專利名稱：高通量篩選三氮唑類單胺氧化酶抑制劑的方法及化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用“點(diǎn)擊化學(xué)”構(gòu)建三氮唑化合物并高通量篩選單胺氧化酶抑 制劑的方法，以及篩選到的三氮唑類化合物。
背景技術(shù)：
點(diǎn)擊化學(xué)(Click chemistry)，又譯為“鏈接化學(xué)”、“動(dòng)態(tài)組合化學(xué)”(Dynamic Combinatorial Chemistry)、“速配接合組合式化學(xué)”，是由化學(xué)家巴里·夏普萊斯在2001 年引入的一個(gè)合成概念，主旨是通過小單元的拼接，來快速可靠地完成形形色色分子的化 學(xué)合成。它尤其強(qiáng)調(diào)開辟以碳-雜原子鍵(C-X-C)合成為基礎(chǔ)的組合化學(xué)新方法，并借助 這些反應(yīng)(點(diǎn)擊反應(yīng))來簡單高效地獲得分子多樣性。點(diǎn)擊化學(xué)的概念對化學(xué)合成領(lǐng)域有 很大的貢獻(xiàn)，在藥物開發(fā)和分子生物學(xué)的諸多領(lǐng)域中，它已經(jīng)成為目前最為有用和吸引人 的合成理念之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種利用“點(diǎn)擊化學(xué)”構(gòu)建三氮唑化合物并高通量篩選單胺氧 化酶抑制劑的方法，以及篩選到的新的具有單胺氧化酶抑制活性的三氮唑類化合物。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種高通量篩選三氮唑類單胺氧化酶抑制劑的方法，所述方法包括(1)利用“點(diǎn)擊化學(xué)”方法，構(gòu)建三氮唑類化合物庫，所述三氮唑類化合物構(gòu)建方法 如下以等摩爾量的式(II)所示的疊氮類化合物和和式(III)所示的炔類化合物為反應(yīng)底 物，在CU+/CU2+存在下，于叔丁醇的水溶液中，38 32°C搖床反應(yīng)24h以上，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn) 行質(zhì)譜分析，如果炔和疊氮類化合物的峰消失，出現(xiàn)新的符合相應(yīng)的三氮唑的峰，則認(rèn)為反 應(yīng)完全，生成了式(I)所示三氮唑類化合物，進(jìn)行下一步操作； 式⑴ (III)中:R和R1為取代或未被取代的苯環(huán)類、雜環(huán)類或鏈烴類取代基；上述取代基R和R1 并不是本發(fā)明要求保護(hù)的內(nèi)容，本發(fā)明只是提供一個(gè)利用點(diǎn)擊化學(xué)構(gòu)建三氮唑類化合物并 以此篩選單胺氧化酶抑制劑的途徑，具體選擇何種取代基，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可在篩選 過程根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行取舍篩選。目前有多種方法檢測單胺氧化酶的活性分光光度法、放射性法、高效液相法以及 熒光探針法等。分光光度法、放射性法、高效液相法等都不適合高通量的篩選而熒光探針 具有很高的靈敏度和專一性，并且樣品不需要復(fù)雜的提純，因此熒光探針法被廣泛應(yīng)用于 生物醫(yī)學(xué)和生物學(xué)。
本發(fā)明點(diǎn)擊化學(xué)法構(gòu)建三氮唑類化合物的方法有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)①在室溫條件下 就可反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和；②反應(yīng)溶劑為叔丁醇和水不影響單胺氧化酶的酶活；③反應(yīng)完 全，沒有副產(chǎn)物，同時(shí)硫酸銅和抗壞血酸對單胺氧化酶的酶活幾乎沒有影響。有了這些優(yōu)點(diǎn) 再結(jié)合熒光探針的特點(diǎn)就可以不經(jīng)提純直接檢測酶活，粗篩出活性結(jié)構(gòu)。(2)采用熒光探針法檢測三氮唑類化合物的單胺氧化酶活性取步驟(1)含三氮 唑類化合物的反應(yīng)液，以水稀釋至濃度為50 100 μ Μ,吸取稀釋液加入96孔板的反應(yīng)孔 中，再加入ΡΗ8. 