專利名稱：一種Hg²⁺抗原和相應(yīng)單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種Hg2+抗原和相應(yīng)單克隆抗體，同時還提供了該抗原及單克隆抗體 的制備方法，屬于免疫學(xué)方法檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)代工業(yè)和日常生活中，汞的用途非常廣泛，現(xiàn)在世界上約有80多種工業(yè)生產(chǎn) 需要用汞作為原料。汞以“工業(yè)三廢”的形式進(jìn)入自然環(huán)境，不僅對自然環(huán)境造成了嚴(yán)重的 污染，而且影響了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量，并可通過食物鏈及生物富集作用，最后進(jìn)入人體內(nèi)部。鑒 于汞元素對身體極大的危害性，世界衛(wèi)生組織將汞列為首要考慮的環(huán)境污染物。世界各國 都十分重視環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品汞污染的控制和監(jiān)測。CAC規(guī)定了礦泉水中與食用鹽中的汞的 限量標(biāo)準(zhǔn)分別為0. OOlmg/kg和0. lmg/kg ；歐盟對某些魚類及其產(chǎn)品制定汞的限量標(biāo)準(zhǔn)為 lmg/kg和0. 5mg/kg ；我國也制定了相應(yīng)的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)糧食(成品糧)彡0. 02mg/kg ；薯 類(土豆、白薯)、蔬菜、水果彡0.01mg/kg ；肉、蛋(去殼)彡0.05mg/kg;牛乳彡O.Olmg/ kg。目前測定汞的方法主要有分光光度法、原子吸收法、原子熒光法、ICP-AES、ICP-MS。這 些方法需要昂貴的分析儀器，無法用于現(xiàn)場檢測，難以適應(yīng)環(huán)境及農(nóng)畜產(chǎn)品的現(xiàn)場抽查及 產(chǎn)品進(jìn)出口快速通關(guān)的要求。為了克服以上檢測方法的缺點(diǎn)，國內(nèi)外都開展了重金屬快速免疫檢測技術(shù)的研 究。與其它檢測系統(tǒng)相比，免疫檢測方法具有快速、廉價、簡便、靈敏、特異和便攜等優(yōu)點(diǎn)，可 以滿足環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)場檢測的需要，對提高我國環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品重金屬污染的控制和監(jiān)測 水平以及保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和消費(fèi)者的健康具有重要意義。基于金屬螯合物抗體的免疫檢測方法為重金屬檢測提供了一種新的策略。建立重 金屬快速免疫學(xué)檢測方法的關(guān)鍵在于重金屬特異性單克隆抗體的制備，而重金屬特異性單 克隆抗體制備的關(guān)鍵在于重金屬完全抗原的制備。重金屬離子的分子量小，自身不能作為 完全抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。但是，重金屬離子與螯合劑反應(yīng)后所形成的重金屬-螯 合劑復(fù)合物是低分子量的半抗原，此半抗原與大分子的載體蛋白如鑰孔血藍(lán)蛋白、牛血清 白蛋白、卵清蛋白等偶聯(lián)形成的載體蛋白-螯合劑-重金屬復(fù)合物便可作為一種完全抗原 誘導(dǎo)小鼠發(fā)生免疫反應(yīng)。因此選用結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的大分子雙功能螯合劑，先與重金屬離子螯 合形成螯合劑_重金屬復(fù)合物，再與載體蛋白偶聯(lián)，即可得到完全抗原載體蛋白_螯合 劑-重金屬。目前尚無用雙功能螯合劑Aminobenzyl-EDTA制備Hg2+完全免疫抗原及相應(yīng)特異 性單克隆抗體的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種Hg2+完全免疫抗原，可用于制備重金屬Hg2+的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了 Hg2+抗原的相應(yīng)單克隆抗體，對Hg2+具有特異性。本發(fā)明進(jìn)一步公開了 Hg2+抗原和相應(yīng)單克隆抗體的制備方法，該方法制備的抗
3原、單克隆抗體穩(wěn)定性好、實(shí)用性強(qiáng)。本發(fā)明公開的Hg2+完全免疫抗原，其特征在于完全免疫抗原紫外吸收峰值為225nm 300nm，Hg含量達(dá)57. 15μ g/mg，紫外掃描 結(jié)果見圖1。上述Hg2+完全免疫抗原的制備方法，包括以下步驟稱取2. 6mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 22-0. 28mll0mg/ml、ρΗ6· 0-7. 0 的 Hg(NO3)2溶液中，37°C攪拌反應(yīng)1小時，然后加入pH6. 0-7. 0、1%戊二醛溶液1ml，37°C攪拌 反應(yīng)0. 5小時；將上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml的KLH溶液中，邊加 邊攪拌；調(diào)節(jié)PH值為6. 0-7. 0，37°C攪拌反應(yīng)18小時，選用截留分子量為30000dal的超濾 離心管、7500g超濾6次，洗滌液為0. 1Μ、ρΗ6· 0-7. 0的H印es緩沖液，每次離心15min ；超濾 完畢后，補(bǔ)加0. 1M、ρΗ6· 0-7. 0的H印es溶液，使KLH終濃度為lmg/ml，制備出完全免疫抗 原。本發(fā)明公開的Hg2+抗原的單克隆抗體對Hg2+具有特異性。上述Hg2+抗原的單克隆抗體的制備方法，其特征在于用以上步驟得到的 完全免疫抗原免疫BALB/c小鼠，選擇對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg血清效價高、對 BSA-Aminobenzyl-EDTA血清效價低的小鼠加強(qiáng)免疫，將其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；采用 間接ELISA法篩選雜交瘤細(xì)胞株，只保留對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg反應(yīng)為強(qiáng)陽性、對 BSA-Aminobenzyl-EDTA反應(yīng)為陰性、對其它金屬離子無交叉反應(yīng)的細(xì)胞株。在上述Hg2+抗原的單克隆抗體的制備方法中，采用的免疫方法為首免取100 μ 1 lmg/ml 的 Hg2+ 完全免疫抗原，加入 10 μ 1 lmg/ml、ρΗ6· 0-7. 0 的 Hg(NO3)2溶液振蕩2分鐘，然后加入弗氏完全佐劑110μ 1，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射 免疫；二免及以后免疫取100 μ 1 lmg/ml的Hg2+完全免疫抗原，加入10 μ 1 lmg/ml、 ρΗ6· 0-7. 0的Hg(NO3)2溶液振蕩2分鐘，然后加入弗氏不完全佐劑110μ 1，乳化，供1只小
鼠1次腹腔注射免疫，每兩周免疫一次。本發(fā)明的積極效果在于制備的抗原及相應(yīng)單克隆抗體可以制成重金屬Hg2+快速 檢測試劑盒、膠體金免疫層析試紙或傳感器，為重金屬汞免疫檢測技術(shù)的研究解決了一個 技術(shù)難題。該方法制備的抗原穩(wěn)定性好、實(shí)用性強(qiáng)，為進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫部門、食品衛(wèi)生部門、 水產(chǎn)養(yǎng)殖檢測部門、環(huán)保部門等部門提供新的方便、實(shí)用、簡易、快速檢測工具，具有良好的 經(jīng)濟(jì)價值、社會效益和廣闊的市場前景。


圖1為KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg、KLH的紫外光譜檢測結(jié)果圖。圖 2 為 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg、BSA-Aminobenzyl-EDTA, BSA 的紫外光譜檢測
結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.免疫抗原 KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的制備及檢測
