)的粘性， 而麥谷蛋白可以形成多聚體蛋白，主要影響面團(tuán)的彈性。小麥的麥谷蛋白按其分子量大小 又分為高分子量麥谷蛋白亞基(high molecularweight glutenin subunits，簡(jiǎn)稱(chēng)HMW-GS) 和低分子量麥谷蛋白亞基(low molecularweight glutenin subunits，簡(jiǎn)稱(chēng)LMW-GS)，其中 LMW-GS是面筋的主要成份，對(duì)小麥面粉加工品質(zhì)起著重要的作用，主要影響面筋的強(qiáng)度和 延展性。SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)是蛋白質(zhì)分離中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其儀器簡(jiǎn)單、操 作方便、重復(fù)性好，在麥谷蛋白的分離鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用，特別是在高分子量麥谷蛋 白的分離和命名中發(fā)揮了很大的作用。但是小麥LMW-GS的組成比較復(fù)雜，種類(lèi)較多，分子 量大小相似，在SDS-PAGE圖譜中遷移率差別很小，難以進(jìn)行有效的分離和鑒定。隨著雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的建立，基于雙 向電泳和質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在分析小麥種子蛋白的研究中發(fā)揮著越來(lái)越大的作 用。雙向電泳(2-DE)又稱(chēng)為等電聚焦雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(IEF-SDS-PAGE)，在20世 紀(jì)70年代中期建立并開(kāi)始廣泛應(yīng)用，是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離與展示的技 術(shù)。其原理是，蛋白質(zhì)首先根據(jù)等電點(diǎn)的不同在第一向等電聚焦電泳中分離，然后被轉(zhuǎn)移到 SDS-PAGE中，根據(jù)分子量的大小進(jìn)行第二向分離。質(zhì)譜(Massspectrometry，MS)分析法是 通過(guò)測(cè)定樣品離子的質(zhì)荷比(m/z)來(lái)進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析的方法，可以將2-DE分離得到的 蛋白質(zhì)進(jìn)行有效地鑒定，目前基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F MS)和液相 色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)的檢測(cè)效果較好，應(yīng)用很廣泛。近年來(lái)，基于雙 向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法在分離小麥LMW-GS的研究中得到了很好的應(yīng)用。蛋白質(zhì)雙向電泳的第一向凝膠電泳為等電聚焦，根據(jù)不同蛋白質(zhì)本身所帶有電荷 的不同將它們進(jìn)行分離。在麥谷蛋白的提取過(guò)程中多使用SDS(十二烷基磺酸鈉)來(lái)提高 提取效率。而SDS能與蛋白質(zhì)牢固地結(jié)合，改變蛋白質(zhì)本身所帶的電荷，進(jìn)而影響第一向等 電聚焦，所以，在LMW-GS提取中應(yīng)盡可能避免使用SDS。在Singh等(1991)提出的麥谷蛋 白提取方法中，僅使用異丙醇和Tris堿，最大限度地減少了對(duì)蛋白的修飾。但在用DTT將麥谷蛋白中的二硫鍵還原后，要用4-乙烯吡啶(4-VP)對(duì)還原得到的巰基進(jìn)行修飾保護(hù)，防 止自由巰基的再氧化。我們發(fā)現(xiàn)4-VP的修飾可以改變蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，影響等電聚焦，進(jìn) 而影響2-DE的效果。