專利名稱：一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然植物提取領(lǐng)域，涉及一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝。
背景技術(shù)：
毛蘭素(Erianin)，中文系統(tǒng)名3_羥基_4，3’，4’，5’ -四甲氧基聯(lián)芐；分子式 C18H22O5 ；分子結(jié)構(gòu)式如下毛蘭素為聯(lián)芐類化合物，易溶于乙醇、氯仿、丙酮、甲醇等有機溶劑，極微溶于水。洪衛(wèi)等(毛蘭素對胃癌細胞SGC-7901端粒酶活性的影響.洪衛(wèi)，郭勇，馬勝林， 等.浙江實用醫(yī)學(xué)，2009，14(3) 181-182.)通過實驗發(fā)現(xiàn)毛蘭素能明顯抑制胃癌細胞 SGC-7901增殖，表現(xiàn)為濃度依賴性，48小時IC5tl為0. 056 μ g/ml，研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素可以快 速抑制胃癌細胞SGC-7901的端粒酶活性，8小時就可見端粒酶活性抑制，48小時就可以抑 制端粒酶活性的80%，初步觀察表明對端粒酶活性的抑制與藥物濃度相關(guān)。由于實驗研究 在24小時這個時間點才見到毛蘭素誘導(dǎo)的胃癌細胞SGC-7901細胞凋亡明顯增加，因此， 推斷這種毛蘭素對胃癌細胞SGC-7901端粒酶活性的抑制，可能參與了毛蘭素誘導(dǎo)胃癌細 胞SGC-7901凋亡的作用機制，但尚需進一步研究來證實。王天山等的研究結(jié)果(鼓槌石斛 中化學(xué)成分對K562中瘤細胞株生長抑制作用體外試驗，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，9 (2) 1-3)表明，聯(lián)芐類和菲類化合物對體外培養(yǎng)的鼠類L121tl微管蛋白的聚集及有絲分裂、P388 細胞株、多種人體腫瘤細胞株如A-549、MCF-7、HT-29、SKMEL-5、MLM、SK-0V-3、HL-60均有 抑制作用。鼓槌石斛中的二氫聯(lián)芐類和菲類化合物對腫瘤細胞株K526的生長具有不同程度 的抑制作用，尤以毛蘭素(Erianin、DihydroCombretastatin A-4)的活性最強。李運曼等 (毛蘭素誘導(dǎo)人白血病HL-60細胞的凋亡.李運曼，王海燕，劉國卿.中國藥理學(xué)報，2001， 22(11) :1022.)研究表明毛蘭素顯著抑制HL-60細胞的生長，該抑制作用可能是通過誘導(dǎo) 細胞凋亡和改變HL-60細胞bcl-2和bax基因的表達而實現(xiàn)的。二十世紀(jì)九十年代我國學(xué)者從石斛中分離提取出毛蘭素，其提取方法是用氯仿或 苯為提取溶媒并用超聲處理30分鐘進行提取，提取物再經(jīng)硅膠柱柱層析分離得白色不定 形的毛蘭素結(jié)晶粉末；該方法的缺點是有機溶媒用量大(是石斛原料的10倍多)，成本 高，時間長，而且對環(huán)境污染嚴重。中國專利申請03115752. 1公開了從石斛中提取毛蘭素 的方法，包括應(yīng)用超臨界CO2萃取和柱層析法以無水乙醇、甲醇、丙酮等為夾帶劑，以CO2等 位提取介質(zhì)從蘭科植物石斛中提取抗腫瘤成分毛蘭素，對所得的粗提物再以石油醚醋酸乙酯溶液為洗脫劑進行硅膠柱柱層析分離及重結(jié)晶等步驟獲得精提物；由于上述提取方法 對技術(shù)要求較高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的小足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素 的工藝。本發(fā)明從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于包括以下步驟(1)制備乙酸乙酯總提取物取鼓槌石斛藥材粉碎，用3-8倍藥材質(zhì)量的乙酸乙酯 室溫浸泡2-7天，常壓過濾，收集乙酸乙酯提取液A ；將提取后的藥渣用其2-6倍質(zhì)量的乙 醇微波提取5-30分鐘，收集乙醇提取液，合并得乙醇提取液，濃縮得浸膏，用2-3倍體積的 乙酸乙酯萃取浸膏3-6次，收集、合并乙酸乙酯萃取液B ；將上述A、B兩部分乙酸乙酯液合 并，于85-90°C條件下蒸餾至流浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物；(2)柱層析分離將上述乙酸乙酯總提物用其2-5倍量的150-300目氧化鋁拌樣， 進行氧化鋁柱層析，先以水洗至洗出液近無色，再以石油醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中的一 種或兩種以上組合的混合溶液系統(tǒng)梯度洗脫，收集流分，同時用硅膠薄層層析檢識，合并收 集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，濃縮析晶，甲醇或丙酮重結(jié)晶，干燥得毛蘭素。步驟⑴所述提取過程中所用乙醇為體積百分比為70-99%的乙醇溶液。步驟(1)所述微波輔助提取過程中微波功率為200-500W。