專利名稱：長(zhǎng)雙歧桿菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹瀉中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)雙歧桿菌的應(yīng)用，尤其涉及一種長(zhǎng)雙歧桿菌粘附抑制蛋白Aip 在防治腹瀉中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類胃腸道寄居的400余種腸內(nèi)菌群，這些微生物菌群通過(guò)群體感應(yīng)來(lái)保持相對(duì) 數(shù)量，相互競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間，發(fā)揮其生理功能。近年來(lái)，食源性致病菌(單核增生李斯特菌、 大腸桿菌0157等)引起的疾病爆發(fā)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。這些致病菌通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體胃腸道， 粘附腸粘膜后擴(kuò)增繁殖，入侵腸上皮細(xì)胞，被單核巨噬細(xì)胞吞噬，并隨之?dāng)U散到局部淋巴 結(jié)，最后到達(dá)內(nèi)臟器官，從而引起疾病的發(fā)生，如單核增生李斯特菌是自然界存在的一種強(qiáng) 致病菌，100個(gè)CFU就能導(dǎo)致死亡。粘附是腸道致病菌引發(fā)腹瀉的前提，抑制致病菌的粘附，使之成為過(guò)路菌被排出 體外，讓其喪失在腸道繁殖的條件，從而達(dá)到防治腹瀉的目的。雙歧桿菌在體外與致病菌競(jìng) 爭(zhēng)黏附上皮細(xì)胞中處于一定的優(yōu)勢(shì)。Moroni等發(fā)現(xiàn)在與雙歧桿菌競(jìng)爭(zhēng)黏附過(guò)程中，弱入侵 型、中等入侵型和強(qiáng)入侵型的單核增生李斯特菌的侵襲力下降了 38-90%不等，并且雙歧桿 菌與單層細(xì)胞的預(yù)孵育能顯著抑制單核增生李斯特菌對(duì)細(xì)胞的粘附。鐘世順等報(bào)道雙歧桿 菌分泌型黏附素(10-30 μ g/ml)的30min預(yù)孵育能明顯抑制產(chǎn)毒大腸桿菌或腸出血大腸桿 菌對(duì)Lovo細(xì)胞的黏附。益生菌與致病菌競(jìng)爭(zhēng)共同黏附位點(diǎn)，導(dǎo)致空間占位效應(yīng)，是益生菌抑制致病菌黏 附的重要方式。asialo-GMl是致病菌及非致病菌黏附人類及動(dòng)物粘膜表面的重要糖類物 質(zhì)，約氏乳桿菌Lal對(duì)腸致病性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌的抑制作用即源于其占據(jù)了 致病菌的黏附位點(diǎn)。Mukai等發(fā)現(xiàn)路氏乳桿菌和幽門(mén)螺桿菌菌競(jìng)爭(zhēng)相同的糖基位點(diǎn)，路氏乳 桿菌的黏附占據(jù)腸上皮細(xì)胞的黏附位點(diǎn)后導(dǎo)致幽門(mén)螺桿菌失去黏附位點(diǎn)而被排出體外。因 此，腸道細(xì)胞表面糖類物質(zhì)作為益生菌和致病菌的共同定向結(jié)合位點(diǎn)在抑菌機(jī)理中起著重 要的作用。另一方面，益生菌通過(guò)與致病菌競(jìng)爭(zhēng)糖基的不同部位，起到空間排阻的效果，達(dá) 到抑制致病菌的目的。大腸桿菌I型偏好黏附上皮細(xì)胞中的甘露糖α 1-3甘露糖位點(diǎn)，此 位點(diǎn)并不是某些約氏乳桿菌菌株的黏附位點(diǎn)，約氏乳桿菌對(duì)于大腸桿菌I型的抑制是可能 是由于其占據(jù)上述位點(diǎn)的附近糖基位點(diǎn)，引起菌體的空間排阻效應(yīng)，而影響致病菌的結(jié)合。目前治療腹瀉普遍采用的是抗生素療法，抗生素有一定副作用，同時(shí)可能導(dǎo)致耐 藥株的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步增加治療難度。