與正常條件下的分析結(jié)果相比，4-VP修飾改變了 LMW-GS的等電點(diǎn)，超 出了 IPG膠條的pH值(3-10)范圍，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在等電聚焦時(shí)遷移到了膠條之外，致使等電 聚焦過(guò)程失敗，即在2-DE圖譜中，VP修飾后的大多數(shù)蛋白點(diǎn)聚集于堿性端，很多本應(yīng)出現(xiàn) 的蛋白點(diǎn)丟失了(如圖1)。利用質(zhì)譜對(duì)蛋白凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的基本思路是使用蛋白酶將凝膠中的 蛋白切割成大小適中的肽段，再將肽段回收，然后利用質(zhì)譜測(cè)定得到肽段的分子量，產(chǎn)生 質(zhì)譜峰圖，質(zhì)譜峰圖中的信號(hào)峰與蛋白點(diǎn)酶切后得到肽段的質(zhì)量數(shù)是一一對(duì)應(yīng)的。在常規(guī) 的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，普遍使用的蛋白酶是胰蛋白酶，因?yàn)橐鹊鞍酌缚梢蕴禺愖R(shí)別氨基酸 K和R，而且K和R在大多數(shù)蛋白質(zhì)中的數(shù)量適中和分布較均勻，可以得到合適大小(m/z， 900-3600)的酶切肽段。麥谷蛋白是指禾谷作物的種子中溶于稀酸或稀堿，但不溶于水、鹽及醇溶液的蛋 白質(zhì)組分，是由多個(gè)亞基通過(guò)分子間二硫鍵相互連接成的大分子物質(zhì)，麥谷蛋白在稀酸或 稀堿溶液中的溶解性隨肽鏈上二硫鍵數(shù)目的增加而減小。麥谷蛋白按其分子量高低可分為高分子量麥谷蛋白亞基(分子量為60kD以上) 和低分子量麥谷蛋白亞基(分子量一般為30-45kD)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分離麥谷蛋白亞基的方法。本發(fā)明所提供的分離麥谷蛋白亞基的方法，包括如下步驟將待分離的麥谷蛋白 進(jìn)行雙向電泳，得到分離的麥谷蛋白亞基；所述雙向電泳中，進(jìn)行電泳的上樣液是用含有 DTT的水合上樣緩沖液溶解所述待分離的麥谷蛋白得到的。上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，所述DTT在所述水合上樣緩沖液中的濃度為 20mM-65mM,具體為 65mM 或 20mM。上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，所述待分離的麥谷蛋白是按照包括如下步驟的 方法提取得到的(1)從待提取物質(zhì)中提取總蛋白；(2)從步驟(1)得到的蛋白中去除醇溶 蛋白；(3)再用麥谷蛋白提取緩沖液從步驟(2)得到的蛋白中提取麥谷蛋白，得到麥谷蛋 白；所述麥谷蛋白提取緩沖液由異丙醇、Tris-HCl緩沖液、DTT和水組成。上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，所述待分離的麥谷蛋白的提取方法中，在所述 步驟(1)之前，包括如下步驟用TCA的丙酮溶液浸泡所述待提取物質(zhì)，離心，收集沉淀，從 沉淀中提取總蛋白；所述水合上樣緩沖液由尿素、硫脲、CHAPS、DTT、pH值范圍為3_10的IPG buffer、 pH值范圍為6-11的IPG buffer和水組成。上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，每升所述麥谷蛋白提取緩沖液由500ml異丙 醇、12. 5ml pH值為8. 0的IM Tris-HCl緩沖液、65mmol DTT和水組成；上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，每1升所述水合上樣緩沖液由6mol尿素、2mol 硫脲、40g CHAPS、20mmol-65mmol DTT、5ml pH值范圍為 3-10 的 IPG buffer、1. 