步驟⑴所述乙醇提取液濃縮過程中濃縮條件為溫度60_65°C，真空度為 0.06-0. IMpa0步驟(2)所述氧化鋁為中性氧化鋁，柱徑高比為1 5-10。步驟(2)所述洗脫溶劑為丙酮、甲醇或乙醇中的一種，或石油醚-丙酮(98 90 2 10)、石油醚-氯仿(98 80 2 20)、石油醚-氯仿-甲醇(98 85 2 10 2 8)、石油醚-氯仿-丙酮(98 85 2 10 2 8)。本發(fā)明從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，提取方法簡單、提取率高，氧化鋁柱分離 效果好，產(chǎn)品純度高，可達97%以上。本發(fā)明提取的毛蘭素可為開發(fā)應(yīng)用新一代天然來源的抗腫瘤藥物開拓了新徑。下面將結(jié)合具體實施方式
進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限 于下列實施方式。
具體實施例方式實施例1 將從云南采購的鼓槌石斛干燥品粉碎，取Ikg用6倍鼓槌石斛質(zhì)量的乙酸乙酯室 溫浸泡4天，常壓過濾，收集乙酸乙酯提取液A，重復(fù)2次，合并提取液A。將第二次提取后 的藥渣用3倍量90 %乙醇于400W微波提取10分鐘，提取3次，常壓過濾，收集乙醇提取液， 合并，于65°C條件下減壓(真空度為0. 09Mpa)濃縮得乙醇浸膏，用相當(dāng)于浸膏2倍量的乙 酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B兩部分乙酸乙酯萃取液，于80°C條件下 真空(真空度為0. 095Mpa)濃縮得浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物。將上述乙酸乙酯總提物用其3倍量的150-300目的氧化鋁拌樣，進行氧化鋁柱層
4析(徑高比為1 7)，石油醚-氯仿-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，硅膠薄層層析檢識，收集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，回收試劑，濃縮析晶，甲醇反復(fù)重結(jié)晶得毛蘭素15g，純度為98. 57%。實施例2 將從云南采購的鼓槌石斛干燥品粉碎，取2. 5kg用7倍鼓槌石斛質(zhì)量的乙酸乙酯 室溫浸泡6天，常壓過濾，收集乙酸乙酯提取液A，重復(fù)3次，合并提取液A。將第三次提取 后的藥渣用4倍量95%乙醇于350W微波提取15分鐘，提取3次，常壓過濾，收集乙醇提取 液，合并，于62°C條件下減壓(真空度為0.085Mpa)濃縮得乙醇浸膏，用相當(dāng)于浸膏3倍量 的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B兩部分乙酸乙酯萃取液，于85°C條 件下真空(真空度為0. 095Mpa)濃縮得浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物。將上述乙酸乙酯總提物用其4倍量的150-300目的氧化鋁拌樣，進行氧化鋁柱層 析(徑高比為1 6)，石油醚-氯仿系統(tǒng)梯度洗脫，硅膠薄層層析檢識，收集Rf = 0.2-0.6 相同流分，回收試劑，濃縮析晶，乙醇反復(fù)重結(jié)晶得毛蘭素37. lg，純度為98. 35%。實施例3 將從云南采購的鼓槌石斛干燥品粉碎，取5kg用8倍鼓槌石斛質(zhì)量的乙酸乙酯室 溫浸泡5天，常壓過濾，收集乙酸乙酯提取液A，重復(fù)2次，合并提取液A。將第二次提取后 的藥渣用4倍量90 %乙醇于350W微波提取20分鐘，提取2次，常壓過濾，收集乙醇提取液， 合并，于60°C條件下減壓(真空度為0. 090Mpa)濃縮得乙醇浸膏，用相當(dāng)于浸膏3倍量的乙 酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B兩部分乙酸乙酯萃取液，于90°C條件下 真空(真空度為0.095Mpa)濃縮得浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物。將上述乙酸乙酯總提物用其4倍量的150-300目的氧化鋁拌樣，進行氧化鋁柱層 析(徑高比為1 5)，石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，硅膠薄層層析檢識，收集Rf = 0.2-0.6 相同流分，回收試劑，濃縮析晶，乙醇反復(fù)重結(jié)晶得毛蘭素72g，純度為97. 83%。實施例4 將從云南采購的鼓槌石斛干燥品粉碎，取8kg用6倍鼓槌石斛質(zhì)量的乙酸乙酯室 溫浸泡5天，常壓過濾，收集乙酸乙酯提取液A，重復(fù)2次，合并提取液A。將第二次提取后 的藥渣用3倍量85 %乙醇于350W微波提取12分鐘，提取3次，常壓過濾，收集乙醇提取液， 合并，于65°C條件下減壓(真空度為0. 078Mpa)濃縮得乙醇浸膏，用相當(dāng)于浸膏2倍量的乙 酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B兩部分乙酸乙酯萃取液，于85°C條件下 真空(真空度為0.095Mpa)濃縮得浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物。