(1)免疫抗原 KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的制備稱取2. 6mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 241ml 10mg/ml、ρΗ6· 5 的 Hg (NO3) 2 溶液中，37°C攪拌反應(yīng)1小時，然后加入pH6. 5、1 %戊二醛溶液1ml，37°C攪拌反應(yīng)0. 5小 時。將上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml的KLH溶液中，邊加邊攪拌。調(diào) 節(jié)pH值為6. 5，37°C攪拌反應(yīng)18小時，選用截留分子量為30000dal的超濾離心管，7500g 超濾6次，洗滌液為0. 1M、ρΗ6· 5的Hepes溶液，每次離心15min。超濾完畢后，補(bǔ)加0. 1M、 PH6. 5的!fepes溶液，使KLH終濃度為lmg/ml。免疫抗原制備完畢，分裝，_20°C保存。(2)免疫抗原 KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的檢測①完全免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg的紫外分光光度法檢測對完全抗原進(jìn)行190 500nm全波長掃描，結(jié)果表明完全抗原的紫外吸收峰 與載體蛋白KLH相比發(fā)生漂移，峰值與載體蛋白相比發(fā)生改變，據(jù)此證實(shí)完全免疫抗原 KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg的合成成功。檢測結(jié)果見圖1。②完全免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg中Hg含量測定用石墨爐原子吸收分光光度法檢測完全免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg中 的Hg含量，結(jié)果表明完全免疫抗原中Hg含量達(dá)57. 15 μ g/mg,此結(jié)果進(jìn)一步表明完全免疫 抗原的合成成功。2.檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的制備及檢測(1)檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的制備稱取5. 9mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 548ml 10mg/ml、ρΗ6· 5 的 Hg (NO3) 2 溶液中，37°C攪拌反應(yīng)0.5小時，調(diào)節(jié)pH為6. 5。然后加入pH6. 5、1 %戊二醛溶液2ml， 37 °C攪拌反應(yīng)0. 5小時。最后，將上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml 的BSA溶液中，邊加邊攪拌，調(diào)節(jié)pH值為6. 5，37°C攪拌反應(yīng)18小時。將抗原轉(zhuǎn)移至截 留分子量為30000dal超濾管中，7500g離心15min，用0. 1M、pH6. 5的!fepes溶液洗滌， 如此反復(fù)進(jìn)行超濾6次，再將抗原以用0. 1M、pH6. 5的!fepes稀釋成lmg/ml，得檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg,分裝，于 _20°C保存。(2)檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的檢測①檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的紫外分光光度法檢測對完全抗原進(jìn)行190 500nm全波長掃描，結(jié)果表明完全抗原的紫外吸收 峰相比載體蛋白發(fā)生漂移，峰值與載體蛋白BSA相比發(fā)生改變，據(jù)此證實(shí)檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的合成成功。檢測結(jié)果見圖2。②檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 中 Hg 含量測定用石墨爐原子吸收分光光度法檢測檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg中 的Hg含量，結(jié)果表明檢測抗原中Hg含量達(dá)33. 2 μ g/mg,此結(jié)果進(jìn)一步表明檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的合成成功。3.對照檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA的制備及檢測(1)對照檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA 的制備稱取 5. 9mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 6ml 0. 1M、pH6. 5 的 Hepes 溶液中， 37°C攪拌0. 5小時，然后加入pH6. 5、1%戊二醛溶液2!111，371攪拌反應(yīng)0. 5小時。最后，將 上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml的BSA溶液中，邊加邊攪拌，調(diào)節(jié)pH值為6. 5，37°C攪拌反應(yīng)18小時。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500g離 心15min,用0. 1M、ρΗ6· 5的H印es溶液洗滌，如此反復(fù)進(jìn)行超濾6次，再用0. 1M、ρΗ6· 5的 Hepes稀釋成lmg/ml，得對照檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA，分裝，于-20°C保存。(2)對照檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA的紫外分光光度法掃描用紫外分光光度法對對照檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA進(jìn)行190 500nm的 全波長掃描，結(jié)果表明對照檢測抗原的紫外吸收峰與載體蛋白BSA相比發(fā)生漂移，峰值與 載體蛋白相比發(fā)生改變，據(jù)此證實(shí)檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA的合成成功。檢測結(jié)果 見圖2。4.小鼠免疫選用8周齡BABL/c小鼠進(jìn)行免疫。首免取 100 μ 1 lmg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-HgjnAlOyl lmg/ml、ρΗ6· 5 的Hg(NO3)2溶液振蕩2分鐘，然后加入完全弗氏佐劑110 μ 1，乳化，供1只小鼠1次腹腔注 射免疫。二免及以后免疫取 100 μ lmg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，力卩入 10 μ 1 lmg/ml、ρΗ6· 5的Hg(NO3)2溶液振蕩2分鐘，然后加入弗氏不完全佐劑110 μ 1，乳化，供1只 小鼠1次腹腔注射免疫。每兩周免疫一次。5.小鼠血清效價的測定(1)間接ELISA法測定血清效價4免疫后小鼠斷尾采血，用間接ELISA法檢測血清效價。用0. 1Μ、ρΗ6. 5的H印es 溶液將檢測抗原 BSA-AminobenzyΙ-EDTA-Hg、對照檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA 作 100 倍稀釋，按每孔100μ 1分別包被酶標(biāo)板，37°C溫育1小時，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液(含 0. 05%吐溫20的PBS液)洗滌3次。加封閉液(1%牛血清蛋白液)150μ 1/孔，37°C溫育 1小時，倒出孔內(nèi)液體，洗滌3次。待檢血清樣品4000倍稀釋后，再做倍比稀釋，按100 μ 1/ 孔加入，37°C溫育1小時，洗滌3次。將酶標(biāo)二抗(羊抗鼠)以1 5000倍稀釋按100 μ 1/ 孔加入，37°C溫育1小時，洗滌3次。加入TMB底物溶液100 μ 1/孔，37°C避光靜置10分鐘， 加終止液(2M H2SO4) 50 μ 1/孔，用酶標(biāo)儀測定450nm處OD值。把待檢血清OD值大于或等 于陰性對照OD值2. 1倍時的最高血清稀釋倍數(shù)作為血清效價。四免疫后所有小鼠血清針 對 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的效價為 1 16000 以上，針對 BSA-Aminobenzyl-EDTA 的 OD 值為 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的 1/4 以下。(2)檢測抗原最佳包被濃度的測定(方陣間接ELISA法) 用包被緩沖液將檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作系列倍比稀釋即作 1 100… …1 6400倍稀釋包被于酶標(biāo)板1 7列孔內(nèi)；將抗血清用PBS緩沖液 (0. 01MpH7. 4)作系列倍比稀釋即作1 1000… …1 32000倍稀釋加于包被有檢測 抗原的酶標(biāo)板A F行孔內(nèi)，按照間接ELISA進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測定450nm波長處各孔 OD值。OD值最接近1.0時的抗原濃度即為最佳抗原包被濃度。經(jīng)試驗(yàn)，確定檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的最佳包被濃度為800倍稀釋。6.