25mlpH值范圍為6-11的IPG buffer和水組成；所述DTT具體為20mmol ；上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，所述TCA的丙酮溶液中，TCA的濃度為10% (質(zhì) 量百分含量)；所述浸泡的溫度為_(kāi)20°C，所述浸泡的時(shí)間為2小時(shí)；上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，所述雙向電泳中，第一向是等電聚焦電泳，第二 向是SDS電泳；上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，所述麥谷蛋白亞基為高分子量麥谷蛋白亞基或 低分子量麥谷蛋白亞基；上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，所述待提取物質(zhì)為麥類(lèi)作物的去胚后的種子；上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，所述麥類(lèi)作物為小麥、大麥或黑麥。上述分離麥谷蛋白亞基的方法中，所述小麥的品種為小偃54。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種分離鑒定低分子量麥谷蛋白亞基的方法。本發(fā)明所提供的分離鑒定低分子量麥谷蛋白亞基的方法，包括如下步驟1)用上述任一分離麥谷蛋白亞基的方法得到分離的低分子量麥谷蛋白亞基；2)用胰凝乳蛋白酶酶解所述分離的麥谷蛋白亞基，將得到的產(chǎn)物記作酶解產(chǎn)物；3)將所述酶解產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)；4)根據(jù)所述質(zhì)譜檢測(cè)的結(jié)果，得到所述分離的麥谷蛋白亞基的氨基酸序列。上述分離鑒定低分子量麥谷蛋白亞基的方法中，所述酶解的溫度為30°C，所述酶 解的時(shí)間為4小時(shí)；所述胰凝乳蛋白酶與所述分離的麥谷蛋白亞基的質(zhì)量比為1 50。胰凝乳蛋白酶購(gòu)自Princeton Separations公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為EN-160。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提取麥谷蛋白的方法。本發(fā)明所提供的提取麥谷蛋白的方法，包括如下步驟(1)用TCA的丙酮溶液浸 泡所述待提取物質(zhì)，離心，收集沉淀；(2)從步驟(1)得到的沉淀中提取總蛋白；(3)從步驟 (2)得到的蛋白中去除醇溶蛋白；(4)再用麥谷蛋白提取緩沖液從步驟(3)得到的蛋白中提 取麥谷蛋白，得到麥谷蛋白；所述麥谷蛋白提取緩沖液由異丙醇、Tris-HCl緩沖液、DTT和水組成。上述提取麥谷蛋白的方法中，每升所述麥谷蛋白提取緩沖液由500ml異丙醇、 12. 5ml pH 值為 8. 0 的 Imol Tris-HCl 緩沖液、65mmol DTT 和水組成。上述提取麥谷蛋白的方法中，所述TCA的丙酮溶液中，TCA的濃度為10% (質(zhì)量百 分含量)；所述浸泡的溫度為_(kāi)20°C，所述浸泡的時(shí)間為2小時(shí)；上述提取麥谷蛋白的方法中，所述麥谷蛋白亞基為高分子量麥谷蛋白亞基或低分 子量麥谷蛋白亞基；上述提取麥谷蛋白的方法中，所述待提取物質(zhì)為麥類(lèi)作物的去胚后的種子；所述 麥類(lèi)作物為小麥、大麥或黑麥。上述提取麥谷蛋白的方法中，所述小麥的品種為小偃54。本發(fā)明方法首先在Singh等(1991)提出的麥谷蛋白提取方法(僅使用異丙醇和 Tris堿)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，包括TCA/丙酮沉淀蛋白和省去4-乙烯吡啶修飾，沒(méi)有對(duì) 還原得到的巰基進(jìn)行修飾，而是在蛋白質(zhì)提取以及后續(xù)的分離過(guò)程中，保持緩沖液中足夠 的DDT濃度，維持還原態(tài)的環(huán)境，以達(dá)到防止游離巰基氧化的目的，使之完全適合蛋白質(zhì)雙 向電泳的需要。其次建立了用胰凝乳蛋白酶對(duì)麥谷蛋白進(jìn)行酶切適合質(zhì)譜鑒定的方法。