近年來(lái)，人們?cè)谘芯刻娲股刂委煾篂a方面做了 大量的工作，尤其是通過(guò)益生菌來(lái)預(yù)防和治療致病菌引起的感染，更是目前研究的熱點(diǎn)。益 生菌通過(guò)黏附、競(jìng)爭(zhēng)、排斥、占位及產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等機(jī)制，抑制胃腸道內(nèi)的致病菌，保持原籍 菌群的優(yōu)勢(shì)，從而促進(jìn)人體和動(dòng)物體的健康。本發(fā)明就是通過(guò)來(lái)源長(zhǎng)雙歧桿菌的粘附抑制 蛋白Aip競(jìng)爭(zhēng)致病菌在腸道細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，阻抑致病菌粘附腸道，達(dá)到防治腹瀉的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種長(zhǎng)雙歧桿菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹瀉中的應(yīng)用， Aip具有較強(qiáng)的抑制致病菌粘附腸上皮細(xì)胞的能力，且不影響益生菌的粘附功能，使用安 全、無(wú)殘留、不產(chǎn)生抗藥性。本發(fā)明是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其特征是粘附抑制蛋白Aip阻抑致病菌粘附定植于腸 道，而不影響益生菌的粘附，從而防治致病菌引發(fā)的腹瀉，維持腸道微生態(tài)平衡。所述的粘附抑制蛋白Aip的制備方法為(1)將新鮮培養(yǎng)的長(zhǎng)雙歧桿菌按接入300mL MRS液體培養(yǎng)基，37°C、厭氧培養(yǎng) 16-18h，8000rpm離心3min，收集發(fā)酵液上清；(2)分別按照15%和75%飽和度用硫酸銨分級(jí)沉淀上清，最后沉淀用20mLPBS重 懸，脫鹽，真空冷凍干燥；(3)取Iml 0. 5mg/ml的粗蛋白用預(yù)裝離子柱Hitrap Q FF進(jìn)行離子交換層析，首 先用起始緩沖液平衡層析柱，所述的起始緩沖液為0. 025mol/L磷酸鉀緩沖液和0. OOlmol/ L EDTA的混合物并調(diào)節(jié)pH為8. 0，用洗脫緩沖液進(jìn)行線性濃度梯度洗脫，流速為lml/min， 分別收集各洗脫峰，電泳檢測(cè)，確定目的峰所在，所述的洗脫緩沖液為0. 025mol/L磷酸鉀 緩沖液、lmol/L氯化鉀和0. 001mol/L EDTA的混合物并調(diào)節(jié)pH為8. 0 ；(4)收集的目的峰再用分子篩柱HitrapSuperdeX75進(jìn)行分離，流動(dòng)相為 Millipore超純水，流速為0. 5ml/min，收集各流出峰，電泳檢測(cè)，確定目的峰所在。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可以克服副作用大和耐藥性，粘附抑制蛋白Aip制備成防治腹 瀉的功能性產(chǎn)品，并不殺死致病菌本身，而是阻抑其粘附胃腸道，使之失去定植復(fù)制的條 件，被排出體外，故而安全可靠，也不純?cè)谀退幮赞D(zhuǎn)移等問(wèn)題，是治療腹瀉的新思路。


圖1為本發(fā)明從長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵液中分離純化Aip的電泳檢測(cè)圖譜圖2為本發(fā)明Aip的核酸序列與氨基酸序列。圖3為本發(fā)明構(gòu)建Aip表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證圖。圖4為本發(fā)明基因工程表達(dá)與純化Aip的電泳檢測(cè)圖譜。圖5為本發(fā)明驗(yàn)證Aip粘附腸上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)圖。