細(xì)胞融合、篩選及克隆方案(1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備融合前1-2天，取2只小鼠摘眼球放血，頸部脫白處死，75%酒精浸泡消毒10分鐘，然后將小鼠固定于超凈工作臺的鼠板上。打開腹部皮膚，充分暴露腹膜。用5ml注射器 取5ml 1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，注射器不取出，用鑷子夾住酒精棉球按摩兩側(cè)腹部1分 鐘，然后吸出培養(yǎng)液，置于50mL離心管中，同法進(jìn)行三次。將離心管中的液體IOOOrpm離心 10分鐘，棄上清。用50ml HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按100 μ 1/孔滴加到5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中，37°C，5% CO2中培養(yǎng)，備用。(2) Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前36-48小時將處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。融合前用彎頭吸管 將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁上吹下，收集于50ml離心管中，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清。再 加入20ml 1640培養(yǎng)液，重新混勻，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，加IOml 1640培養(yǎng)液，混 勻。取細(xì)胞懸液0. 1ml，再加入0. Iml臺盼蘭，混勻，滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上顯微鏡下計(jì)數(shù)，備用。(3)脾細(xì)胞的準(zhǔn)備選擇血清針對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 效價高而針對 BSA-Aminobenzyl-EDTA 效價低的BABL/c小鼠于融合前3天加強(qiáng)免疫1次。免疫時取100 μ 1 lmg/ml KLH-Aminobenzy 1-EDTA-Hg，加入 10 μ 1 10mg/ml、pH6. 5 的 Hg (NO3) 2 溶液振蕩 2 分鐘，供 1 只小鼠1次腹腔注射免疫。融合前取小鼠摘眼球放血，頸部脫白處死，75%酒精浸泡消毒 10分鐘，然后將小鼠固定于超凈工作臺的鼠板上，無菌操作打開腹腔，取出脾臟，于含IOml 1640培養(yǎng)液的平皿中洗滌兩次，去掉周圍的脂肪組織與結(jié)締組織，置于含IOml 1640培養(yǎng) 液的平皿中。取200目網(wǎng)篩放于平皿中，加1640培養(yǎng)液至浸沒網(wǎng)篩，將脾臟置于網(wǎng)篩上培養(yǎng) 液中，用L型玻璃棒輕輕擠壓脾臟，使脾細(xì)胞完全進(jìn)入培養(yǎng)液中。將脾細(xì)胞液吸入50ml離 心管中，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，再加IOml 1640培養(yǎng)液，混勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)(同上)，(4)細(xì)胞融合取脾細(xì)胞(IO8個左右)與Sp2/0(107個左右)骨髓瘤細(xì)胞充分混勻于50ml離心管 中，IOOOrpm離心8分鐘，棄上清。用手輕擊離心管底，使細(xì)胞沉淀松散混勻，然后置于37°C 水中預(yù)熱。同時，用Iml吸管吸取Iml 50% PEG在1分鐘內(nèi)均勻加入離心管中，邊加邊混 勻，使細(xì)胞與PEG充分接觸，靜置30秒，再在5分鐘內(nèi)加入20-30mll640培養(yǎng)液，37°C靜置 10分鐘。SOOrpm離心8分鐘，棄上清，用50ml HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，分別加入預(yù)先已經(jīng)準(zhǔn) 備好飼養(yǎng)細(xì)胞的5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μ 1/孔，37°C，5% CO2中培養(yǎng)，7_10天后用HT 培養(yǎng)液換出一半HAT培養(yǎng)液，14天后可以用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。(5)陽性細(xì)胞株的篩選和克隆經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞長到孔底面積的1/10以上時吸出上清檢 測效價。采用已建立的間接ELISA法(同上)，檢測抗原為BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg， 對照檢測抗原為BSA-Aminobenzyl-EDTA，作800倍稀釋包被于酶標(biāo)板，封閉液為1 %牛血 清蛋白液，免疫小鼠血清為陽性對照，Sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液為陰性對照，對陽性克隆進(jìn)行 初步篩選。目的雜交瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)為對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的反應(yīng)為強(qiáng)陽性，對 BSA-Aminobenzyl-EDTA的反應(yīng)為陰性。篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克 隆?？寺∏?-2天按前述方法制備飼養(yǎng)細(xì)胞。將需克隆的陽性雜交瘤細(xì)胞按前述方法用 臺盼蘭染色，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)胞稀釋至10個/ml，分別加入已經(jīng)制備好飼養(yǎng)細(xì)胞的5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μ 1/孔，37°C，5% CO2中培養(yǎng)，仔細(xì)觀察各孔細(xì)胞的生 長情況。取單克隆細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體檢測，選取陽性的細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)并 進(jìn)行下一次克隆，連續(xù)3次克隆，直到陽性率達(dá)100%，備用。(6)上清液特異性分析按照間接競爭ELISA法檢測抗Hg單克隆抗體與其他金屬離子間的交叉反應(yīng)。檢 測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作800倍稀釋包被于酶標(biāo)板，螯合劑Aminobenzyl-EDTA 分別與濃度系列稀釋為 l(T7mM、l(T6mM、l(T5mM、l(T4mM、l(T3mM、l(T2mM、IO^mM, ImM 的 Cd2+、Pb2+、 Ag\Cu2\Fe2\Zn2\Mg2\Mn2\Cr2Mn3\Ni2\Co2+ 置 37°C反應(yīng) lh，然后再與待檢上清置 37°C 反應(yīng)Ih ；將混合液加于酶標(biāo)板37°C恒溫孵育lh，洗滌；加酶標(biāo)二抗37°C恒溫孵育lh，洗滌； 顯色，酶標(biāo)儀測定各孔OD45tl值。分別構(gòu)建抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各自的IC5tl，按以下公式計(jì) 算交叉反應(yīng)率(CR) =CR= IC50 (Hg2+)/IC5tl (其它金屬離子)X 100%。只保留上清液與其他各種金屬的交叉反應(yīng)率低于0. 2%的細(xì)胞株，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、 凍存，備用。經(jīng)過上述篩選，得到2株針對Hg2+的特異性細(xì)胞株。7.單克隆抗體腹水的制備和純化方案取6只BABL/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟0. 5ml/只，1-2周后接種雜交瘤細(xì) 胞(l-2X106/ml)0. 5ml/只，7-12天后當(dāng)小鼠腹部明顯增大時用注射器收集腹水，4°C下 IOOOOrpm離心10分鐘，去油脂和沉淀后，取上清液，20°C保存?zhèn)溆谩８顾募兓捎蔑柡?硫酸銨法，具體步驟為取腹水樣品10ml，加12ml PBS(0. 02M, pH7. 0)，在冰浴中緩慢加入 飽和硫酸銨溶液20ml，邊加邊攪勻，攪拌10分鐘，4°C過夜。4°C，12000rpm離心10分鐘，棄 上清，沉淀用12ml PBS溶解，同上加入飽和硫酸銨溶液8ml，攪拌30分鐘，置4°C 24小時。 4°C,12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用13. 4ml PBS溶解，同上加入飽和硫酸銨溶液 6. 6ml，攪拌10分鐘，4°C靜置1小時。4°C 12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用少量PBS 溶解，裝入透析袋中，4°C透析72小時，第一天每4小時換透析液一次，以后每8小時換透析 液一次。