專(zhuān)利名稱(chēng)：含有g(shù)lp-1或其類(lèi)似物的融合蛋白、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于與糖尿病相關(guān)的藥物領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種具有延長(zhǎng)的胰高血糖素樣肽類(lèi)的體內(nèi)半衰期的融合蛋白。本發(fā)明還涉及該融合蛋白的制備方法以及其在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的胰高血糖素樣肽1 (glucagon-lik印印tide-Ι，以下簡(jiǎn)稱(chēng)GLP_1)主要是由小腸L細(xì)胞分泌的一種由37個(gè)氨基酸組成的多肽，其活性形式為GLP-I (7-37) OH和 GLP-I (7-36) NH2 (Mojsov S, J Clin Invest. 1987Feb ；79 (2) :616-9)。GLP-1 能夠明顯降低人用餐后的血糖，刺激胰島素的產(chǎn)生，同時(shí)還能起到一定的減肥效應(yīng)，并且不會(huì)引起低血糖癥(Drucker D J, Diabetes. 1998 Feb ；47 (2) 159-69)。近期的研究還表明 GLP-1 對(duì)胰腺具有再生作用(Drucker D J，2003 Dec ；144(12) :5145-8)。然而，GLP-1 (7-37)的血清半衰期僅僅為3-5分鐘。在GLP-I肽的治療用途方面，來(lái)自蜥蜴唾液的人GLP-I類(lèi)似物Exendin-4 的合成物Exenatide已于2005年在美國(guó)作為降糖藥上市，這種合成物在血中的半衰期為 2. 5小時(shí)左右，每天需要在早飯及晚飯前注射給藥，導(dǎo)致在臨床使用中每天多次注射給藥非常不便。因此，延長(zhǎng)GLP-I類(lèi)似物的體內(nèi)時(shí)間對(duì)于臨床應(yīng)用具有重要的意義。目前已經(jīng)有不少研究采用GLP-I類(lèi)似物融合蛋白技術(shù)解決GLP-I類(lèi)似物在體內(nèi)的存留時(shí)間短的問(wèn)題(例如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN90101167. 3、CN200710018734. 2、 CN200410054397.9、 CN01820232. 2、 CN200380110152. 7、 CN200510039265.3、 CN200610127237. 1和CN200910009642. 7)。然而，現(xiàn)有技術(shù)與臨床上的理想目標(biāo)還有很大距離。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明采用融合蛋白技術(shù)克服了 GLP-I半衰期短的問(wèn)題。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種融合蛋白，該融合蛋白具有GLP-I或其類(lèi)似物的活性，并且在體內(nèi)的存留時(shí)間長(zhǎng)，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中GLP-I類(lèi)似物藥物需要每天多次注射給藥的缺陷。本發(fā)明的另一目的是提供編碼該融合蛋白的核酸序列、包含該核酸序列的載體以及包含該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供制備該融合蛋白的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供該融合蛋白的應(yīng)用，包括其在制備治療糖尿病和/或肥胖癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供包含該融合蛋白的藥物組合物。用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一方面，本發(fā)明提供一種融合蛋白，融合蛋白由以下通式I表示A-a-B-a，-A，(I)其中，Α、Α，獨(dú)立地為氨基酸序列為SEQ ID NO 53的多肽1或氨基酸序列為SEQ ID NO54的多肽2 ；B為氨基酸序列為SEQ ID NO 55的多肽3或氨基酸序列為SEQ ID N056的多肽 4；a、a’獨(dú)立地為由0_5個(gè)氨基酸殘基，例如0_3個(gè)氨基酸殘基組成的連接肽。在上述融合蛋白中，組成所述連接肽的氨基酸可以選自甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；優(yōu)選為甘氨酸。優(yōu)選地，所述A和A’中之一以N-末端與連接肽相連，另一個(gè)以 C-末端與連接肽相連。具體而言，所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下NH2-多肽 I-GLY-多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 I-GLY-多肽 4-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 1-多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 1-多肽 4-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 1-多肽 4-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 1-多肽 3-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 I-GLY-多肽 3-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽 I-GLY-多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽 1-多肽 