圖6為本發(fā)明顯微鏡觀察Aip抑制單核增生李斯特菌粘附腸上皮細(xì)胞圖。圖7為本發(fā)明顯微鏡觀察Aip抑制大腸桿菌0157:H7粘附腸上皮細(xì)胞圖。圖8為本發(fā)明活菌計(jì)數(shù)測(cè)定Aip抑制單核增生李斯特菌粘附腸上皮細(xì)胞圖。圖9為本發(fā)明活菌計(jì)數(shù)測(cè)定Aip抑制大腸桿菌0157:H7粘附腸上皮細(xì)胞圖。圖10為本發(fā)明活菌計(jì)數(shù)測(cè)定Aip對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌粘附腸上皮細(xì)胞的影響圖。圖11為本發(fā)明活菌計(jì)數(shù)測(cè)定Aip對(duì)植物乳桿菌粘附腸上皮細(xì)胞的影響圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 1.將新鮮培養(yǎng)的長(zhǎng)雙歧桿菌按接入300mL MRS液體培養(yǎng)基，37°C、厭氧培養(yǎng) 16-18h，8000rpm離心3min，收集發(fā)酵液上清。
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2.分別按照15%和75%飽和度用硫酸銨分級(jí)沉淀上清，最后沉淀用20mLPBS重 懸，脫鹽，真空冷凍干燥。3.取Iml 0. 5mg/ml的粗蛋白用預(yù)裝離子柱Hitrap Q FF進(jìn)行離子交換層析。首 先用起始緩沖液(0.025mol/L磷酸鉀緩沖液，O.OOlmol/L EDTA，pH8. 0)平衡層析柱，用洗 脫緩沖液(0.025mol/L磷酸鉀緩沖液，lmol/L氯化鉀，O.OOlmol/L EDTA, pH8. 0)進(jìn)行線性 濃度梯度洗脫，流速為lml/min，分別收集各洗脫峰，電泳檢測(cè)，確定目的峰所在。4.收集的目的峰再用分子篩柱HitrapSuperdex75進(jìn)行分離，流動(dòng)相為MiIlipore 超純水，流速為0. 5ml/min，收集各流出峰，電泳檢測(cè)，確定目的峰所在。各純化步驟中Aip 的SDS-PAGE圖譜如圖1所示，為45kD左右的蛋白，1為蛋白Marker (14_94kDa) ；2為過(guò)完 分子篩柱后的蛋白樣品；3為過(guò)完離子柱后的蛋白樣品；4為硫酸銨分級(jí)沉淀的蛋白樣品。實(shí)施例2 1.按實(shí)施例1中的方法培養(yǎng)長(zhǎng)雙歧桿菌，提取基因組DNA。根據(jù)GenBank里的序 列設(shè)計(jì)引物 Aip-up -GCGAATTCATGACAGTTAAGATTGGTATCAACGG-3~)和 Aip-down -CCGC GGCCGCTCACTCGGAGATCTCAGCGA-3、)，擴(kuò)增Aip基因，基因序列及蛋白序列如圖2所示。2.把擴(kuò)增的基因用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切處理后，與同樣雙酶切的表 達(dá)載體pGEX-4T-l連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pAip-G4，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取陽(yáng)性克隆，驗(yàn) 證并測(cè)序，如圖 3 所示，1 為 pGEX-BIF(EcoR land Not I digested) ；2 為 DL2000DNA Marker.3.取新鮮培養(yǎng)的測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌，按接菌量接入300ml LB培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)至OD600 = 0. 4-0. 6，加入0. 5mM IPTG，25°C誘導(dǎo)表達(dá)。