因?yàn)榈头肿恿葵湽鹊鞍字兄貜?fù)區(qū)比較長(zhǎng)，用常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中普遍使用的胰蛋白酶進(jìn) 行酶切切點(diǎn)比較少，得到的肽段比較長(zhǎng)，不適合質(zhì)譜鑒定；而胰凝乳蛋白酶可以識(shí)別氨基酸 F、Y、W、M和L，在LMW-GS序列中有較多的識(shí)別位點(diǎn)，雖然其酶切特異性不高，但實(shí)驗(yàn)中只要 嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，包括酶的用量、酶切時(shí)間等，盡可能地減少非特異酶切，酶切得到的肽 段完全能適合于質(zhì)譜鑒定。比較合適的酶切體系是每個(gè)蛋白點(diǎn)的用酶量為40ng，酶切時(shí)間 為4小時(shí)，反應(yīng)溫度為30°C。本發(fā)明方法具體的提供了適合雙向電泳的低分子量麥谷蛋白的提取和適合質(zhì)譜 鑒定的蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切的技術(shù)方案，解決了小麥低分子量麥谷蛋白亞基的分離鑒定技術(shù)問(wèn) 題，也為同類(lèi)型新的蛋白的分離鑒定提供了一種切實(shí)有效的方法，因此，本發(fā)明方法適合于 推廣應(yīng)用。


圖1為4-乙烯吡啶修飾后的麥谷蛋白經(jīng)過(guò)雙向電泳分離得到的電泳圖譜。圖2為小偃54中麥谷蛋白的SDS-PAGE和2_DE圖譜。A、小偃54中的麥谷蛋白的 SDS-PAGE分析；B、利用pH值范圍為3_10的蛋白質(zhì)雙向電泳分離小偃54中的麥谷蛋白。在 低分子量區(qū)域的蛋白點(diǎn)均集中在電泳圖譜的偏堿性區(qū)域。圖3為小偃54中低分子量麥谷蛋白的2-DE分離圖譜以及質(zhì)譜的鑒定結(jié)果。Ajf 雙向電泳圖譜中的所有60個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-T0F和LC-MS鑒定。1、2、3、5、6、8、9、10-15、 41、42、47、48、33、38 號(hào)圈標(biāo)注的是低分子量麥谷蛋白點(diǎn)，7、16、18、19、20_24、27_29、32、36、 37、39、40、43、44、53、54號(hào)圈標(biāo)注的是醇溶蛋白點(diǎn)，26、51、57號(hào)圈標(biāo)注的是其他類(lèi)型的已 知蛋白，而 58-60、4、17、25、30、31、34、35、45、46、49、50、52、55、56 號(hào)圈標(biāo)注的是未知蛋白； B、對(duì)小偃54中的低分子量麥谷蛋白的SDS-PAGE圖譜。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、小偃54種子中低分子量麥谷蛋白亞基的分離與鑒定小偃54種子購(gòu)自河南舞陽(yáng)縣種子公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為小偃54。一、小偃54種子中麥谷蛋白亞基的提取提取總蛋白1)將一粒去胚的小偃54干種子磨碎(越碎越好)，放入2mL的離心管中，加入 ImL預(yù)冷的10% (質(zhì)量百分含量)TCA的丙酮溶液(TCA溶于丙酮中)，_20°C沉淀2小時(shí)， 15000Xg，4°C離心10分鐘，收集沉淀；2)用預(yù)冷的丙酮(含有0.07% β-巰基乙醇)漂洗 沉淀，_20°C靜置1小時(shí)，15000Xg，4°C離心10分鐘，收集沉淀；3)再用預(yù)冷的80%丙酮水溶液漂洗沉淀，_20°C靜置1小時(shí)，15000 X g，4°C離心10 分鐘，收集沉淀；4)重復(fù)步驟3) —次，在空氣中揮干沉淀，約10-15分鐘；去除醇溶蛋白5)加入800 μ L 50%的異丙醇水溶液，65°C水浴40分鐘，期間震蕩2_3次，使其中的粉末懸浮，15000 Xg離心10分鐘，棄上清，收集沉淀；6)重復(fù)步驟5)三次；提取麥谷蛋白7)向沉淀中加入300 μ L麥谷蛋白提取液(每1升所述麥谷蛋白提取液由500ml 異丙醇、12. 5ml pH值為8. 0的IM Tris-HCl緩沖液、IOg (即65mmol) DTT (二硫蘇糖醇)和 水組成，用水補(bǔ)足體積)，65°C水浴50分鐘，期間震蕩幾次，15000 Xg離心10分鐘，吸取上
清到一新管中；8)重復(fù)步驟7) —次；沉淀麥谷蛋白9)收集所有上清液，加入3倍體積的冰丙酮，-20°C靜置過(guò)夜，15000 Xg離心10分