3-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽 I-多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽 2-GLY-多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 2-GLY-多肽 4-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 2-多肽 3-GLY-多肽 1-COOH ；NH2-多肽 2-多肽 4-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 2-GLY-多肽 3-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽 2-GLY-多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ；
NH2-多肽 2-多肽 3-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽 2-多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽 2-多肽 3-多肽 2-C00H ；NH2-多肽 2-多肽 4-多肽 2-C00H ；NH2-多肽 1 - (GLY) 5-多肽 4_ (GLY) 5-多肽 1-COOH ；NH2-多肽 1- (ALA) 2_ 多肽 4_ (ILE) 3_ 多肽 1-C00H ；或NH2-多肽 I-VAL-多肽 4_ (VAL) 4_ 多肽 1-C00H ；優(yōu)選地，所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下NH2-多肽 I-GLY-多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 I-GLY-多肽 4-GLY-多肽 1-C00H ；
NH2-多肽 1-多肽 4-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 1-多肽 3-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 I-GLY-多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽 2-GLY-多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽 2-GLY-多肽 3-GLY-多肽 2-C00H ；
NH2-多肽 2-GLY-多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽2-多肽3-多肽2-C00H ；或NH2-多肽 2-多肽 4-多肽 2-C00H ；更優(yōu)選地，所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下NH2-多肽 I-GLY-多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ；或
NH2-多肽 2-GLY-多肽 3-GLY-多肽 2-C00H。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了編碼上述融合蛋白的核酸序列，包含該核酸序列的載體， 以及包含該載體的宿主細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明還提供了一種上述融合蛋白的制備方法，該制備方法包括在表達(dá)可檢測(cè)量的所述融合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯上述核酸序列的步驟。具體來(lái)說(shuō)，上述融合蛋白的制備方法包括以下步驟1)構(gòu)建根據(jù)上述融合蛋白的核酸序列；2)構(gòu)建包含步驟1)構(gòu)建的核酸序列的表達(dá)載體；3)將步驟2、構(gòu)建的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并使所述核酸序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)；4)純化得到融合蛋白。又一方面，本發(fā)明提供了上述融合蛋白、核酸序列、載體或宿主細(xì)胞在制備治療糖尿病，肥胖癥，和/或糖尿病、肥胖癥相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含上述融合蛋白和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。優(yōu)選地，該藥物組合物為液體注射劑或凍干注射劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的融合蛋白在體內(nèi)的存留時(shí)間較長(zhǎng)，避免了同類(lèi)產(chǎn)品在用于治療時(shí)需要每天多次注射給藥的缺陷，便于臨床應(yīng)用。2、本發(fā)明的融合蛋白優(yōu)選來(lái)源于人的天然序列，減少了融合蛋白在人體內(nèi)潛在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。3、本發(fā)明的融合蛋白可以通過(guò)濃縮至藥用濃度，作為藥物有效成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體等組分制備成藥用組合物，用于糖尿病及肥胖癥等疾病和相關(guān)病癥或疾病的治療中。以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)臨床上GLP-I或其類(lèi)似物藥物在體內(nèi)的存留時(shí)間較短， 導(dǎo)致治療作用較短、每天需要多次注射給藥的缺陷，提供具有通式I結(jié)構(gòu)的含有GLP-I或其類(lèi)似物的融合蛋白及其在制備糖尿病治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種藥用組合物，該藥用組合物含有通式I結(jié)構(gòu)所示的含GLP-I或其類(lèi)似物融合蛋白作為有效成分，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑等?，F(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的目的對(duì)本發(fā)明逐一加以描述。本發(fā)明的含GLP-I或類(lèi)似物融合蛋白也可以如下述通式I’所示A-連接肽1-多肽2-連接肽2-A，其中，