4500rpm離心5min收集菌體后， PBS洗滌菌體三遍。30ml裂解緩沖液(PBS+2mM EDTA)重懸菌體，超聲波破碎后，13000rpm 離心lOmin，取上清。同時(shí)以帶pGEX-4T-l的大腸桿菌DH5ci作為對(duì)照進(jìn)行操作。4. 20ml的A緩沖液(PBS+2mM EDTA)進(jìn)行谷胱甘肽樹(shù)脂預(yù)裝柱GSTrapFF的平衡， 流速3ml/min。待曲線平穩(wěn)后，取破碎后的上清上樣，流速0. 5-lml/min。7.待曲線下降平穩(wěn)后，用B緩沖液(PBS+2mM EDTA+10mM谷胱甘肽)將目的蛋白洗 脫，流速lml/min，收集洗脫峰。8.超濾管濃縮洗脫液，過(guò)脫鹽柱Hitrap desalting,純水洗脫，流速3ml/min，取 洗脫峰，真空冷凍干燥后，取部分溶解進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，見(jiàn)圖4，1為pGEX_BIF表 達(dá)蛋白；2為pGEX-4T-l表達(dá)蛋白(對(duì)照)；3、純化的Aip表達(dá)蛋白；4為Blue Plus蛋白 Marker(12kDa-94kDa)實(shí)施例3 1.按實(shí)施例2中的方法純化到的Aip，采用活潑酯法，取2μ M量子點(diǎn)(CdSe/ZnS Core/Shell, Emission = 620nm)用磷酸二氫鈉-HCl 緩沖液(0. 2M，pH 5. 0)重懸，加入 1. 52mg 碳二亞胺(carbodiimide, EDAC)禾口 0. 86mgN_hydroxysulfosuccinimide (Suflo-NH S)，25°C 反應(yīng) 40min。2.用恥0!1調(diào)？!1至7.8，加入六丨？融合蛋白11^，251反應(yīng)311后，41放置過(guò)夜。 IOOOOrpm 離心 IOmin 取上清后，再 40000rpm( = 100，000g) for30min，取沉淀，用 500 μ LPBS 溶液溶解，4°C保存待用。同樣方法標(biāo)記GST蛋白作為對(duì)照。3.取95 μ L腸上皮細(xì)胞HT-29 (IO4個(gè)/mL)與5 μ L與量子點(diǎn)標(biāo)記的Aip蛋白混勻 后，37°C孵育2h后，3000rpm離心5min，取沉淀，洗滌三遍后，100 μ LPBS重懸。
4.取5 μ L混合液點(diǎn)于載玻片上，熒光顯微鏡下450nm激發(fā)觀察發(fā)現(xiàn)Aip蛋白能夠 粘附腸上皮細(xì)胞，如圖5所示，A為標(biāo)記量子點(diǎn)的GST ；B為標(biāo)記量子點(diǎn)的Aip。量子點(diǎn)標(biāo)記 的GST蛋白作為對(duì)照。實(shí)施例4 1.按實(shí)施例2中的方法純化到的4丨？，取5(^1^腸上皮細(xì)胞肌-29(104個(gè)/1^)與 50 μ L30 μ g/mL Aip融合蛋白，混勻后，37 °C孵育2h。2. 3000rpm離心5min，取沉淀，洗滌三遍后，30 μ LPBS重懸，涂布載玻片表面，陰干 后，加熱固定，加入3% BSA溶液封閉lh。3.洗滌干凈后，取新鮮培養(yǎng)的單核增生李斯特菌液滴加于固定的細(xì)胞表面，37°C 孵育Ih后，洗去未結(jié)合的菌體，進(jìn)行革蘭氏染色，再顯微觀察。GST蛋白作為對(duì)照進(jìn)行同樣 地處理。發(fā)現(xiàn)經(jīng)Aip處理的腸上皮細(xì)胞后，單核增生李斯特菌結(jié)合的數(shù)量明顯比對(duì)照少，如 圖6所示，A為Aip ；B為GST。實(shí)施例5 1.按實(shí)施例2中的方法純化到的4丨？，取5(^1^腸上皮細(xì)胞肌-29(104個(gè)/1^)與 50 μ L30 μ g/mL Aip融合蛋白，混勻后，37 °C孵育2h。2. 3000rpm離心5min，取沉淀，洗滌三遍后，30 μ LPBS重懸，涂布載玻片表面，陰干 后，加熱固定，加入3% BSA溶液封閉lh。3.