鐘，棄上清；10)加入1.6mL丙酮(含有0.07% β -巰基乙醇)漂洗沉淀，_20°C靜置30分鐘， 15000 Xg離心10分鐘，棄上清；11)重復(fù) 10) —次；12)加入1. 6mL 80%丙酮漂洗沉淀，_20°C靜置30分鐘，15000Xg離心10分鐘，
棄上清；13)在空氣中揮干沉淀，約10-15分鐘；制備蛋白上樣液14)加入500 μ L水合緩沖液(每升所述水合上樣緩沖液由6mol尿素、2mol硫脲、 40g CHAPS(3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽)、3. Ig DTT(相當(dāng)于20mmol的 DTT) ,5ml pH 值范圍為 3-10 的 IPG buffer、1. 25ml pH 值范圍為 6-11 的 IPG buffer 和水 組成，水補(bǔ)足體積)，室溫下震蕩1小時(shí)，15000Xg室溫下離心10分鐘，取上清液，利用2D Quant Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，等待上樣或者分 裝后-80°C保存。二、小偃54種子中低分子量麥谷蛋白亞基的分離(一)蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)第一向電泳——等電聚焦禾Ij用 24cm 的 pH 范圍為 3-10 的 IPG (Immobilized pH gradient)膠條(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)，在 Ettan IPGphorII IEF 上進(jìn)行等電聚焦。1)根據(jù)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定結(jié)果，吸取500 μ g麥谷蛋白，用水合緩沖液補(bǔ)加到 460 μ L，混勻，18，OOOxg室溫離心5分鐘；2)吸取450μ L麥谷蛋白溶液均勻分布到等電聚焦電泳槽中，緩緩放上IPG膠條， 避免產(chǎn)生氣泡，均勻覆蓋硅油。3) IPG膠條在電場(chǎng)作用下進(jìn)行水化，30V，6小時(shí)，然后60V，6小時(shí)；4)進(jìn)行等電聚焦電泳，維持系統(tǒng)溫度為20°C，具體程序如下200V 1. 5h， 500V1. 5h, 1000V 2h, Gradient 8000V 3h，最后穩(wěn)定在 8000V 約 8h，總共達(dá)到 75，OOOVhs，停
止電泳。5)將IPG膠條取出，吸凈硅油，放在-80°C保存，或者繼續(xù)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。第二向電泳-SDS-PAGE
6)完成等電聚焦的IPG膠條浸在2-DE平衡緩沖液(50mM Tris-Cl pH8. 8，6M尿 素，30%甘油，2% SDS，微量溴酚藍(lán))中，加入2% (w/v)DTT，搖床上輕輕震蕩15分鐘；7)用蒸餾水沖洗IPG膠條，將IPG膠條浸在2-DE平衡緩沖液(50mM Tris-ClpH8.8，6M尿素，30%甘油，2%SDS，微量溴酚藍(lán))中，加入2. 5% (w/v)碘代乙酰胺， 搖床上輕輕震蕩15分鐘；8)用蒸餾水沖洗IPG膠條，將膠條放在已經(jīng)配制好的聚丙烯酰胺凝膠上，并用 0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖(用電泳緩沖液和微量溴酚藍(lán)配制，在微波爐里熔解)將IPG膠條進(jìn) 行固定，避免存在氣泡，待瓊脂糖凝固后，進(jìn)行SDS-PAGE。9) 15°C恒溫電泳，最初30分鐘，恒定功率為0. 5ff/gel電泳，然后調(diào)整為4W/gel，過(guò) 夜，至溴酚藍(lán)指示劑離開(kāi)凝膠后約30分鐘，停止電泳。蛋白凝膠的固定、染色、脫色1)電泳結(jié)束后，小心取下凝膠，用固定液(40%乙醇，10%冰乙酸)固定1小時(shí)；2)倒掉固定液，用蒸餾水沖洗2遍；3)加入配制好的染色液(10%硫酸銨，10%磷酸，0. 12%考馬斯亮藍(lán)6250，20%甲 醇)，搖床80轉(zhuǎn)/分鐘，搖動(dòng)過(guò)夜(10小時(shí)以上)；4)觀察蛋白條帶染色清楚后，將染色液倒到廢液瓶中，統(tǒng)一處理；5)用脫色液(10%乙醇，7%冰乙酸)漂洗凝膠5分鐘，倒掉脫色液，用蒸餾水漂洗 2次，再用蒸餾水浸泡凝膠，搖床上搖動(dòng)2小時(shí)，期間換兩次蒸餾水；6)在掃描儀(UMAX PowerLook 1120)上，掃描凝膠并保存圖片。7)將蛋白凝膠用保鮮膜包裹于4°C保存或直接用于挖取蛋白點(diǎn)作膠內(nèi)酶切。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。得到的膠圖如圖2B所示。
