專利名稱：一種用高速逆流色譜從海參中分離制備腦苷脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海參中食用和藥用活性成分的提純方法，特別是涉及一種用高速 逆流色譜從海參中分離制備腦苷脂的方法。
背景技術(shù)：
海參(Ho lothuri an, sea cucumber)為棘皮云力物門(Echinodermata)海參綱 (Holothuroidea)動(dòng)物，是重要的海洋食品和藥物資源。海參中含有海參多糖、海參皂苷、海 參膠原蛋白肽、海參腦苷脂(Cerebrosides from sea cucumber)、神經(jīng)節(jié)苷脂等多種生物 活性物質(zhì)，具有提高免疫功能、抗腫瘤、抗凝血、降血脂和增強(qiáng)大腦學(xué)習(xí)記憶能力等功效。從 海參的各類生物活性物質(zhì)中尋找和開發(fā)新藥以及功能因子，已成為海參深度開發(fā)利用的重 要方向。海參腦苷脂是一類存在于海參體壁中具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和活性的鞘糖脂類化合物 (sphingolipids)，它屬于中性鞘糖脂，由單糖、長鏈脂肪酸(FA)和長鏈神經(jīng)鞘氨醇?jí)A基 (簡稱長鏈堿，LCB)三部分組成。腦苷脂類化合物主要有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡、抗菌、抗肝毒等生物活性(姜健，楊寶靈，邰陽.海參資源及生物活性物質(zhì)的研究.生 物技術(shù)通訊，2004，15(5) :537-540)。目前文獻(xiàn)報(bào)道，海參腦苷脂主要由三種不同極性 的腦苷脂系列物組成，海參種類和來源不同，所含腦苷脂的結(jié)構(gòu)和功效存有差異(Koji Yamada. Chemo-Pharmaceutical Studies on the Glycosphingolipid Constituents from Echinoderm，SeaCucumbers, as the Medicinal Materials. The Pharmaceutical Society of Japan. 2002,122(12) : 1133-1143)。通常采用正反相硅膠柱層析的方法分離制備腦苷 脂，以除去磷脂、甘油三酯等其它脂質(zhì)成分，過多的層析步驟使得腦苷脂的制備時(shí)間長，損 失較大，得率較低，限制其進(jìn)一步研究。因此，有必要建立一種高效快速的從鮮海參、干海參 及海參制品等樣品中分離制備腦苷脂的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用高速逆流色譜從海參中分離制備腦苷脂的方法，它 能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。一種用高速逆流色譜從海參中分離制備腦苷脂的方法，其特征在于(1)向海參 干粉中加入氯仿甲醇混合液，室溫下浸泡過夜，過濾，按此步驟重復(fù)操作3 8次，合并各次 所得濾液，減壓濃縮后得腦苷脂粗提物；(2)將石油醚、甲醇和水混合，振蕩搖勻，靜置分層 后分離，取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，對(duì)兩相分別進(jìn)行超聲脫氣10 30分鐘；(3) 將上述腦苷脂粗提物溶解于等體積的固定相和流動(dòng)相的混合溶液中，過濾得樣品溶液；(4) 將上述配制好的固定相泵入高速逆流色譜儀的色譜柱中；然后開啟高速逆流色譜儀，調(diào)節(jié) 主機(jī)轉(zhuǎn)速和流動(dòng)相流速，將流動(dòng)相也泵入上述色譜柱內(nèi)；待兩相在色譜柱內(nèi)平衡后，使上述 樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣閥進(jìn)入上述色譜柱；進(jìn)樣完畢后繼續(xù)泵入流動(dòng)相，分步收集分離物，并用薄 層色譜法檢測，合并目標(biāo)物，濃縮，凍干，得到腦苷脂。
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本發(fā)明由于采用了組成和配比合理的混合溶劑，控制主機(jī)轉(zhuǎn)速和流動(dòng)相流速等工 藝條件可獲得高純度的腦苷脂，不需使用固相載體，無不可逆吸附，樣品無損失、無污染、高 效、快速、低成本且可大量分離制備腦苷脂，獲得的腦苷脂純度可達(dá)90%以上，適用于由多 種工藝制備的腦苷脂粗提物中分離制備腦苷脂。