洗滌干凈后，取新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌0157:H7菌液滴加于固定的細(xì)胞表面， 37°C孵育Ih后，洗去未結(jié)合的菌體，進(jìn)行革蘭氏染色，再顯微觀察。GST蛋白作為對(duì)照進(jìn)行 同樣地處理。發(fā)現(xiàn)經(jīng)Aip處理的腸上皮細(xì)胞后，大腸桿菌0157:H7結(jié)合的數(shù)量明顯比對(duì)照 少，如圖7所示，A為Aip ;B為GST。實(shí)施例6 1.按實(shí)施例2中的方法純化到的4丨？，取5(^1^腸上皮細(xì)胞肌-29(104個(gè)/1^)與 50 μ L不同濃度的Aip融合蛋白(5，30，50 μ g/mL)混勻后，37°C孵育2h。2. 3000rpm離心5min，取沉淀，洗滌三遍后，30 μ LPBS重懸，涂布于甲醇活化的 PVDF膜上(IX 1.5cm2)，陰干后，加入3% BSA溶液中封閉Ih，PBST洗膜三遍。3.同時(shí)取新鮮培養(yǎng)的單核增生李斯特菌液稀釋至IO4個(gè)/mL后，取500 μ L與處理 過(guò)的膜37°C孵育30min，取出膜，剩余的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。GST蛋白作為對(duì)照進(jìn)行同樣地 處理。4.按照下列公式計(jì)算粘附抑制率粘附抑制率(％ )=(總菌體_剩余菌體)X 100/總菌體結(jié)果制成圖8，顯示隨著Aip蛋白濃度增加，抑制單核增生李斯特菌的效果加強(qiáng)。實(shí)施例7 1.按實(shí)施例2中的方法純化到的4丨？，取5(^1^腸上皮細(xì)胞肌-29(104個(gè)/1^)與 50 μ L不同濃度的Aip融合蛋白(5，30，50 μ g/mL)混勻后，37°C孵育2h。2. 3000rpm離心5min，取沉淀，洗滌三遍后，30 μ LPBS重懸，涂布于甲醇活化的 PVDF膜上(IX 1.5cm2)，陰干后，加入3% BSA溶液中封閉Ih，PBST洗膜三遍。3.同時(shí)取新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌0157:H7菌液稀釋至IO4個(gè)/mL后，取500yL與處 理過(guò)的膜37°C孵育30min，取出膜，剩余的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。GST蛋白作為對(duì)照進(jìn)行同樣地處理。4.按照下列公式計(jì)算粘附抑制率粘附抑制率(％ )=(總菌體_剩余菌體)X 100/總菌體結(jié)果制成圖9，顯示隨著Aip蛋白濃度增加，抑制大腸桿菌0157:H7的效果加強(qiáng)。實(shí)施例8 1.按實(shí)施例2中的方法純化到的4丨？，取5(^1^腸上皮細(xì)胞肌-29(104個(gè)/1^)與 50 μ L不同濃度的Aip融合蛋白(5，30，50μ g/mL)混勻后，37°C孵育2h。2. 3000rpm離心5min，取沉淀，洗滌三遍后，30 μ LPBS重懸，涂布于甲醇活化的 PVDF膜上(IX 1.5cm2)，陰干后，加入3% BSA溶液中封閉Ih，PBST洗膜三遍。3.同時(shí)取新鮮培養(yǎng)的長(zhǎng)雙歧桿菌液稀釋至IO4個(gè)/mL后，取500 μ L與處理過(guò)的膜 37°C孵育30min，取出膜，剩余的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。GST蛋白作為對(duì)照進(jìn)行同樣地處理。4.按照下列公式計(jì)算粘附抑制率粘附抑制率(％ )=(總菌體_剩余菌體)X 100/總菌體結(jié)果制成圖10，顯示Aip蛋白不影響長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附。實(shí)施例9:1.按實(shí)施例2中的方法純化到的4丨？，取5(^1^腸上皮細(xì)胞肌-29(104個(gè)/1^)與 50 μ L不同濃度的Aip融合蛋白(5，30，50 μ g/mL)混勻后，37°C孵育2h。