將上述乙酸乙酯總提物用其5倍量的150-300目的氧化鋁拌樣，進行氧化鋁柱層 析(徑高比為1 10)，石油醚-氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，硅膠薄層層析檢識，收集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，回收試劑，濃縮析晶，甲醇反復(fù)重結(jié)晶得毛蘭素120g，純度為98. 47%。實施例5:將從云南采購的鼓槌石斛干燥品粉碎，取12. 5kg用5倍鼓槌石斛質(zhì)量的乙酸乙酯 室溫浸泡5天，常壓過濾，收集乙酸乙酯提取液A，重復(fù)3次，合并提取液A。將第三次提取 后的藥渣用4倍量95%乙醇于280W微波提取23分鐘，提取2次，常壓過濾，收集乙醇提取 液，合并，于63°C條件下減壓(真空度為0. 086Mpa)濃縮得乙醇浸膏，用相當(dāng)于浸膏3倍量 的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B兩部分乙酸乙酯萃取液，于90°C條 件下真空(真空度為0.095Mpa)濃縮得浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物。
將上述乙酸乙酯總提物用其4倍量的150-300目的氧化鋁拌樣，進行氧化鋁柱層 析(徑高比為1 9)，石油醚-氯仿-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，硅膠薄層層析檢識，收集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，回收試劑，濃縮析晶，甲醇反復(fù)重結(jié)晶得毛蘭素181g，純度為98. 24%。
權(quán)利要求
一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其工藝包括以下步驟(1)制備乙酸乙酯總提取物取鼓槌石斛藥材粉碎，用3 8倍藥材質(zhì)量的乙酸乙酯室溫浸泡2 7天，常壓過濾，收集乙酸乙酯提取液A；將提取后的藥渣用其2 6倍質(zhì)量的乙醇微波提取5 30分鐘，收集乙醇提取液，合并得乙醇提取液，濃縮得浸膏，用2 3倍體積的乙酸乙酯萃取浸膏3 6次，收集、合并乙酸乙酯萃取液B；將上述A、B兩部分乙酸乙酯液合并，于85 90℃條件下蒸餾至流浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物；(2)柱層析分離將上述乙酸乙酯總提物用其2 5倍量的150 300目氧化鋁拌樣，進行氧化鋁柱層析，先以水洗至洗出液近無色，再以石油醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中的一種或兩種以上組合的混合溶液系統(tǒng)梯度洗脫，收集流分，同時用硅膠薄層層析檢識，合并收集Rf＝0.2 0.6相同流分，濃縮析晶，甲醇或丙酮重結(jié)晶，干燥得毛蘭素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于步驟(1) 所述提取過程中所用乙醇為體積百分比為70-99%的乙醇溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于步驟(1) 所述微波輔助提取過程中微波功率為200-500W。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于步驟(1) 所述乙醇提取液濃縮過程中濃縮條件為溫度60-65°C，真空度為0. 06-0. IMpa0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于步驟(2) 所述氧化鋁為中性氧化鋁，柱徑高比為1 5-10。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于步驟(2) 所述洗脫溶劑為丙酮、甲醇或乙醇中的一種，或石油醚-丙酮(98 90 2 10)、石油 醚-氯仿(98 80 2 20)、石油醚-氯仿-甲醇(98 85 2 10 2 8)、石油 醚_氯仿_丙酮(98 85 2 10 2 8)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于通過浸漬提取和微波輔助提取的方法制備鼓槌石斛乙酸乙酯提取物；再經(jīng)與氧化鋁拌樣上柱層析，有機溶劑洗脫，硅膠薄層層析檢識，收集Rf＝0.2-0.6相同流分，回收試劑，濃縮析晶，甲醇或丙酮重結(jié)晶，干燥即得毛蘭素。本發(fā)明提取的化合物為開發(fā)應(yīng)用新一代天然來源的抗腫瘤藥物開拓了新途徑。
文檔編號C07C41/36GK101973857SQ20101023581
公開日2011年2月16日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者劉東鋒, 楊成東, 郭琴 申請人:南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司