4硼酸緩沖液和BSA，加入適量MAO-A或ΜΑ0-Β，混合物在38°C反應(yīng)3h，然后 加入熒光探針，再在38°C反應(yīng)2h，用全功能熒光分光光度計(jì)Uex/Xem = 365/460nm)進(jìn)行 檢測；根據(jù)熒光值的高低判斷三氮唑類化合物對單胺氧化酶抑制活性的高低熒光強(qiáng)度越 強(qiáng)，則抑制活性越弱；反之其抑制活性就越強(qiáng)。所述熒光探針為下列之一 (1)4-甲基-7-(3_氨基丙基)_香豆素、(2)苯丙胺、 (3)4-甲基-7-(l-甲基-1，2，3，6-四氫吡啶-4-氧基)_香豆素。上述熒光探針反應(yīng)機(jī)理以4-甲基-7-(3-氨基丙基)_香豆素為例該化合物其本 身并無熒光，但經(jīng)與單胺氧化酶作用，3-氨基丙基轉(zhuǎn)化為醛，接著發(fā)生消除反應(yīng)后，生成了 具有強(qiáng)烈熒光性能的4-甲基-7-羥基香豆素。因此通過檢測熒光的變化就可檢測MAO的 活性。優(yōu)選的，所述步驟(1)中叔丁醇與水體積用量之比為1 1。所述鏈烴類取代基包括甲基、甲氧基、乙氧基、羥基、鹵素、吡啶基、苯甲氧基、硼酸 基、二甲氨基、羥乙基甲氨基、硝基、羧基、苯乙烯基、二苯氨基、嘧啶基，醚、乙?；?、乙酰氧 基等。這些鏈烴長度為2 5個(gè)碳，可以是直鏈也可以含有支鏈，支鏈數(shù)目為1 5個(gè)。所述苯環(huán)或鏈烴上的取代基包括(1)烷烴類取代基包括甲基、乙基；(2)烯烴類 取代基包括苯乙烯基，其中苯乙烯基的苯環(huán)上可以含有甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、羥基、 鹵素、羧基、硝基、乙酰氧基等基團(tuán)，這些基團(tuán)位于取代基的苯環(huán)的2 5號位，數(shù)目為0 5 個(gè)，取代基可以是相同的也可以是不同的；(3)鹵素類取代基包括氟、氯、溴、碘；醚類取代 基包括甲氧基、乙氧基、苯甲氧基，其中苯甲氧基的苯環(huán)上可以含有甲基、乙基、甲氧基、乙 氧基、羥基、鹵素、羧基、硝基、乙酰氧基等基團(tuán)，這些基團(tuán)位于取代基的苯環(huán)的2 5號位， 數(shù)目為0 5個(gè)，取代基可以是相同的也可以是不同的；(4)芳烴類取代基包括苯基、帶有 取代基的苯基，其中苯基的取代基可以是甲基、甲氧基、乙氧基、羥基、鹵素、吡啶基、苯甲氧 基、硼酸基、帶有取代基的苯基、二甲氨基、羥乙基甲氨基、硝基、羧基、苯乙烯基、二苯氨基、 嘧啶基，醚、乙酰基、乙酰氧基等。這些取代基團(tuán)位于苯環(huán)的2 5號位，取代基的數(shù)目0 5個(gè)，這些取代基可以是相同的也可以是不同的；(5)有機(jī)含氮類取代基包括硝基、二甲氨 基、二苯氨基、羥乙基甲氨基；(6)雜環(huán)類取代基包括吡啶、嘧啶等。所述雜環(huán)類取代基包括呋喃、吡唑、蒽環(huán)、吲哚、喹啉、苯并吡喃-4-酮等。雜環(huán)上 的取代基包括甲基、甲氧基、羥基、硝基、鹵素、羧基等。取代基的數(shù)目0 5個(gè)，可以是相 同的也可以是不同的。優(yōu)選的，所述步驟(1)中所述三氮唑類化合物構(gòu)建方法如下將所述炔類和疊氮 類化合物分別溶解在叔丁醇中，制成濃度IOmM的溶液1和溶液2 (也可將炔類和疊氮類化 合物同時(shí)溶解在叔丁醇中)；硫酸銅和抗壞血酸分別溶解在水中，制成硫酸銅濃度0. ImM的 溶液3、抗壞血酸濃度ImM的溶液4，取等體積的溶液1、2、3和4混合，38 32°C搖床反應(yīng)24h以上，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行質(zhì)譜分析。本發(fā)明還涉及一種上述方法篩選獲得的三氮唑類化合物，結(jié)構(gòu)如式(I-I)所示 本發(fā)明還涉及一類按上述方法篩選獲得的三氮唑類化合物，結(jié)構(gòu)如下式所示 優(yōu)選的，所述三氮唑類化合物為下列之-本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)所構(gòu)建的篩選單胺氧化酶抑制劑的方法，方 法新穎，操作過程簡便，原料來源都已商品化容易得到，并且所得到的單胺氧化酶抑制劑性 質(zhì)很穩(wěn)定，純度也很高(99%以上)；(2)與以前所研究的單胺氧化酶抑制劑的方法相比，快 速高效，節(jié)約成本和時(shí)間，所篩得的新型三氮唑類單胺氧化酶抑制劑，結(jié)構(gòu)簡單，其抑制活 性、對MAO-A和MAO-B選擇性都有很大的提高，具有高通量篩選的特點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于