(二)麥谷蛋白的SDS-PAGE分析將實(shí)驗(yàn)一提取得到的麥谷蛋白直接進(jìn)行SDS-PAGE。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如圖 2A所示。圖2表明，本發(fā)明提取的麥谷蛋白中，在低分子量區(qū)域的蛋白點(diǎn)均集中在電泳圖 譜的偏堿性區(qū)域。(三)按照Singh等(1991)方法提取和分離麥谷蛋白按照文獻(xiàn)(A simplified SDS-PAGE procedure for separating LMW-subunits of glutenin, Singh NK, Sh印herd Kff, Cornish GB. 1991，J Cereal Sci)中所述方法提取 麥谷蛋白，具體方法與實(shí)驗(yàn)一中所述一致，不同之處在于沒(méi)有第1)驟。按照實(shí)驗(yàn)二(一)中所述方法進(jìn)行電泳，不同之處在于所用的水合上樣緩沖液中 不含有DTT而是用4-VP取代DTT，具體如下每升水合上樣緩沖液由6mol尿素、2mol硫脲、 40g CHAPSU4g 4-VP、5ml pH 值范圍為 3-10 的 IPG buffer、1. 25ml pH 值范圍為 6-11 的 IPG buffer和水組成，水補(bǔ)足體積。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。得到的膠圖如圖1所示。圖1和圖2比較看出，本發(fā)明方法使低分子量麥谷蛋白亞基在膠中分離效果更好， 而Singh等的方法中低分子量麥谷蛋白亞基大部分聚集在一起，沒(méi)有被充分分離，本發(fā)明 方法的分離效果好。三、低分子量麥谷蛋白亞基膠內(nèi)酶切回收及質(zhì)譜鑒定
胰凝乳蛋白酶購(gòu)自Princeton Separations公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為EN-160。(一)酶切各個(gè)低分子量麥谷蛋白亞基1)將目標(biāo)蛋白點(diǎn)切下(圖3，圖3是圖2的一部分)，在100 μ L水中漂洗20分鐘。2)吸掉水，加入100 μ L蛋白點(diǎn)凝膠脫色液(50% CAN，50mM NH4HCO3)，搖床上震蕩， 至脫色完全，約需5小時(shí)；3)加入50 μ L乙腈靜置10分鐘，將膠塊脫水；4)用冷凍干燥機(jī)干燥膠塊，約30分鐘；5)加入 50 μ L 的凝膠蛋白點(diǎn)還原劑(50mM NH4HCO3, 20mM DTT)，60°C，1 小時(shí)；6)棄液體，靜置至室溫，加入50 μ L乙腈，靜置10分鐘，將膠塊脫水；7)棄液體，空氣干燥5分鐘，加入50μ L凝膠蛋白點(diǎn)烷基化劑(50mM NH4HCO3, 55mM 碘代乙酰胺)，37 °C避光靜置30分鐘；8)棄液體，用50 μ L 50mM碳酸氫銨溶液洗3次；9)加入50 μ L乙腈脫水，棄液體；10)在冷凍干燥機(jī)中將蛋白點(diǎn)凝膠塊干燥；11)酶解向膠塊中加入胰凝乳蛋白酶，酶濃度為20ng/ μ L，加入2 μ L，(即胰凝乳 蛋白酶與低分子量蛋白亞基的質(zhì)量比為1 50)，在4°C使膠塊吸脹。12)將管子倒置，30°C空氣浴，酶切4小時(shí)；13)用水將膠塊瞬時(shí)漂洗一次，洗掉反應(yīng)體系中的鹽離子；14)加入IOyL 5%三氟乙酸提取肽段，37°C倒置1小時(shí)，將液體轉(zhuǎn)移到一干凈離 心管中；15)每膠塊再加入10 μ L 2. 5%三氟乙酸/50%乙腈，30°C倒置1小時(shí)，吸取液體與 前一次的提取液合并；16)真空濃縮肽段提取液，得到酶解肽段提取物；17)在_20°C中存放，在質(zhì)譜檢測(cè)前，加入2μ L 0. 