2.3000印111離心51^11，取沉淀，洗滌三遍后，3(^1^ PBS重懸，涂布于甲醇活化的 PVDF膜上(IX 1.5cm2)，陰干后，加入3% BSA溶液中封閉Ih，PBST洗膜三遍。3.同時(shí)取新鮮培養(yǎng)的植物乳桿菌液稀釋至IO4個(gè)/mL后，取500 μ L與處理過(guò)的膜 37°C孵育30min，取出膜，剩余的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。GST蛋白作為對(duì)照進(jìn)行同樣地處理。4.按照下列公式計(jì)算粘附抑制率粘附抑制率(％ )=(總菌體_剩余菌體)X 100/總菌體結(jié)果制成圖11，顯示Aip蛋白不影響植物乳桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附。
權(quán)利要求
一種長(zhǎng)雙歧桿菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹瀉中的應(yīng)用，其特征是粘附抑制蛋白Aip阻抑致病菌粘附定植于腸道，而不影響益生菌的粘附，從而防治致病菌引發(fā)的腹瀉，維持腸道微生態(tài)平衡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)雙歧桿菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹瀉中的應(yīng)用，其特征 是所述的粘附抑制蛋白Aip的制備方法為(1)將新鮮培養(yǎng)的長(zhǎng)雙歧桿菌按接入300mLMRS液體培養(yǎng)基，37°C、厭氧培養(yǎng) 16-18h，8000rpm離心3min，收集發(fā)酵液上清；(2)分別按照15%和75%飽和度用硫酸銨分級(jí)沉淀上清，最后沉淀用20mLPBS重懸，脫 鹽，真空冷凍干燥；(3)取Iml0.5mg/ml的粗蛋白用預(yù)裝離子柱Hitrap Q FF進(jìn)行離子交換層析，首先 用起始緩沖液平衡層析柱，所述的起始緩沖液為0. 025mol/L磷酸鉀緩沖液和0. 001mol/L EDTA的混合物并調(diào)節(jié)pH為8. 0，用洗脫緩沖液進(jìn)行線性濃度梯度洗脫，流速為lml/min，分 別收集各洗脫峰，電泳檢測(cè)，確定目的峰所在，所述的洗脫緩沖液為0. 025mol/L磷酸鉀緩 沖液、lmol/L氯化鉀和0. 001mol/L EDTA的混合物并調(diào)節(jié)pH為8. 0 ；(4)收集的目的峰再用分子篩柱HitrapSuperdeX75進(jìn)行分離，流動(dòng)相為MiIlipore超 純水，流速為0. 5ml/min，收集各流出峰，電泳檢測(cè)，確定目的峰所在。
全文摘要
一種長(zhǎng)雙歧桿菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹瀉中的應(yīng)用，其特征是粘附抑制蛋白Aip阻抑致病菌粘附定植于腸道，而不影響益生菌的粘附，從而防治致病菌引發(fā)的腹瀉，維持腸道微生態(tài)平衡。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可以克服副作用大和耐藥性，粘附抑制蛋白Aip制備成防治腹瀉的功能性產(chǎn)品，并不殺死致病菌本身，而是阻抑其粘附胃腸道，使之失去定植復(fù)制的條件，被排出體外，故而安全可靠，也不存在耐藥性轉(zhuǎn)移等問(wèn)題，是治療腹瀉的新思路。
文檔編號(hào)C07K1/18GK101884782SQ20101021268
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者萬(wàn)翠香, 彭珍, 徐迪, 徐鋒, 熊勇華, 譚強(qiáng)來(lái), 魏華 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)