此 實(shí)施例1 方法
(1)將所述炔類(III)和疊氮類化合物(II)分別溶解在叔丁醇中，制成炔類化 合物濃度IOmM的溶液1、疊氮類化合物濃度IOmM的溶液2 ；硫酸銅和抗壞血酸分別溶解在 水中，制成硫酸銅濃度0. ImM的溶液3、抗壞血酸濃度ImM的溶液4。Iml的小瓶中分別加 入上述溶液 1(10 μ 1，lequiv)、溶液 2(10 μ 1，lequiv)、溶液 3(10 μ 1，1% equiv)和溶液 4(10μ 1，10% equiv)混勻。將上述小瓶放在30°C的搖床中反應(yīng)24h。時(shí)間結(jié)束后，用質(zhì) 譜分析，如果炔和疊氮化合物的峰消失，出現(xiàn)新物質(zhì)的峰符合相應(yīng)的三氮唑，則認(rèn)為反應(yīng)完 全，產(chǎn)生了所述三氮唑類化合物(I)；(2)將步驟(1)構(gòu)建的三氮唑的反應(yīng)用水沖淡到濃度為100 μ M，吸取4 μ 1加入96 孔板，然后加入 MA0-A(20mg/ml)或 MAO-B (20mg/ml) 4 μ 1，硼酸緩沖液(ρΗ = 8. 4)400 μ 1， 4μ 1 BSA(20mg/ml)，混合物在38°C反應(yīng)3h，然后加入探針4-甲基_7_ (3-氨基丙基)-香 豆素2μ l(10mmOl/ml)，三氮唑最終濃度在1(Γ2πιπι01/1以下，混合物再在38°C反應(yīng)2h，用全 功能熒光分光光度計(jì)(λ ex/ λ em = 365/460nm)進(jìn)行檢測。按照上述方法，得到的部分活性較好的三氮唑類化合物的結(jié)構(gòu)及其對MAO-A和 MAO-B的抑制活性見表1 表 1 實(shí)施例2 :1-(4_吡啶)_基-4-甲胺基-IH-[1，2，3]三氮唑(I-I)的制備合成路線如下 50ml圓底燒瓶中加入4_疊氮吡啶(0. 8ml)，丙炔胺(0. 47ml)和t_Bu0H/H20(共 2ml，1 1，ν/ν)，溶解完全后，加入硫酸銅(0.017g，l%mol)，再加入抗壞血酸(0. 12g,10% mol)，室溫?cái)嚢?4h，3*20ml 二氯甲烷萃取，NaHCO3飽和溶液洗，無水硫酸鎂干燥，過濾，抽干，柱層析純化，得到黃色固體，產(chǎn)率91%?；衔锉碚?1H-NMR(D2O) δ 8. 55-8. 54 (m, 2H, CH)，7. 71-7. 70 (m, 2H, CH)，8. 35 (s, 1H, -CH = C),3. 85 (s,2H, CH2). ESI-MSm/z 176. 1(M+1)+.實(shí)施例3 :1-苯基-4-甲胺基-IH-[1，2，3]三氮唑(1-2)的制備合成路線如下 具體操作過程參考實(shí)施例2。化合物表征=1H-NMR(D2O) δ 8. 02 (s, 1H，-CH = C)， 7. 44-7. 43 (m, 2H, CH)，7. 37-7. 31 (m, 3H, CH)，3. 75 (s, 2H, CH2) · ESI-MSm/z 175. 1 (M+1) +·實(shí)施例4 :4-(4-甲胺基_[1，2，3]-三氮唑)基苯甲酸(1-3)的制備合成路線如下 50ml圓底燒瓶中加入4-羧基苯基疊氮(0. 3g)，丙炔胺(0.13ml)和t_BuOH/ H2O(共6ml，1 1，ν/ν)，溶解完全后，加入硫酸銅溶液(0. Iml,0. 045Μ，0· 1% mol)和抗壞 血酸(0. 2ml, 0. 32M，10% mol)，室溫?cái)嚢?. 5白色固體析出，繼續(xù)反應(yīng)24h，蒸去叔丁醇，加 入水15ml沖淡，鹽酸酸化，過濾，正己烷洗，干燥，得到白色固體，產(chǎn)率91 %?；衔锉碚?1H-NMR(DMSO) δ 8. 95 (s, 1H, -CH = C),8. 18-8. 16(d，2H，J = IOHz，CH)，8. 06-8. 04(d，2H， J= IOHz，CH)，4. 25 (s，2H，CH2). ESI-MSm/z 219. 1 (M+1)+·實(shí)施例5 :3-(4-甲胺基-[1，2，3]_三氮唑)基苯甲酸(1-4)的制備合成路線如下 具體過程參考實(shí)施例4?；衔锉碚?1H-NMR(DMSO) δ 8. 87 (s，1H，-CH = C)， 8.33(s，lH，CH)，8· 02-8. 02(d，2H，J = 10Hz, CH)，7· 69 (s，1H，CH)，4· 21 (s，2H，CH2). ESI-MSm/z 219. 1(M+1)+。