5%的三氟乙酸水溶液溶解酶解 肽段提取物，將得到的溶液記作酶解肽段提取物的溶液。(二)質(zhì)譜檢測(cè)MALDI-TOF MS吸取1 μ L 酶解肽段提取物的溶液與 1 μ L CHCA ( α -Cyano-4-hydroxycinnamic acid, Sigma-Aldrich, MO, USA)基質(zhì)溶液混合，取1 μ L點(diǎn)樣到樣品板上。利用Bruker Autoflex 質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics, MA, USA)檢測(cè) m/z 為 900-3500 的帶電離子，保存得 到的譜圖。利用軟件Biotools 2. 1 (Bruker Daltonics, MA, USA)和在線程序Mascot檢索 NCBInr (other green plant)數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索參數(shù)如下0. 15-0. 5Da的質(zhì)量數(shù)偏差，允許存在 1個(gè)非徹底酶切位點(diǎn)，固定修飾為C(Cys)烷基化，可變修飾為M(Met)的氧化。根據(jù)軟件的 統(tǒng)計(jì)方法判斷選取可信的檢索結(jié)果1。LC-MS/MS利用LCQ deca XP plus 離子胼質(zhì)譜(Thermo Finnigan, MA, USA)進(jìn)行 LC-MS/MS 檢測(cè)。將酶解肽段提取物的溶液用15yL 0.5%的甲酸水溶液稀釋?zhuān)M(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，采集檢 測(cè)結(jié)果。利用軟件Bioworks 3.1分析檢測(cè)結(jié)果。鑒定結(jié)果如表1所示?！癕ALDI-TOF MS或LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定的肽段”表示每一種低分子量麥谷蛋白亞基的特征肽段序列。蛋白點(diǎn)表示圖3所示膠圖上的蛋白點(diǎn)。a理論分 子量與等電點(diǎn)的計(jì)算是通過(guò)在線軟件Compute ρ I/Mw tool講行的(http://w驟.expasy. ch/tools/pitool, html)。對(duì)于每一種低分子量麥谷蛋白亞基，兩種質(zhì)譜的鑒定結(jié)果一致。本發(fā)明方法利用過(guò)量的DTT作為還原劑取代VP修飾，一方面沒(méi)有修飾二硫鍵不會(huì) 改變蛋白的等電點(diǎn)，同時(shí)還能防止巰基氧化；而利用胰凝乳蛋白酶可以將含有較多重復(fù)序 列的麥谷蛋白酶解成較多大小適合質(zhì)譜鑒定的肽段，因此對(duì)小麥低分子量麥谷蛋白的分離 鑒定效果很好。表1、各蛋白點(diǎn)的鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
一種分離麥谷蛋白亞基的方法，包括如下步驟將待分離的麥谷蛋白進(jìn)行雙向電泳，得到分離的麥谷蛋白亞基；所述雙向電泳中，進(jìn)行電泳的上樣液是用含有DTT的水合上樣緩沖液溶解所述待分離的麥谷蛋白得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述DTT在所述水合上樣緩沖液中的濃 度為 20mM-65mM，具體為 65mM 或 20mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述待分離的麥谷蛋白是按照包括 如下步驟的方法提取得到的(1)從待提取物質(zhì)中提取總蛋白；(2)從步驟(1)得到的蛋白 中去除醇溶蛋白；(3)再用麥谷蛋白提取緩沖液從步驟(2)得到的蛋白中提取麥谷蛋白，得 到麥谷蛋白；所述麥谷蛋白提取緩沖液由異丙醇、Tris-HCl緩沖液、DTT和水組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述待分離的麥谷蛋白的提取 方法中，在所述步驟(1)之前，包括如下步驟用TCA的丙酮溶液浸泡所述待提取物質(zhì)，離 心，收集沉淀，從沉淀中提取總蛋白；所述水合上樣緩沖液由尿素、硫脲、CHAPS、DTT、pH值為3_10的IPG buffer、pH值為 6-11的IPG buffer和水組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于每升所述麥谷蛋白提取緩沖液 由500ml異丙醇、12. 