專利名稱：從莜麥中提取α-淀粉酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物有效成份的提取方法，具體是一種從莜麥種子中提取α “淀粉酶 抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著人們生活水平的提高，糖尿病、高血壓、肥胖癥正成為普遍的高發(fā)病， 嚴(yán)重危害著人類的健康。糖尿病是一種由于體內(nèi)胰島素分泌不足引起的以糖代謝紊亂為主 的全身性疾病。而肥胖則引發(fā)多種疾病，如高血壓，冠心病、心血管疾病、糖尿病、高血脂等， 成為威脅人類健康和生活滿意度的最大殺手。α _淀粉酶抑制劑在臨床醫(yī)學(xué)上，可以防治糖 尿病、高血壓、高血脂等疾病。α-淀粉酶抑制劑屬于糖苷水解酶抑制劑中的一種，是近年來國外開發(fā)的一類新 型口服抗糖尿病的藥物，主要是通過特異性抑制唾液及胰腺分泌的α-淀粉酶的水解，來 減少二級產(chǎn)物還原糖的生成，抑制食物中碳水化合物的水解和消化，從而減緩或減少對糖 分的攝取，降低血糖和血脂水平，降低食后食物中淀粉等糖類物質(zhì)的分解和吸收，從而起到 減低血糖、血脂的作用。另一方面α-淀粉酶抑制劑通過抑制飲食后血糖濃度升高，脂肪合 成降低，延緩腸道的排空，來增加脂肪消耗以達(dá)到體重減輕的目的。目前上市的α-淀粉酶 酶抑制劑類藥品有良好的降低餐后血糖的作用，但其價格高，而且在臨床應(yīng)用上存在著副 反應(yīng)，從一些能夠安全的食用植物中尋找天然的、副作用弱的α-淀粉酶抑制劑具有廣泛 的前景。鑒于莜麥中蛋白含量高，又有高質(zhì)量的膳食纖維，豐富的維生素和礦物質(zhì)，莜麥常 作為糖尿病人的推薦食物之一。因此，國際衛(wèi)生組織把它正式列為推薦的保健食品。從莜 麥中分離純化具有抑制α “淀粉酶活力的蛋白類成分，具有很好的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從莜麥中提取α-淀粉酶抑制劑的方法，所提取的 α-淀粉酶抑制劑純度高。本發(fā)明提供的一種從莜麥中提取α -淀粉酶抑制劑的方法，包括如下步驟(1)將莜麥種子磨碎，按每IOOg莜麥300_600mL丙酮的量，將莜麥粉加入丙酮中， 室溫放置10小時以上，用真空減壓泵抽干成丙酮粉；(2)配制含IOOmM NaCl的20mM Tris-HCl ρΗ8· 0的緩沖液，用每IOOml緩沖液溶 解10-20g丙酮粉，在高速離心機(jī)上離心30min以上，保留上清液；(3)在上清液中加入硫酸銨，收集30% -80%硫酸銨沉淀；(4)懸浮沉淀，用20mM Tris-HCl pH8. 0緩沖液透析除鹽，得到蛋白溶液；(5)將蛋白溶液，在高速離心機(jī)上離心30min以上，取上清液上樣于經(jīng)20mM Tris-HCl pH8. 0緩沖液平衡的陰離子型柱上，收集穿透蛋白溶液；(6)將穿透蛋白溶液上樣到經(jīng)20mM Tris-HCl pH8. 0緩沖液平衡的陽離子型柱上，進(jìn)行NaCl濃度梯度洗脫，收集50mMNaCl鹽濃度下的洗脫蛋白溶液；(7)將洗脫蛋白溶液上樣到經(jīng)20mM Tris-HCllOOmM NaCl pH8. 0緩沖液平衡的凝 膠層析柱上，用20mM Tris-HCl IOOmM NaCl pH8. 0緩沖液洗脫，收集活性洗脫峰，脫鹽，冷 凍干燥，獲得凍干粉。所述的陰離子型柱是 Q-S印harose，如 Qipharose fast flow Q-Sepharose HP。所述的陽離子型柱是Herparin-Sepharose,如Herparin-Sepharose fast flow或 herparin-Sepharose HP。所述的凝膠層析柱是S印hacryl凝膠層析柱，如S印hacryl-200凝膠層析柱。所述的高速離心機(jī)，使用的轉(zhuǎn)速在IOOOOrpm以上。 本發(fā)明從莜麥中分離提取出α -淀粉酶抑制劑的純度高，抑制比活為26. 43U/mg, 可用于制備減肥和治療糖尿病的藥物。莜麥?zhǔn)且环N高蛋白低糖的農(nóng)作物，是糖尿病人的極好食品，對其有效成分的進(jìn)一 步分離，有利于提高其附加值；從莜麥中提取出α-淀粉酶抑制劑作為藥品，存在極好的安 全性。


圖1莜麥α _淀粉酶抑制劑純化電泳圖，圖中1、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、莜麥種子 蛋白粗提液；3、硫酸銨沉淀透析后蛋白樣品；4、Q柱分離蛋白樣品；5、Heparin柱分離蛋白 樣品；6、Sephacryl-200柱分離蛋白樣品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 α -淀粉酶抑制劑制備粉碎與脫脂將莜麥種子去殼粉碎成莜麥面粉；稱取IOOg莜麥面粉，加入500ml的丙酮，在室溫 下放置12小時后，真空減壓泵下抽成丙酮粉；蛋白抽提與粗分離用含IOOmM NaCl的20mM Tris-HCl pH8. 0的緩沖液100ml， 溶解丙酮粉，然后將溶解的蛋白溶液在高速離心機(jī)上，12000rpm，4°C離心30min，取上清液 進(jìn)行硫酸銨沉淀，收集30% -80%硫酸銨沉淀，用20mM Tris-HCl pH8. 