A、A，分別為 GLP-I 或 Exendin-4 ； 多肽2為人血清白蛋白HSA或人免疫球蛋白Fc ；
連接肽1、連接肽2分別為0-5個(gè)氨基酸殘基，氨基酸殘基優(yōu)選GLY、ALA、ILE和中的一種或多種；
A和A’可以以N-末端及C-末端與其它肽連接。 根據(jù)通式I’，優(yōu)選以下的含GLP-I或類(lèi)似物融合蛋白，其中， A、A，分別為 GLP-I 或 Exendin-4 ； 多肽2為人血清白蛋白HSA或人免疫球蛋白Fc ； 連接肽1、連接肽2分別為0-3個(gè)氨基酸殘基，氨基酸殘基優(yōu)選GLY ； A和A’可以以N-末端及C-末端與其它肽連接。 根據(jù)通式I’，本發(fā)明更為優(yōu)選的含GLP-I或類(lèi)似物融合蛋白選自 冊(cè)2GLP-1-GLY-HSA-GLY-GLP-1C00H nh2GLP- 1 -GLY-Fc-GLY-GLP-1C00H 冊(cè)2GLP-1 -HSA-GLY-GLP-1C00H nh2GLP- 1 -Fc-GLY-GLP-1C00H NH2GLP-I-FC-GLP-ICOOH 麗2GLP-I-HSA-GLP-ICOOH NH2GLP-1-GLY-HSA-GLY-Exendin-4C00H NH2GLP-1-GLY-Fc-GLY-Exendin-4C00H 麗2GLP-1-HSA-GLY-Exendin-4C00H 麗2GLP-1-Fc-GLY-Exendin-4C00H NH2Exendin-4-GLY-HSA-GLY-GLP-lC00H NH2Exendin-4-GLY-Fc-GLY-GLP-lC00H NH2Exendin-4-HSA-GLY-GLP-lC00H ^Exendin^-Fc-GLY-GLP-l00011 圍Exendin-4-GLY-HSA-GLY-Exendin-4C00H 圍Exendin-4-GLY-Fc-GLY-Exendin-4C00H 圍Exendin-4-HSA-GLY-Exendin-4C00H 麗2Exendin-4-Fc-GLY-Exendin-4C00H ^Exendin^-HSA-Exendin-^0 圍Exendin-4-Fc-Exendin-4C00H NH2GLP-I- (GLY) 5-Fc- (GLY) 5-GLP-1COOH nh2GLP-I- (ALA) 2-Fc- (ILE) 3-GLP-lC00H NH2GLP-I-VAL-FC- (VAL) 4_GLP_1⑶0H 在前述融合蛋白中，GLP-I的氨基酸序列為 SEQ ID NO 53 J-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR-36 Exendin-4 序列為
SEQ ID NO 54 :GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKIGGPSSGAPPPS
HSA氨基酸序列為SEQ ID NO 55 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKAS SAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLIgG Fc氨基酸序列為SEQ ID NO 56 WQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDffKDHKFKffRKDPQDK根據(jù)上述融合蛋白的氨基酸序列可以獲得該融合蛋白相應(yīng)的核酸序列，或包含該核酸序列的核酸序列。該融合蛋白可以采用其核酸序列或包含其核酸序列的序列，通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段獲得。上述融合蛋白的核酸及氨基酸序列由NCBI公布，屬于公認(rèn)序列。本發(fā)明提供產(chǎn)生該融合蛋白的方法，該方法可包括在表達(dá)可檢測(cè)量的所述融合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯上述融合蛋白的核酸序列的步驟。此外，本發(fā)明所提供的該融合蛋白的制備方法還可以包含以下步驟1、構(gòu)建編碼本發(fā)明的異源融合蛋白的DNA可以從各種來(lái)源獲得本發(fā)明中的異源融合蛋白中的野生型白蛋白和免疫球蛋白， 例如這些蛋白可以從由表達(dá)野生型白蛋白及免疫球蛋白的mRNA的組織或細(xì)胞的cDNA文庫(kù)獲得。本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法對(duì)相關(guān)的異源融合蛋白的mRNA進(jìn)行篩選，通過(guò)公開(kāi)的白蛋白及免疫球蛋白的DNA、蛋白序列設(shè)計(jì)引物。本發(fā)明的異源融合蛋白(白蛋白、免疫球蛋白)優(yōu)選來(lái)源于人的天然序列，以減少融合蛋白在人體內(nèi)潛在的免疫原性危險(xiǎn)。另外，本發(fā)明中的免疫球蛋白優(yōu)選僅包含免疫球蛋白的Fc片段。本發(fā)明中將根據(jù)人血清白蛋白及人免疫球蛋白的公開(kāi)序列設(shè)計(jì)PCR引物， 從人血RNA中提取人血清白蛋白及人免疫球蛋白的mRNA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將異源融合的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。