透析結(jié)束后，加等體積甘油，-20°C保存。8.單克隆抗體亞類的鑒定以包被原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg包被酶標(biāo)板，100 μ 1/孔，4°C過夜，倒出孔內(nèi) 液體，洗滌液(含0. 05%吐溫20的PBS液)洗滌3次，再加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ 1/ 孔，室溫孵育1小時，洗滌3次，然后分別加入抗體亞類分型檢測試劑，100 μ 1/孔，室溫孵育 0. 5小時，洗滌3次，加HRP標(biāo)記的馬抗羊IgG(l 5000倍稀釋)，室溫孵育0. 5小時，洗滌 3次，加新鮮配制的底物溶液，100 μ 1/孔，避光反應(yīng)10-15分鐘，加終止液(2Μ H2SO4) 50 μ 1/ 孔終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測相應(yīng)吸光值。當(dāng)OD值大于或等于陰性對照OD值2. 1倍時為陽性。 通過鑒定所有單克隆抗體均為IgG。9.單克隆抗體對的親和性(1)通過夾心ELISA法利用已知濃度羊抗鼠IgG及小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)品測定純化后的 腹水中抗體濃度，即以小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋濃度及其OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待 測腹水OD值計(jì)算得出腹水中抗體濃度。(2)包被系列稀釋的抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg (lmg/ml) (0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、0. 125mg/ml)于酶標(biāo)板，加入系列稀釋且已知抗體濃度的腹水，按間接ELISA法
8操作，測定反應(yīng)系統(tǒng)的OD45tl值，然后以抗體的不同濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)建立 三條測定曲線，以各曲線最大平緩處OD45tl值為100%，查出其OD45tl值為50%時的抗體濃度。 然后按公式Ka= (n-1)/2 (n[Ab' ]t_[Ab]t)計(jì)算親和常數(shù)，公式中[Ab' ]t表示抗原濃度 為[Ag，]t時OD450 = IAOD450max對應(yīng)的抗體濃度，η為抗原[Ag，]t與[Ag]t間的稀釋倍數(shù)。結(jié)果表明本實(shí)施例所得細(xì)胞株分泌的抗體對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg結(jié)合力 較強(qiáng)。10.單克隆抗體特異性分析同上(上清液與其它金屬之間交又反應(yīng)的測定)。結(jié)果表明所得單克隆抗體與其 他金屬的交叉反應(yīng)率均低于0. 2%。實(shí)施例21.免疫抗原 KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的制備稱取2. 6mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 28ml 10mg/ml、pH7. 0 的 Hg (NO3) 2 溶 液中，37°C攪拌反應(yīng)1小時，然后加入pH7.0、l%戊二醛溶液1ml，37°C攪拌反應(yīng)0.5小時。 將上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml的KLH溶液中，邊加邊攪拌。調(diào)節(jié)pH 值為7. 0，37°C攪拌反應(yīng)18小時，選用截留分子量為30000dal的超濾離心管，7500g超濾6 次，洗滌液為0. 1M、pH7. 0的!fepes溶液，每次離心15min。超濾完畢后，補(bǔ)加0. 1M、pH7. 0 的Hepes溶液，使KLH終濃度為lmg/ml。免疫抗原制備完畢，分裝，_20°C保存。2.檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的制備稱取 5. 9mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 548ml 10mg/ml、ρΗ7· 0 的 Hg (NO3) 2 溶液中，37°C攪拌反應(yīng)0.5小時，調(diào)節(jié)pH為7.0。然后加入pH7. 0、1 %戊二醛溶液2ml， 37 °C攪拌反應(yīng)0. 5小時。最后，將上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml 的BSA溶液中，邊加邊攪拌，調(diào)節(jié)pH值為7. 0，37°C攪拌反應(yīng)18小時。將抗原轉(zhuǎn)移至截 留分子量為30000dal超濾管中，7500g離心15min，用0. 1M、pH7. 0的!fepes溶液洗滌， 如此反復(fù)進(jìn)行超濾6次，再將抗原以用0. 1M、pH7. 0的!fepes稀釋成lmg/ml，得檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg,分裝，于 _20°C保存。3.對照檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA 的制備稱取 5. 9mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 6ml 0. 1M、pH7. 0 的 Hepes 溶液中， 37°C攪拌0.5小時，然后加入pH7.0、l%戊二醛溶液2ml，37°C攪拌反應(yīng)0.5小時。最后，將 上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml的BSA溶液中，邊加邊攪拌，調(diào)節(jié)pH值 為7. 0，37°C攪拌反應(yīng)18小時。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500g離 心15min,用0. 1M、ρΗ7· 0的Hepes溶液洗滌，如此反復(fù)進(jìn)行超濾6次，再用0. 1Μ、ρΗ7· 0的 Hepes稀釋成lmg/ml，得對照檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA，分裝，于-20°C保存。4.小鼠免疫選用6只8周齡BABL/c小鼠進(jìn)行免疫。首免-M 100 μ 1 lmg/ml KLH—Aminobenzyl-EDTA—Hg，力口入 10 μ 1 lmg/ml、pH7. 0 的Hg(NO3)2溶液振蕩2分鐘，然后加入完全弗氏佐劑110 μ 1，乳化，供1只小鼠1次腹腔注
射免疫。二免及以后免疫取 100 μ lmg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，力卩入 10 μ 1 lmg/ml、ρΗ7· 0的Hg(NO3)2溶液振蕩2分鐘，然后加入弗氏不完全佐劑110 μ 1，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。每兩周免疫一次。5.小鼠血清效價的測定(1)間接ELISA法測定血清效價4免疫后小鼠斷尾采血，用間接ELISA法檢測血清效價。用0. 1M、pH7. 0的H印es 溶液將檢測抗原 BSA-AminobenzyΙ-EDTA-Hg、對照檢測抗原 BSA-Aminobenzy 1-EDTA 作 100 倍稀釋，按每孔ΙΟΟμ 1分別包被酶標(biāo)板，37°C溫育1小時，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液(含 0.05%吐溫20的PBS液)洗滌3次。加封閉液(1%牛血清蛋白液)150μ 1/孔，37°C溫育 1小時，倒出孔內(nèi)液體，洗滌3次。待檢血清樣品4000倍稀釋后，再做倍比稀釋，按ΙΟΟμ 1/ 孔加入，37°C溫育1小時，洗滌3次。將酶標(biāo)二抗(羊抗鼠)以1 5000倍稀釋按ΙΟΟμ 1/ 孔加入，37°C溫育1小時，洗滌3次。加入TMB底物溶液100 μ 1/孔，37°C避光靜置10分鐘， 加終止液(2M H2SO4) 50 μ 1/孔，用酶標(biāo)儀測定450nm處OD值。把待檢血清OD值大于或等 于陰性對照OD值2. 1倍時的最高血清稀釋倍數(shù)作為血清效價。四免疫后所有小鼠血清針 對 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的效價為 1 16000 以上，針對 BSA-Aminobenzyl-EDTA 的 OD 值為 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的 1/4 以下。(2)檢測抗原最佳包被濃度的測定(方陣間接ELISA法)用包被緩沖液將檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作系列倍比稀釋即作 1 100… …1 6400倍稀釋包被于酶標(biāo)板1 7列孔內(nèi)；將抗血清用PBS緩沖液 (0. 01MpH7. 