0緩沖液20ml懸浮， 裝透析袋，用1000ml的相同緩沖液透析，更換外透析液四次；蛋白柱層析分離將透析后的蛋白溶液，在高速離心機(jī)上，12000rpm，4°C離心 30min，取上清液上樣到經(jīng)20mM Tris-HCl pH8. 0平衡的Q_s印harose fast flow柱上，收 集穿透蛋白溶液；并再上樣將于經(jīng)20mM Tris-HCl (pH8. 0)平衡的!feparin-s印harose fast flow柱上，進(jìn)行NaCl濃度梯度洗脫，收集50mM NaCl鹽濃度下洗脫蛋白溶液；最后上樣到 經(jīng)20mMTris-HCl，50mM NaCl平衡的S印hacryl_200凝膠柱層析柱上，收集不同的洗脫峰， 進(jìn)行活性測定，收集具有活性的蛋白溶液洗脫峰。蛋白冷凍干燥活性蛋白溶液用G25凝膠柱進(jìn)行脫鹽處理，然后冷凍干燥。IOOg莜 麥獲得20mg電泳純度的α -淀粉酶抑制劑。表1實(shí)施例1 α -淀粉酶抑制劑分離純化總表
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實(shí)施例2 莜麥α -淀粉酶抑制劑活性測定及與阿卡波糖淀粉酶抑制活性的比較1、α -淀粉酶抑制劑抑制活性的測定利用3. 5-二硝基水楊酸法進(jìn)行測定，將IOOyL α -淀粉酶與100 μ L α -淀粉 酶抑制劑于37°C保溫lOmin，然后在反應(yīng)體系中加入IOOyL 可溶性淀粉(用含20mM NaCl,0. 2mM CaCl2的20mM磷酸鈉緩沖液pH6. O配制)，37°C保溫lOmin，最后向反應(yīng)體系中 加入Iml 3. 5- 二硝基水楊酸，沸水浴lOmin，用蒸餾水將反應(yīng)體系補(bǔ)足到10ml，在540nm處 測定光吸收，以不加α-淀粉酶抑制劑為對照。α-淀粉酶抑制劑的活力定義為在37°C條件下，每分鐘抑制α _淀粉酶催化 1 U mol葡萄糖生成所需的抑制劑的量。2、莜麥α -淀粉酶抑制劑與阿卡波糖對α _淀粉酶抑制活性的比較分別稱取5mg的莜麥α -淀粉酶抑制劑與阿卡波糖，利用3. 5_ 二硝基水楊酸法， 測定兩者對α _淀粉酶抑制活性，莜麥α -淀粉酶抑制劑的抑制比活力為26. 4U/mg，阿卡波 糖為1. 84U/mg，前者大約是后者活力的14. 4倍。
權(quán)利要求
一種從莜麥中提取α 淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將莜麥種子磨碎，按每100g莜麥300 600mL丙酮的量，將莜麥粉加入丙酮中，室溫放置10小時以上，用真空減壓泵抽干成丙酮粉；(2)配制含100mM NaCl的20mM Tris HCl pH8.0的緩沖液，用每100ml緩沖液溶解10 20g丙酮粉，在高速離心機(jī)上離心30min以上，保留上清液；(3)在上清液中加入硫酸銨，收集30％ 80％硫酸銨沉淀；(4)懸浮沉淀，用20mM Tris HCl pH8.0緩沖液透析除鹽，得到蛋白溶液；(5)將蛋白溶液，在高速離心機(jī)上離心30min以上，取上清液上樣于經(jīng)20mM Tris HClpH8.0緩沖液平衡的陰離子型柱上，收集穿透蛋白溶液；(6)將穿透蛋白溶液上樣到經(jīng)20mM Tris HCl pH8.0緩沖液平衡的陽離子型柱上，進(jìn)行NaCl濃度梯度洗脫，收集50mM NaCl鹽濃度下的洗脫蛋白溶液；(7)將洗脫蛋白溶液上樣到經(jīng)20mM Tris HCl100mM NaCl pH8.0緩沖液平衡的凝膠層析柱上，用20mM Tris HCl100mM NaCl pH8.0緩沖液洗脫，收集活性洗脫峰，脫鹽，冷凍干燥，獲得凍干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種從莜麥中提取α-淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于， 所述的陰離子型柱是Q-S印harose。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種從莜麥中提取α-淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于， 所述的陽離子型柱是Herparin-S印harose。
4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種從莜麥中提取α-淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于， 所述的凝膠層析柱是Sephacryl凝膠層析柱。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從莜麥中提取α-淀粉酶抑制劑的方法，本方法先將莜麥種子去殼粉碎，經(jīng)丙酮脫脂，然后硫酸銨沉淀、離子交換層析及凝膠層析最后獲得電泳純的α-淀粉酶抑制劑，抑制比活為26.43U/mg。本發(fā)明提取α-淀粉酶抑制劑的材料來源于莜麥，提純方法簡便，產(chǎn)品純度高，抑制活性強(qiáng)，提取的α-淀粉酶抑制劑可用于制備減肥和治療糖尿病的藥物。
文檔編號C07K1/18GK101891810SQ20101022438
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者石亞偉, 鈕利喜, 閆永飛 申請人:山西大學(xué)