權(quán)利要求
一種高通量篩選三氮唑類單胺氧化酶抑制劑的方法，所述方法包括(1)利用“點(diǎn)擊化學(xué)”方法，構(gòu)建三氮唑類化合物庫，所述三氮唑類化合物構(gòu)建方法如下以等量的式(II)所示的疊氮類化合物和和式(III)所示的炔類化合物為反應(yīng)底物，在Cu+/Cu2+存在下，于叔丁醇的水溶液中，38～32℃搖床反應(yīng)24h以上，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行質(zhì)譜分析，如果炔和疊氮類化合物的峰消失，出現(xiàn)新的符合相應(yīng)的三氮唑的峰，則認(rèn)為反應(yīng)完全，生成了式(I)所示三氮唑類化合物，進(jìn)行下一步操作；式(I)～(III)中R和R1為取代或未被取代的苯環(huán)類、雜環(huán)類或鏈烴類取代基；(2)采用熒光探針法檢測三氮唑類化合物的單胺氧化酶活性取步驟(1)含三氮唑類化合物的反應(yīng)液，以水稀釋至濃度為50～100μM，吸取稀釋液加入96孔板的反應(yīng)孔中，再加入pH8.4硼酸緩沖液和BSA，加入適量MAO-A或MAO-B，混合物在38℃反應(yīng)3h，然后加入熒光探針，再在38℃反應(yīng)2h，用全功能熒光分光光度 計(jì)(λex/λem＝365/460nm)進(jìn)行檢測，根據(jù)熒光值的高低判斷三氮唑類化合物對單胺氧化酶抑制活性的高低熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，則抑制活性越弱；反之其抑制活性就越強(qiáng)。FDA0000023143590000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述熒光探針為下列之一(1)4-甲 基-7_(3-氨基丙基)-香豆素、(2)苯丙胺、(3)4-甲基-7-(l-甲基-1，2，3，6-四氫吡 啶-4-氧基)_香豆素。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中叔丁醇與水體積比為1 1。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中所述三氮唑類化合物構(gòu)建方 法如下將所述炔類和疊氮類化合物分別溶解在叔丁醇中，制成濃度IOmM的溶液1和溶液 2 ；硫酸銅和抗壞血酸分別溶解在水中，制成硫酸銅濃度0. ImM的溶液3、抗壞血酸濃度ImM 的溶液4，取等體積的溶液1、2、3和4混合，38 32°C搖床反應(yīng)24h以上，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行 質(zhì)譜分析。
5.一種按權(quán)利要求1方法篩選獲得的三氮唑類化合物，結(jié)構(gòu)如式(I-I)所示
6.一種按權(quán)利要求1方法篩選獲得的三氮唑類化合物，結(jié)構(gòu)如下式所示 R2SH或羧基。
7.如權(quán)利要求6所述的三氮唑類化合物，其特征在于所述三氮唑類化合物為下列之
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用“點(diǎn)擊化學(xué)”構(gòu)建三氮唑化合物并高通量篩選單胺氧化酶抑制劑的方法，以及篩選到的三氮唑類化合物。本發(fā)明式(II)所示的疊氮類化合物和和式(III)所示的炔類化合物為反應(yīng)底物，經(jīng)點(diǎn)擊化學(xué)構(gòu)建得到式(I)所述三氮唑類化合物，再以熒光檢測方法檢測單胺氧化酶抑制活性，方法新穎，操作過程簡便，原料來源都已商品化容易得到，并且所得到的單胺氧化酶抑制劑性質(zhì)很穩(wěn)定，純度也很高(99％以上)；與以前所研究的單胺氧化酶抑制劑的方法相比，快速高效，節(jié)約成本和時(shí)間，所篩得的新型三氮唑類單胺氧化酶抑制劑，結(jié)構(gòu)簡單，其抑制活性、對MAO-A和MAO-B選擇性都有很大的提高，具有高通量篩選的特點(diǎn)。
文檔編號C07D401/04GK101881733SQ20101021947
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者朱勍, 賈朝 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)