4)作系列倍比稀釋即作1 1000… …1 32000倍稀釋加于包被有檢測 抗原的酶標(biāo)板A F行孔內(nèi)，按照間接ELISA進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測定450nm波長處各孔 OD值。OD值最接近1.0時的抗原濃度即為最佳抗原包被濃度。經(jīng)試驗(yàn)，確定檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的最佳包被濃度為800倍稀釋。6.細(xì)胞融合、篩選及克隆方案(1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備融合前1-2天，取2只小鼠摘眼球放血，頸部脫白處死，75%酒精浸泡消毒10分 鐘，然后將小鼠固定于超凈工作臺的鼠板上。打開腹部皮膚，充分暴露腹膜。用5ml注射器 取5ml 1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，注射器不取出，用鑷子夾住酒精棉球按摩兩側(cè)腹部1分 鐘，然后吸出培養(yǎng)液，置于50mL離心管中，同法進(jìn)行三次。將離心管中的液體IOOOrpm離心 10分鐘，棄上清。用50ml HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按100 μ 1/孔滴加到5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中，37°C，5% CO2中培養(yǎng)，備用。(2) Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前36-48小時將處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。融合前用彎頭吸管 將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁上吹下，收集于50ml離心管中，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清。再 加入20ml 1640培養(yǎng)液，重新混勻，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，加IOml 1640培養(yǎng)液，混 勻。取細(xì)胞懸液0. 1ml，再加入0. Iml臺盼蘭，混勻，滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上顯微鏡下計(jì)數(shù)，備用。(3)脾細(xì)胞的準(zhǔn)備選擇血清針對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 效價高而針對 BSA-Aminobenzyl-EDTA 效價低的BABL/c小鼠于融合前3天加強(qiáng)免疫1次。免疫時取100 μ 1 lmg/ml KLH-Aminobenzy 1-EDTA-Hg，加入 10 μ 1 10mg/ml、ρΗ7· 0 的 Hg (NO3) 2 溶液振蕩 2 分鐘，供 1只小鼠1次腹腔注射免疫。融合前取小鼠摘眼球放血，頸部脫白處死，75%酒精浸泡消毒 10分鐘，然后將小鼠固定于超凈工作臺的鼠板上，無菌操作打開腹腔，取出脾臟，于含IOml 1640培養(yǎng)液的平皿中洗滌兩次，去掉周圍的脂肪組織與結(jié)締組織，置于含IOml 1640培養(yǎng) 液的平皿中。取200目網(wǎng)篩放于平皿中，加1640培養(yǎng)液至浸沒網(wǎng)篩，將脾臟置于網(wǎng)篩上培養(yǎng) 液中，用L型玻璃棒輕輕擠壓脾臟，使脾細(xì)胞完全進(jìn)入培養(yǎng)液中。將脾細(xì)胞液吸入50ml離 心管中，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，再加IOml 1640培養(yǎng)液，混勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)(同上)，(4)細(xì)胞融合取脾細(xì)胞(IO8個左右)與Sp2/0(107個左右)骨髓瘤細(xì)胞充分混勻于50ml離心管 中，IOOOrpm離心8分鐘，棄上清。用手輕擊離心管底，使細(xì)胞沉淀松散混勻，然后置于37°C 水中預(yù)熱。同時，用Iml吸管吸取Iml 50% PEG在1分鐘內(nèi)均勻加入離心管中，邊加邊混 勻，使細(xì)胞與PEG充分接觸，靜置30秒，再在5分鐘內(nèi)加入20-30mll640培養(yǎng)液，37°C靜置 10分鐘。SOOrpm離心8分鐘，棄上清，用50ml HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，分別加入預(yù)先已經(jīng)準(zhǔn) 備好飼養(yǎng)細(xì)胞的5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μ 1/孔，37°C，5% CO2中培養(yǎng)，7_10天后用HT 培養(yǎng)液換出一半HAT培養(yǎng)液，14天后可以用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。(5)陽性細(xì)胞株的篩選和克隆經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞長到孔底面積的1/10以上時吸出上清檢 測效價。采用已建立的間接ELISA法(同上)，檢測抗原為BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg， 對照檢測抗原為BSA-Aminobenzyl-EDTA，作800倍稀釋包被于酶標(biāo)板，封閉液為1 %牛血 清蛋白液，免疫小鼠血清為陽性對照，Sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液為陰性對照，對陽性克隆進(jìn)行 初步篩選。目的雜交瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)為對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的反應(yīng)為強(qiáng)陽性，對 BSA-Aminobenzyl-EDTA的反應(yīng)為陰性。篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克 隆?？寺∏?-2天按前述方法制備飼養(yǎng)細(xì)胞。將需克隆的陽性雜交瘤細(xì)胞按前述方法用 臺盼蘭染色，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)胞稀釋至10個/ml，分別加入已經(jīng)制備好飼養(yǎng) 細(xì)胞的5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μ 1/孔，37°C，5% CO2中培養(yǎng)，仔細(xì)觀察各孔細(xì)胞的生 長情況。取單克隆細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體檢測，選取陽性的細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)并 進(jìn)行下一次克隆，連續(xù)3次克隆，直到陽性率達(dá)100%，備用。(6)上清液特異性分析按照間接競爭ELISA法檢測抗Hg單克隆抗體與其他金屬離子間的交叉反應(yīng)。檢 測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作800倍稀釋包被于酶標(biāo)板，螯合劑Aminobenzyl-EDTA 分別與濃度系列稀釋為 l(T7mM、l(T6mM、l(T5mM、l(T4mM、l(T3mM、l(T2mM、IO^mM, ImM 的 Cd2+、Pb2+、 Ag\Cu2\Fe2\Zn2\Mg2\Mn2\Cr2Mn3\Ni2\Co2+ 置 37°C反應(yīng) lh，然后再與待檢上清置 37°C 反應(yīng)Ih ；將混合液加于酶標(biāo)板37°C恒溫孵育lh，洗滌；加酶標(biāo)二抗37°C恒溫孵育lh，洗滌； 顯色，酶標(biāo)儀測定各孔OD45tl值。分別構(gòu)建抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各自的IC5tl，按以下公式計(jì) 算交叉反應(yīng)率(CR) =CR= IC50 (Hg2+)/IC5tl (其它金屬離子)X 100%。只保留上清液與其他各種金屬的交叉反應(yīng)率低于0. 2%的細(xì)胞株，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、 凍存，備用。經(jīng)過上述篩選，得到1株針對Hg2+的特異性細(xì)胞株。7.單克隆抗體腹水的制備和純化方案