5ml pH值為8. 0的IM Tris-HCl緩沖液、65mmol DTT和水組成；每1升所述水合上樣緩沖液由6mol尿素、2mol硫脲、40g CHAPS、20mmol-65mmolDTT、 5ml pH 值為 3-10 的 IPG buffer、1. 25mlpH 值為 6-11 的 IPG buffer 和水組成；所述 DTT 具 體為 20mmol ；所述TCA的丙酮溶液中，TCA的濃度為10% (質(zhì)量百分含量)；所述浸泡的溫度 為-20°C，所述浸泡的時(shí)間為2小時(shí)；所述雙向電泳中，第一向是等電聚焦電泳，第二向是SDS電泳；所述麥谷蛋白亞基為高分子量麥谷蛋白亞基或低分子量麥谷蛋白亞基；所述待提取物質(zhì)為麥類(lèi)作物的去胚后的種子；所述麥類(lèi)作物為小麥、大麥或黑麥。
6.一種分離鑒定低分子量麥谷蛋白亞基的方法，包括如下步驟1)用權(quán)利要求1-5中任一所述的方法得到分離的低分子量麥谷蛋白亞基；2)用胰凝乳蛋白酶酶解所述分離的低分子量麥谷蛋白亞基，將得到的產(chǎn)物記作酶解產(chǎn)物；3)將所述酶解產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)；4)根據(jù)所述質(zhì)譜檢測(cè)的結(jié)果，得到所述分離的低分子量麥谷蛋白亞基的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述酶解的溫度為30°C，所述酶解的時(shí)間 為4小時(shí)；所述胰凝乳蛋白酶與所述分離的低分子量麥谷蛋白亞基的質(zhì)量比為1 50。
8.一種提取麥谷蛋白的方法，包括如下步驟(1)用TCA的丙酮溶液浸泡所述待提取物 質(zhì)，離心，收集沉淀；(2)從步驟(1)得到的沉淀中提取總蛋白；(3)從步驟(2)得到的蛋白 中去除醇溶蛋白；(4)再用麥谷蛋白提取緩沖液從步驟(3)得到的蛋白中提取麥谷蛋白，得 到麥谷蛋白；所述麥谷蛋白提取緩沖液由異丙醇、Tris-HCl緩沖液、DTT和水組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于每升所述麥谷蛋白提取緩沖液由500ml 異丙醇、12. 5ml pH值為8. 0的Imol Tris-HCl緩沖液、65mmol DTT和水組成；所述TCA的丙酮溶液中，TCA的濃度為10% (質(zhì)量百分含量)；所述浸泡的溫度 為-20°C，所述浸泡的時(shí)間為2小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述待提取物質(zhì)為麥類(lèi)作物的去胚 后的種子；所述麥類(lèi)作物為小麥、大麥或黑麥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種低分子量麥谷蛋白亞基的提取分離鑒定方法。該分離麥谷蛋白亞基的方法，包括如下步驟將待分離的麥谷蛋白進(jìn)行雙向電泳，得到分離的麥谷蛋白亞基；所述雙向電泳中，進(jìn)行電泳的上樣液是用含有DTT的水合上樣緩沖液溶解所述待分離的麥谷蛋白得到的。本發(fā)明方法具體的提供了適合雙向電泳的低分子量麥谷蛋白的提取和適合質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切的技術(shù)方案，解決了小麥低分子量麥谷蛋白亞基的分離鑒定技術(shù)問(wèn)題，也為同類(lèi)型新的蛋白的分離鑒定提供了一種切實(shí)有效的方法，因此，本發(fā)明方法適合于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101891799SQ201010211730
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者劉冬成, 孫家柱, 張愛(ài)民, 張相岐, 張肖飛, 王道文, 郭小麗, 陽(yáng)文龍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所