圖1為高速逆流色譜分離葉瓜參腦苷脂的色譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的方法由四個(gè)步驟組成(1)向海參干粉中加入氯仿甲醇混合液，室溫下 浸泡過夜，過濾，按此步驟重復(fù)操作3 8次，合并各次所得濾液，減壓濃縮后得腦苷脂粗 提物；(2)將石油醚、甲醇和水混合，振蕩搖勻，靜置分層后分離，取上相作為固定相，下相 作為流動(dòng)相，對(duì)兩相分別進(jìn)行超聲脫氣10 30分鐘；(3)將上述腦苷脂粗提物溶解于等體 積的固定相和流動(dòng)相的混合溶液中，過濾得樣品溶液；(4)將上述配制好的固定相泵入高 速逆流色譜儀的色譜柱中；然后開啟高速逆流色譜儀，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速和流動(dòng)相流速，將流動(dòng) 相也泵入上述色譜柱內(nèi)；待兩相在色譜柱內(nèi)平衡后，使上述樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣閥進(jìn)入上述色 譜柱；進(jìn)樣完畢后繼續(xù)泵入流動(dòng)相，分步收集分離物，并用薄層色譜法檢測，合并目標(biāo)物，濃 縮，凍干，得到腦苷脂。本發(fā)明中向所述海參干粉中加入氯仿甲醇混合液的量為3 5L/kg海參干粉。所 述氯仿甲醇混合液中氯仿與甲醇的體積比為1 8 1。所述石油醚、甲醇和水的體積比為 4 8 3 4 1。所述主機(jī)轉(zhuǎn)速為500 IOOOrpm ；所述流動(dòng)相流速為1 4mL/min。下面通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例一從葉瓜參(Cucumaria frondosa)中提取制備腦苷脂(1)葉瓜參腦苷脂粗提物 的制備稱取葉瓜參干粉1kg，加4L體積比為1 1的氯仿甲醇混合液，室溫下浸泡過夜， 過濾，按此步驟重復(fù)5次，合并各次所得濾液，減壓濃縮至膏狀，得葉瓜參腦苷脂粗提物，備 用。(2)所用溶劑的配制將體積比為5 4 1的石油醚、甲醇和水置于分液漏斗中，劇 烈振蕩搖勻，使兩相達(dá)到平衡，靜置分層后分離，取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，分別 對(duì)上下相進(jìn)行超聲脫氣20分鐘，冷卻后備用。(3)樣品溶液的制備準(zhǔn)確稱取上述葉瓜參 腦苷脂粗提取物168mg，充分溶解于等體積(各IOmL)的上相和下相的混合溶劑中，過濾，得 樣品溶液。(4)分離制備將上述配制好的固定相(上相)以15mL/min的流速泵入高速逆 流色譜柱，然后開啟制備型高速逆流色譜儀，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速為900rpm，以1. 2mL/min的流速 將流動(dòng)相(下相)也泵入上述色譜柱內(nèi)，待柱內(nèi)兩相建立動(dòng)態(tài)平衡后，使上述樣品溶液由進(jìn) 樣閥進(jìn)樣，進(jìn)樣完畢后繼續(xù)泵入流動(dòng)相，分步收集分離物，并用薄層色譜法檢測。其中所收 集的葉瓜參腦苷脂的保留時(shí)間為275 480min，濃縮，冷凍干燥后得葉瓜參腦苷脂20. 8mg, 得率為12. 4%，經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)檢測，如圖1所示，純度為92. 3%。實(shí)施例二從海地瓜(Acaudina molpadioides)中提取制備腦苷脂(1)海地瓜腦苷脂粗提 物的制備稱取海地瓜干粉lkg，加3L體積比為2 1的氯仿甲醇混合液，室溫下浸泡過夜，
4過濾，按此步驟重復(fù)3次，合并各次所得濾液，減壓濃縮至膏狀，得海地瓜腦苷脂粗提物，備 用。(2)所用溶劑的配制將體積比為5. 5 3.5 1的石油醚、甲醇和水置于分液漏斗中， 劇烈振蕩搖勻，使兩相達(dá)到平衡，靜置分層后分離，取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，分 別對(duì)上下相進(jìn)行超聲脫氣20分鐘，冷卻后備用。(3)樣品溶液的制備準(zhǔn)確稱取上述海地瓜 腦苷脂粗提取物lOOmg，充分溶解于等體積(各IOmL)的上相和下相的混合溶劑中，過濾，得 樣品溶液。(4)分離制備將上述配制好的固定相(上相)以15mL/min的流速泵入高速逆 流色譜柱，然后開啟制備型高速逆流色譜儀，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速為950rpm，以1. 5mL/min的流速 將流動(dòng)相(下相)也泵入上述色譜柱內(nèi)，待柱內(nèi)兩相建立動(dòng)態(tài)平衡后，使上述樣品溶液由進(jìn) 樣閥進(jìn)樣，進(jìn)樣完畢后繼續(xù)泵入流動(dòng)相，分步收集分離物，并用薄層色譜法檢測。其中所收 集的海地瓜腦苷脂的保留時(shí)間為205 400min，濃縮，冷凍干燥后得海地瓜腦苷脂9. 9mg, 得率為9.9%，經(jīng)HPLC檢測，純度為91.0%。實(shí)施例三從仿刺參(Apostichopus japonicus)中提取制備腦苷脂(1)仿刺參腦苷脂粗提 物的制備將鮮仿刺參凍干，粉碎。稱取仿刺參干粉lkg，加3. 