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取6只BABL/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟0. 5ml/只，1-2周后接種雜交瘤細(xì) 胞(l-2X106/ml)0. 5ml/只，7-12天后當(dāng)小鼠腹部明顯增大時用注射器收集腹水，4°C下 IOOOOrpm離心10分鐘，去油脂和沉淀后，取上清液，20°C保存?zhèn)溆?。腹水的純化采用飽?硫酸銨法，具體步驟為取腹水樣品10ml，加12ml PBS (0. 02M, pH7. 0)，在冰浴中緩慢加入 飽和硫酸銨溶液20ml，邊加邊攪勻，攪拌10分鐘，4°C過夜。4°C，12000rpm離心10分鐘，棄 上清，沉淀用12ml PBS溶解，同上加入飽和硫酸銨溶液8ml，攪拌30分鐘，置4°C 24小時。 4°C,12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用13. 4ml PBS溶解，同上加入飽和硫酸銨溶液 6. 6ml，攪拌10分鐘，4°C靜置1小時。4°C 12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用少量PBS 溶解，裝入透析袋中，4°C透析72小時，第一天每4小時換透析液一次，以后每8小時換透析 液一次。透析結(jié)束后，加等體積甘油，-20°C保存。8.單克隆抗體亞類的鑒定以包被原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg包被酶標(biāo)板，100 μ 1/孔，4°C過夜，倒出孔內(nèi) 液體，洗滌液(含0. 05%吐溫20的PBS液)洗滌3次，再加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ 1/ 孔，室溫孵育1小時，洗滌3次，然后分別加入抗體亞類分型檢測試劑，100 μ 1/孔，室溫孵育 0. 5小時，洗滌3次，加HRP標(biāo)記的馬抗羊IgG(l 5000倍稀釋)，室溫孵育0. 5小時，洗滌 3次，加新鮮配制的底物溶液，100 μ 1/孔，避光反應(yīng)10-15分鐘，加終止液(2Μ H2SO4) 50 μ 1/ 孔終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測相應(yīng)吸光值。當(dāng)OD值大于或等于陰性對照OD值2. 1倍時為陽性。 通過鑒定，本實(shí)施例所制備的克隆抗體為IgM。9.單克隆抗體的親和性(1)通過夾心ELISA法利用已知濃度羊抗鼠IgG及小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)品測定純化后的 腹水中抗體濃度，即以小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋濃度及其OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待 測腹水OD值計(jì)算得出腹水中抗體濃度。(2)包被系列稀釋的抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg (lmg/ml) (0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、0. 125mg/ml)于酶標(biāo)板，加入系列稀釋且已知抗體濃度的腹水，按間接ELISA法 操作，測定反應(yīng)系統(tǒng)的OD45tl值，然后以抗體的不同濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)建立 三條測定曲線，以各曲線最大平緩處OD45tl值為100%，查出其OD45tl值為50%時的抗體濃度。 然后按公式Ka= (n-1)/2 (n[Ab' ]t_[Ab]t)計(jì)算親和常數(shù)，公式中[Ab' ]t表示抗原濃度 為[Ag，]t時OD450 = IAOD450max對應(yīng)的抗體濃度，η為抗原[Ag，]t與[Ag]t間的稀釋倍數(shù)。結(jié)果表明本實(shí)施例所得細(xì)胞株分泌的抗體對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg結(jié)合力 較強(qiáng)。10.單克隆抗體特異性分析同上(上清液與其它金屬之間交又反應(yīng)的測定)。結(jié)果表明本實(shí)施例的雜交瘤細(xì) 胞分泌的單克隆抗體與其他金屬離子無交叉反應(yīng)。實(shí)施例31.免疫抗原 KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的制備稱取2. 6mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 24ml 10mg/ml、ρΗ6· 0 的 Hg (NO3) 2 溶 液中，37°C攪拌反應(yīng)1小時，然后加入pH6.0、l%戊二醛溶液1ml，37°C攪拌反應(yīng)0.5小時。 將上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml的KLH溶液中，邊加邊攪拌。調(diào)節(jié)pH 值為6. 0，37°C攪拌反應(yīng)18小時，選用截留分子量為30000dal的超濾離心管，7500g超濾6次，洗滌液為0. 1M、ρΗ6· 0的Hepes溶液，每次離心15min。超濾完畢后，補(bǔ)加0. 1M、ρΗ6· 0 的Hepes溶液，使KLH終濃度為lmg/ml。免疫抗原制備完畢，分裝，_20°C保存。2.檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的制備稱取5. 9mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 548ml 10mg/ml、ρΗ6· 0 的 Hg (NO3) 2 溶液中，37°C攪拌反應(yīng)0.5小時，調(diào)節(jié)pH為6.0。然后加入pH6. 0、1 %戊二醛溶液2ml， 37 °C攪拌反應(yīng)0. 5小時。最后，將上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml 的BSA溶液中，邊加邊攪拌，調(diào)節(jié)pH值為6. 0，37°C攪拌反應(yīng)18小時。將抗原轉(zhuǎn)移至截 留分子量為30000dal超濾管中，7500g離心15min，用0. 1M、pH6. 0的!fepes溶液洗滌， 如此反復(fù)進(jìn)行超濾6次，再將抗原以用0. 1M、pH6. 0的!fepes稀釋成lmg/ml，得檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg,分裝，于 _20°C保存。3.對照檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA的制備及檢測稱取 5. 9mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 6ml 0. 1M、pH6. O 的 Hepes 溶液中， 37°C攪拌0. 5小時，然后加入pH6. 0、1%戊二醛溶液2!111，371攪拌反應(yīng)0. 5小時。最后，將 上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml的BSA溶液中，邊加邊攪拌，調(diào)節(jié)pH值 為6. 0，37°C攪拌反應(yīng)18小時。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500g離 心15min,用0. 1M、pH6. 0的H印es溶液洗滌，如此反復(fù)進(jìn)行超濾6次，再用0. 1M、pH6. 0的 Hepes稀釋成lmg/ml，得對照檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA，分裝，于-20°C保存。4.小鼠免疫選用4只8周齡BABL/c小鼠進(jìn)行免疫。首免-M 100 μ 1 lmg/ml KLH—Aminobenzyl-EDTA—Hg，力口入 10 μ 1 lmg/ml、pH6. 0 的Hg(NO3)2溶液振蕩2分鐘，然后加入完全弗氏佐劑110 μ 1，乳化，供1只小鼠1次腹腔注 射免疫。二免及以后免疫取 100 μ 1 lmg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，力卩入 10 μ 1 lmg/ml、ρΗ6· 0的Hg(NO3)2溶液振蕩2分鐘，然后加入弗氏不完全佐劑110 μ 1，乳化，供1只 小鼠1次腹腔注射免疫。每兩周免疫一次。5.小鼠血清效價的測定(1)間接ELISA法測定血清效價4免疫后小鼠斷尾采血，用間接ELISA法檢測血清效價。用0. 1Μ、ρΗ6. 0的H印es 溶液將檢測抗原 BSA-AminobenzyΙ-EDTA-Hg、對照檢測抗原 BSA-Aminobenzy 1-EDTA 作 100 倍稀釋，按每孔100μ 1分別包被酶標(biāo)板，37°C溫育1小時，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液(含 0.05%吐溫20的PBS液)洗滌3次。加封閉液(1%牛血清蛋白液)150μ 1/孔，37°C溫育 1小時，倒出孔內(nèi)液體，洗滌3次。待檢血清樣品4000倍稀釋后，再做倍比稀釋，按100 μ 1/ 孔加入，37°C溫育1小時，洗滌3次。將酶標(biāo)二抗(羊抗鼠)以1 5000倍稀釋按100 μ 1/ 孔加入，37°C溫育1小時，洗滌3次。加入TMB底物溶液100 μ 1/孔，37°C避光靜置10分鐘， 加終止液(2M H2SO4) 50 μ 1/孔，用酶標(biāo)儀測定450nm處OD值。把待檢血清OD值大于或等 于陰性對照OD值2. 1倍時的最高血清稀釋倍數(shù)作為血清效價。四免疫后所有小鼠血清針 對 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的效價為 1 16000 以上，針對 BSA-Aminobenzyl-EDTA 的 OD 值為 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 的 1/4 以下。(2)檢測抗原最佳包被濃度的測定(方陣間接ELISA法)