2、構(gòu)津本發(fā)明中GLP-I或類(lèi)似物的DNA 本發(fā)明參考專(zhuān)利CN1363654A中GLP-1中雙鏈DNA全長(zhǎng)的合成方法，進(jìn)行GLP-1、 Exendin-4及其它GLP-1類(lèi)似物雙鏈DNA全長(zhǎng)的合成。本發(fā)明中GLP-l、Exendin-4及其它 GLP-I類(lèi)似物都經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的DNA測(cè)序進(jìn)行序列驗(yàn)證。本發(fā)明中的GLP-I、Exendin-4及其它 GLP-I類(lèi)似物指代連接或不連接連接肽的GLP-I、Exendin-4及其它GLP-I類(lèi)似物。3、構(gòu)津本發(fā)明中GLP-I異源融合蛋白載體利用本領(lǐng)域常規(guī)的PCR突變技術(shù)制備連接有不同連接短肽的GLP-I、EXendin-4及其它GLP-I類(lèi)似物，并將其用于與蛋白表達(dá)質(zhì)粒的連接。連接技術(shù)是本領(lǐng)域常規(guī)操作，本發(fā)明利用PCR將含有連接肽的GLP-I類(lèi)似物與蛋白表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)T4連接酶進(jìn)行連接，連接位點(diǎn)為BamHI與Ndel，得到本發(fā)明中所有融合蛋白的表達(dá)載體(示意圖如圖3所示)。一旦產(chǎn)生了編碼完整融合蛋白的表達(dá)載體，它可以用來(lái)傳染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌等宿主細(xì)胞，生產(chǎn)融合蛋白。重組DNA載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。4、_〒猶_汰本劍月白■原艦一細(xì)去用本發(fā)明中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，用于表達(dá)異源融合蛋白。參考本領(lǐng)域常規(guī)的異源蛋白表達(dá)技術(shù)優(yōu)化本發(fā)明中各種異源融合蛋白的表達(dá)，用于增加細(xì)胞培養(yǎng)物的原則、技術(shù)(例如培養(yǎng)基、溫度、PH等)可以參見(jiàn)Mammalian Cell Biotechnology =A Practical Approach, M.Butler。本發(fā)明中的含GLP-1及其類(lèi)似物融合蛋白的表達(dá)采用本領(lǐng)域常規(guī)的Iac啟動(dòng)子大腸桿菌融合蛋白表達(dá)技術(shù)，使用IPTG啟動(dòng)GLP-I類(lèi)似物融合蛋白的產(chǎn)生。5、本發(fā)明異源融合蛋白的純化—旦本發(fā)明的異源融合蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白分離和純化技術(shù)對(duì)本發(fā)明中的融合蛋白進(jìn)行純化。例如根據(jù)融合蛋白表達(dá)載體內(nèi)的標(biāo)簽進(jìn)行融合蛋白的粗提純。本發(fā)明中，純化后的異源融合蛋白可以通過(guò)超濾方法將其濃縮至藥用濃度，融合蛋白經(jīng)過(guò)紫外線的處理用以增加其藥用的安全性。6、本發(fā)明的融合蛋白的表征:本發(fā)明中，可以用許多方法表征本發(fā)明的融合蛋白。這些方法中的一些包括與蛋白染色偶聯(lián)的SDS-PAGE或免疫印跡技術(shù)。本發(fā)明中所有的異源融合蛋白都通過(guò)免疫印跡的鑒定，例如使用抗IgG的抗體，使用抗HSA的抗體，抗GLP-I的抗體及抗Exendin-4的抗體。發(fā)明中免疫印跡表征中抗體的選擇見(jiàn)表1。表1.本專(zhuān)利所涉及的蛋白免疫印跡方法中使用的抗體
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示 A-a-B-a， -A，(I)其中，A、A，獨(dú)立地為氨基酸序列為SEQ ID NO 53的多肽1或氨基酸序列為SEQ ID NO討的多肽2 ；B為氨基酸序列為SEQ ID NO 55的多肽3或氨基酸序列為SEQ ID N056的多肽4 ； a、a’獨(dú)立地為由0-5個(gè)氨基酸殘基，例如0-3個(gè)氨基酸殘基組成的連接肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，組成所述連接肽的氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；優(yōu)選為甘氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述A和A’中之一以N-末端與連接肽相連，另一個(gè)以C-末端與連接肽相連。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下NH2-多肽1--GLY-多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽1--GLY-多肽 4-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽1--多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽1--多肽 4-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽1--多肽4-多肽1-C00H ；NH2-多肽1--多肽3-多肽1-C00H ；NH2-多肽1--GLY-多肽 3-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽1--GLY-多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽1--多肽 