6L體積比為3 1的氯仿 甲醇混合液，室溫下浸泡過夜，過濾，按此步驟重復(fù)4次，合并各次所得濾液，減壓濃縮至膏 狀，得仿刺參腦苷脂粗提物，備用。(2)所用溶劑的配制將體積比為5 3.5 1的石油 醚、甲醇和水置于分液漏斗中，劇烈振蕩搖勻，使兩相達(dá)到平衡，靜置分層后分離，取上相作 為固定相，下相作為流動(dòng)相，分別對(duì)上下相進(jìn)行超聲脫氣20分鐘，冷卻后備用。(3)樣品溶 液的制備準(zhǔn)確稱取上述仿刺參腦苷脂粗提取物130mg，充分溶解于等體積(各IOmL)的上 相和下相的混合溶劑中，過濾，得樣品溶液。(4)分離制備將上述配制好的固定相(上相) 以15mL/min的流速泵入高速逆流色譜柱，然后開啟制備型高速逆流色譜儀，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速 為850rpm，以1. 8mL/min的流速將流動(dòng)相(下相)也泵入上述色譜柱內(nèi)，待柱內(nèi)兩相建立動(dòng) 態(tài)平衡后，使上述樣品溶液由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，進(jìn)樣完畢后繼續(xù)泵入流動(dòng)相，分步收集分離物， 并用薄層色譜法檢測。其中所收集的仿刺參腦苷脂的保留時(shí)間為230 330min，濃縮，冷凍 干燥后得仿刺參腦苷脂9. 9mg,得率為7. 6%，經(jīng)HPLC檢測，純度為90. 2%。
權(quán)利要求
一種用高速逆流色譜從海參中分離制備腦苷脂的方法，其特征在于(1)向海參干粉中加入氯仿甲醇混合液，室溫下浸泡過夜，過濾，按此步驟重復(fù)操作3～8次，合并各次所得濾液，減壓濃縮后得腦苷脂粗提物；(2)將石油醚、甲醇和水混合，振蕩搖勻，靜置分層后分離，取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，對(duì)兩相分別進(jìn)行超聲脫氣10～30分鐘；(3)將上述腦苷脂粗提物溶解于等體積的固定相和流動(dòng)相的混合溶液中，過濾得樣品溶液；(4)將上述配制好的固定相泵入高速逆流色譜儀的色譜柱中；然后開啟高速逆流色譜儀，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速和流動(dòng)相流速，將流動(dòng)相也泵入上述色譜柱內(nèi)；待兩相在色譜柱內(nèi)平衡后，使上述樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣閥進(jìn)入上述色譜柱；進(jìn)樣完畢后繼續(xù)泵入流動(dòng)相，分步收集分離物，并用薄層色譜法檢測，合并目標(biāo)物，濃縮，凍干，得到腦苷脂。
2.按權(quán)利要求1所述用高速逆流色譜從海參中分離制備腦苷脂的方法，其特征在于向 所述海參干粉中加入氯仿甲醇混合液的量為3 5L/kg海參干粉。
3.按權(quán)利要求1所述用高速逆流色譜從海參中分離制備腦苷脂的方法，其特征在于所 述氯仿甲醇混合液中氯仿與甲醇的體積比為1 8 1。
4.按權(quán)利要求1所述用高速逆流色譜從海參中分離制備腦苷脂的方法，其特征在于所 述石油醚、甲醇和水的體積比為4 8 3 4 1。
5.按權(quán)利要求1所述用高速逆流色譜從海參中分離制備腦苷脂的方法，其特征在于所 述主機(jī)轉(zhuǎn)速為500 IOOOrpm ；所述流動(dòng)相流速為1 4mL/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用高速逆流色譜從海參中分離制備腦苷脂的方法，其特征在于向海參干粉中加入氯仿和甲醇混合液，室溫浸泡，濾液濃縮后得到腦苷脂粗提物；將石油醚、甲醇和水混合，對(duì)形成的固定相和流動(dòng)相分別進(jìn)行超聲脫氣；所得粗提物采用該混合溶劑溶解后過濾制得樣品溶液；先將固定相泵入高速逆流色譜儀的色譜柱中，然后調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速和流動(dòng)相流速，泵入流動(dòng)相，待兩相平衡后，經(jīng)進(jìn)樣閥將樣品溶液泵入色譜柱中，再繼續(xù)泵入流動(dòng)相，分步收集，并用薄層色譜法檢測，合并目標(biāo)物，濃縮，凍干，得到腦苷脂。本發(fā)明制備工藝簡單、操作簡便、純化效率高、分離時(shí)間短、穩(wěn)定性好，適用于多種海參樣品中腦苷脂的分離制備，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H1/08GK101891776SQ201010227080
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月11日
發(fā)明者馮婷玉, 孫通, 徐杰, 李兆杰, 王靜鳳, 董平, 薛長湖 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)