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用包被緩沖液將檢測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作系列倍比稀釋即作 1 100… …1 6400倍稀釋包被于酶標(biāo)板1 7列孔內(nèi)；將抗血清用PBS緩沖液 (0. 01MpH7. 4)作系列倍比稀釋即作1 1000… …1 32000倍稀釋加于包被有檢測 抗原的酶標(biāo)板A F行孔內(nèi)，按照間接ELISA進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測定450nm波長處各孔 OD值。OD值最接近1.0時的抗原濃度即為最佳抗原包被濃度。經(jīng)試驗(yàn)，確定檢測抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的最佳包被濃度為800倍稀釋。6.細(xì)胞融合、篩選及克隆方案(1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備融合前1-2天，取2只小鼠摘眼球放血，頸部脫臼處死，75%酒精浸泡消毒10分 鐘，然后將小鼠固定于超凈工作臺的鼠板上。打開腹部皮膚，充分暴露腹膜。用5ml注射器 取5ml 1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，注射器不取出，用鑷子夾住酒精棉球按摩兩側(cè)腹部1分 鐘，然后吸出培養(yǎng)液，置于50mL離心管中，同法進(jìn)行三次。將離心管中的液體IOOOrpm離心 10分鐘，棄上清。用50ml HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按100 μ 1/孔滴加到5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中，37°C，5% CO2中培養(yǎng)，備用。(2)Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前36-48小時將處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。融合前用彎頭吸管 將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁上吹下，收集于50ml離心管中，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清。再 加入20ml 1640培養(yǎng)液，重新混勻，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，加IOml 1640培養(yǎng)液，混 勻。取細(xì)胞懸液0. 1ml，再加入0. Iml臺盼蘭，混勻，滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上顯微鏡下計(jì)數(shù)，備用。(3)脾細(xì)胞的準(zhǔn)備選擇血清針對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg 效價高而針對 BSA-Aminobenzyl-EDTA 效價低的BABL/c小鼠于融合前3天加強(qiáng)免疫1次。免疫時取100 μ 1 lmg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg,加入 10 μ 1 10mg/ml、ρΗ6· 0 的 Hg (NO3) 2 溶液振蕩 2 分鐘，供 1 只小鼠1次腹腔注射免疫。融合前取小鼠摘眼球放血，頸部脫白處死，75%酒精浸泡消毒 10分鐘，然后將小鼠固定于超凈工作臺的鼠板上，無菌操作打開腹腔，取出脾臟，于含IOml 1640培養(yǎng)液的平皿中洗滌兩次，去掉周圍的脂肪組織與結(jié)締組織，置于含IOml 1640培養(yǎng) 液的平皿中。取200目網(wǎng)篩放于平皿中，加1640培養(yǎng)液至浸沒網(wǎng)篩，將脾臟置于網(wǎng)篩上培養(yǎng) 液中，用L型玻璃棒輕輕擠壓脾臟，使脾細(xì)胞完全進(jìn)入培養(yǎng)液中。將脾細(xì)胞液吸入50ml離 心管中，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，再加IOml 1640培養(yǎng)液，混勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)(同上)，(4)細(xì)胞融合取脾細(xì)胞(IO8個左右)與Sp2/0(107個左右)骨髓瘤細(xì)胞充分混勻于50ml離心管 中，IOOOrpm離心8分鐘，棄上清。用手輕擊離心管底，使細(xì)胞沉淀松散混勻，然后置于37°C 水中預(yù)熱。同時，用Iml吸管吸取Iml 50% PEG在1分鐘內(nèi)均勻加入離心管中，邊加邊混 勻，使細(xì)胞與PEG充分接觸，靜置30秒，再在5分鐘內(nèi)加入20-30mll640培養(yǎng)液，37°C靜置 10分鐘。SOOrpm離心8分鐘，棄上清，用50ml HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，分別加入預(yù)先已經(jīng)準(zhǔn) 備好飼養(yǎng)細(xì)胞的5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μ 1/孔，37°C，5% CO2中培養(yǎng)，7_10天后用HT 培養(yǎng)液換出一半HAT培養(yǎng)液，14天后可以用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。
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(5)陽性細(xì)胞株的篩選和克隆經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞長到孔底面積的1/10以上時吸出上清檢 測效價。采用已建立的間接ELISA法(同上)，檢測抗原為BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg， 對照檢測抗原為BSA-Aminobenzyl-EDTA，作800倍稀釋包被于酶標(biāo)板，封閉液為1 %牛血 清蛋白液，免疫小鼠血清為陽性對照，Sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液為陰性對照，對陽性克隆進(jìn)行 初步篩選。目的雜交瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)為對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的反應(yīng)為強(qiáng)陽性，對 BSA-Aminobenzyl-EDTA的反應(yīng)為陰性。篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克 隆?？寺∏?-2天按前述方法制備飼養(yǎng)細(xì)胞。將需克隆的陽性雜交瘤細(xì)胞按前述方法用 臺盼蘭染色，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)胞稀釋至10個/ml，分別加入已經(jīng)制備好飼養(yǎng) 細(xì)胞的5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μ 1/孔，37°C，5% CO2中培養(yǎng)，仔細(xì)觀察各孔細(xì)胞的生 長情況。取單克隆細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體檢測，選取陽性的細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)并 進(jìn)行下一次克隆，連續(xù)3次克隆，直到陽性率達(dá)100%，備用。(6)上清液特異性分析按照間接競爭ELISA法檢測抗Hg單克隆抗體與其他金屬離子間的交叉反應(yīng)。檢 測抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作800倍稀釋包被于酶標(biāo)板，螯合劑Aminobenzyl-EDTA 分別與濃度系列稀釋為 l(T7mM、l(T6mM、l(T5mM、l(T4mM、l(T3mM、l(T2mM、IO^mM, ImM 的 Cd2+、Pb2+、 Ag\Cu2\Fe2\Zn2\Mg2\Mn2\Cr2Mn3\Ni2\Co2+ 置 37°C反應(yīng) lh，然后再與待檢上清置 37°C 反應(yīng)Ih ；將混合液加于酶標(biāo)板37°C恒溫孵育lh，洗滌；加酶標(biāo)二抗37°C恒溫孵育lh，洗滌； 顯色，酶標(biāo)儀測定各孔OD45tl值。