3-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽1--多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽2--GLY-多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽2--GLY-多肽 4-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽2--多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽2--多肽 4-GLY-多肽 1-C00H ；NH2-多肽2--GLY-多肽 3-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽2--GLY-多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽2--多肽 3-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽2--多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ；NH2-多肽2--多肽3-多肽2-C00H ；NH2-多肽2--多肽4-多肽2-C00H ；NH2-多肽1--(GLY) 5-多肽 4- (GLY) 5-多肽 1-C00H ；NH2-多肽1--(ALA) 2-多肽 4- (ILE) 3"多肽 1-C00H ；或NH2-多肽1--VAL-多肽 4-(VAL)4-多肽 1-C00H ；優(yōu)選地，所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下 NH2-多肽 I-GLY-多肽 3-GLY-多肽 1-COOH ；NH2-多肽 I-GLY-多肽 4-GLY-多肽 1-COOH ； NH2-多肽1-多肽4-多肽3-多肽1-C00H ； NH2-多肽1-多肽3-多肽1-C00H ； NH2-多肽 I-GLY-多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ； NH2-多肽 2-GLY-多肽 3-GLY-多肽 1-C00H ； NH2-多肽 2-GLY-多肽 3-GLY-多肽 2-C00H ； NH2-多肽 2-GLY-多肽 4-GLY-多肽 2-C00H ； NH2-多肽2-多肽3-多肽2-C00H ；或 NH2-多肽2-多肽4-多肽2-C00H ； 更優(yōu)選地，所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)如下 NH2-多肽 I-GLY-多肽 3-GLY-多肽 1-COOH ；或 NH2-多肽 2-GLY-多肽 3-GLY-多肽 2-C00H。
5.編碼根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的核酸序列。
6.包含根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸序列的載體。
7.包含根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體的宿主細(xì)胞。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的制備方法，該制備方法包括在表達(dá)可檢測(cè)量的所述融合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯權(quán)利要求5所述的核酸序列的步驟。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的制備方法，該制備方法包括以下步驟1)構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的核酸序列；2)構(gòu)建包含步驟1)構(gòu)建的核酸序列的表達(dá)載體；3)將步驟幻構(gòu)建的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并使所述核酸序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)；4)純化得到融合蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白、權(quán)利要求5所述的核酸序列、權(quán)利要求6所述的載體或權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞在制備治療糖尿病，肥胖癥，和/或糖尿病、肥胖癥相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
11.一種藥物組合物，該藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為液體注射劑或凍干注射劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于糖尿病、肥胖癥藥物領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及具有延長(zhǎng)胰高血糖素樣肽體內(nèi)半衰期的重組融合蛋白及其制備方法、包含該融合蛋白的藥物組合物以及該融合蛋白在制備治療糖尿病和/或肥胖癥藥物中的應(yīng)用。該融合蛋白由以下通式I表示A-a-B-a’-A’(I)其中，A、A’獨(dú)立地為氨基酸序列為SEQ ID NO 53的多肽1或氨基酸序列為SEQ ID NO 54的多肽2；B為氨基酸序列為SEQ ID NO 55的多肽3或氨基酸序列為SEQ ID NO 56的多肽4；a、a’獨(dú)立地為由0-5個(gè)氨基酸殘基，例如0-3個(gè)氨基酸殘基組成的連接肽。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102311501SQ20101022056
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者任曉文, 劉巍, 孟凡翠, 徐為人, 湯立達(dá), 王玉麗, 鄭學(xué)敏, 龔珉 申請(qǐng)人:天津藥物研究院