分別構(gòu)建抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各自的IC5tl，按以下公式計(jì) 算交叉反應(yīng)率(CR) =CR= IC50 (Hg2+)/IC5tl (其它金屬離子)X 100%。只保留上清液與其他各種金屬的交叉反應(yīng)率低于0. 2%的細(xì)胞株，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、 凍存，備用。經(jīng)過上述篩選，得到2株針對Hg2+的特異性細(xì)胞株。7.單克隆抗體腹水的制備和純化方案取6只BABL/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟0. 5ml/只，1-2周后接種雜交瘤細(xì) 胞(l-2X106/ml)0. 5ml/只，7-12天后當(dāng)小鼠腹部明顯增大時用注射器收集腹水，4°C下 IOOOOrpm離心10分鐘，去油脂和沉淀后，取上清液，20°C保存?zhèn)溆?。腹水的純化采用飽?硫酸銨法，具體步驟為取腹水樣品10ml，加12ml PBS(0. 02M, ρΗ6· 0)，在冰浴中緩慢加入 飽和硫酸銨溶液20ml，邊加邊攪勻，攪拌10分鐘，4°C過夜。4°C，12000rpm離心10分鐘，棄 上清，沉淀用12ml PBS溶解，同上加入飽和硫酸銨溶液8ml，攪拌30分鐘，置4°C 24小時。 4°C,12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用13. 4ml PBS溶解，同上加入飽和硫酸銨溶液 6. 6ml，攪拌10分鐘，4°C靜置1小時。4°C 12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用少量PBS 溶解，裝入透析袋中，4°C透析72小時，第一天每4小時換透析液一次，以后每8小時換透析 液一次。透析結(jié)束后，加等體積甘油，-20°C保存。8.單克隆抗體亞類的鑒定以包被原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg包被酶標(biāo)板，100 μ 1/孔，4°C過夜，倒出孔內(nèi) 液體，洗滌液(含0. 05%吐溫20的PBS液)洗滌3次，再加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ 1/ 孔，室溫孵育1小時，洗滌3次，然后分別加入抗體亞類分型檢測試劑，100 μ 1/孔，室溫孵育 0. 5小時，洗滌3次，加HRP標(biāo)記的馬抗羊IgG(l 5000倍稀釋)，室溫孵育0. 5小時，洗滌3次，加新鮮配制的底物溶液，100 μ 1/孔，避光反應(yīng)10-15分鐘，加終止液(2Μ H2SO4) 50 μ 1/ 孔終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測相應(yīng)吸光值。當(dāng)OD值大于或等于陰性對照OD值2. 1倍時為陽性。 通過鑒定，本實(shí)施例中所得的2株雜交瘤細(xì)胞中，1株分泌的單克隆抗體為IgM，1株分泌的 單克隆抗體為IgG。9.單克隆抗體的親和性(1)通過夾心ELISA法利用已知濃度羊抗鼠IgG及小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)品測定純化后的 腹水中抗體濃度，即以小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋濃度及其OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待 測腹水OD值計(jì)算得出腹水中抗體濃度。(2)包被系列稀釋的抗原 BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg (lmg/ml) (0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、0. 125mg/ml)于酶標(biāo)板，加入系列稀釋且已知抗體濃度的腹水，按間接ELISA法 操作，測定反應(yīng)系統(tǒng)的OD45tl值，然后以抗體的不同濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)建立 三條測定曲線，以各曲線最大平緩處OD45tl值為100%，查出其OD45tl值為50%時的抗體濃度。 然后按公式Ka= (n-1)/2 (n[Ab' ]t_[Ab]t)計(jì)算親和常數(shù)，公式中[Ab' ]t表示抗原濃度 為[Ag，]t時OD450 = IAOD450max對應(yīng)的抗體濃度，η為抗原[Ag，]t與[Ag]t間的稀釋倍數(shù)。結(jié)果表明本實(shí)施例所得細(xì)胞株分泌的抗體對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg結(jié)合力 較強(qiáng)。10.單克隆抗體特異性分析同上(上清液與其它金屬之間交又反應(yīng)的測定)。結(jié)果表明本實(shí)施例的雜交瘤細(xì) 胞分泌的單克隆抗體與其他金屬離子無交叉反應(yīng)。
1權(quán)利要求
一種Hg2+完全免疫抗原，其特征在于完全免疫抗原紫外吸收峰值為225nm～300nm，Hg含量達(dá)57.15μg/mg，紫外掃描結(jié)果見圖1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述Hg2+完全免疫抗原的制備方法，包括以下步驟稱取 2. 6mg 螯合劑 Aminobenzyl-EDTA 溶于 0. 22-0. 28ml 10mg/ml、pH 6. 0-7. O 的 Hg(NO3)2溶液中，37°C攪拌反應(yīng)1小時，然后加入pH 6. 0-7. O、戊二醛溶液1ml，37°C攪 拌反應(yīng)0. 5小時；將上述反應(yīng)后的混合液逐滴加入到2ml濃度為5mg/ml的KLH溶液中，邊 加邊攪拌；調(diào)節(jié)PH值為6. 0-7. 0，37°C攪拌反應(yīng)18小時，選用截留分子量為30000dal的超 濾離心管、7500g超濾6次，洗滌液為0. 1M、pH 6. 0-7. O的!fepes緩沖液，每次離心15min ； 超濾完畢后，補(bǔ)加0. 1Μ、ρΗ 6.0-7.0的H印es溶液，使KLH終濃度為lmg/ml，制備出完全免 疫抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述Hg2+完全免疫抗原的制備方法的制備方法，其特征在于!fepes 緩沖液PH值為6.5。
4.權(quán)利要求1所述Hg2+完全免疫抗原的單克隆抗體，其特征在于單克隆抗體對Hg2+ 具有特異性。
5.權(quán)利要求4所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于用權(quán)利要求2得到的 完全免疫抗原免疫BALB/c小鼠，選擇對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg血清效價高、對 BSA-Aminobenzyl-EDTA血清效價低的小鼠加強(qiáng)免疫，將其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；采用 間接ELISA法篩選雜交瘤細(xì)胞株，只保留對BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg反應(yīng)為強(qiáng)陽性、對 BSA-Aminobenzyl-EDTA反應(yīng)為陰性、對其它金屬離子無交叉反應(yīng)的細(xì)胞株。
6.權(quán)利要求5所述Hg2+抗原的單克隆抗體的制備方法，其特征在于免疫方法為首免取ΙΟΟμΙ lmg/ml的Hg2+完全免疫抗原，加入10 μ 1 lmg/ml、pH 6. 0-7. O的 Hg(NO3)2溶液振蕩2分鐘，然后加入弗氏完全佐劑110μ 1，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射 免疫；二免及以后免疫取ΙΟΟμ 1 lmg/ml的Hg2+完全免疫抗原，加入10μ 1 lmg/ml、 ρΗ6· 0-7. 0的Hg(NO3)2溶液振蕩2分鐘，然后加入弗氏不完全佐劑110μ 1，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫，每兩周免疫一次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Hg2+抗原和相應(yīng)單克隆抗體，同時還提供了該抗原及單克隆抗體的制備方法，將Hg2+與螯合劑Aminobenzyl-EDTA螯合，通過戊二醛與血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)，超濾，得到Hg2+完全免疫抗原；用其免疫BALB/c小鼠，取該小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出Hg2+的特異性單克隆抗體。該抗體可用于檢測Hg2+的ELISA試劑盒、試紙條的開發(fā)，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K16/44GK101914154SQ20101021681
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月5日
發(fā)明者劉國文, 劉磊, 唐佳佳, 孔濤, 張燚, 張鵬, 揚(yáng)威, 李東娜, 李小兵, 王哲 申請人:吉林大學(xué)