專利名稱：一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及在體內(nèi)和體外能夠靶向傳遞逆轉(zhuǎn)錄病毒的高效基因治療技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法。
背景技術(shù)：
目前，高效的基因治療工具已經(jīng)具備能夠準(zhǔn)確通過適當(dāng)?shù)妮d體將目的基因送達(dá)體內(nèi)特異性細(xì)胞或者組織的特點。逆轉(zhuǎn)錄病毒，如慢病毒，因其自身具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可整合入基因組長期表達(dá)，以及促進(jìn)感染細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為非分裂細(xì)胞等功能顯示出了良好的應(yīng)用前
旦
ο許多研究以病毒載體假型嵌和包膜相結(jié)合的方法研制開發(fā)出了針對慢病毒包膜蛋白的嵌合抗體，目前已經(jīng)提高了慢病毒的基因傳遞特異性。在未來基因治療領(lǐng)域中，這些研究工作為進(jìn)一步修飾和改進(jìn)傳遞載體系統(tǒng)方法的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在眾多方法中一個相類似的策略就是應(yīng)用非偶聯(lián)的方法靶向識別細(xì)胞，這種方法是采用融合表達(dá)的方法使獨立的蛋白表達(dá)在病毒載體的表面。該方法已被證實，其制備更為簡便，同時可以促進(jìn)Y逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體靶向特異性細(xì)胞。這種方法采用配體蛋白或者細(xì)胞特異性抗體作為橋梁在體外將載體靶向傳遞到未經(jīng)修飾的具有禽肉瘤或者造血細(xì)胞組織增生病毒的特異性細(xì)胞包膜蛋白處。25年前，單克隆抗體和重組DNA技術(shù)的結(jié)合使得構(gòu)建在正常自然條件下所存在的以抗體為基礎(chǔ)的生物分子成為可能。其中，第一批雙向特異性抗體，其表面類似普通免疫球蛋白分子，但是其中兩個結(jié)合臂卻具有截然不同的結(jié)合特異性。使用該種方法Staerz等人將雙向特異性抗體結(jié)合于細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而達(dá)到靶向裂解腫瘤細(xì)胞的目的。從那以后， 人們構(gòu)建了不同種類的雙向特異性抗體來靶向腫瘤細(xì)胞。但是，這種方法的特點和局限性也逐漸顯示出來。與此同時，將雙向特異性抗體結(jié)合于其他細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的生物工程治療方法也已經(jīng)陸續(xù)被研發(fā)和構(gòu)建出來。例如靶向巨噬細(xì)胞表面的FcgRI/CD64和腫瘤細(xì)胞表面的HER2/neU或者EGFR。同時，越來越多的嵌合抗體及其與化療藥物偶聯(lián)的藥物已經(jīng)在試驗中取得了良好的結(jié)果且被批準(zhǔn)應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。盡管科研人員不斷改進(jìn)并減少生物工程制劑在臨床應(yīng)用過程中存在的問題，但單克隆抗體治療腫瘤仍然具有其局限性，藥物的靶向傳遞效率依然未能達(dá)到理想水平。然而， 正是這些在臨床治療中存在的問題為生物工程藥物的進(jìn)一步改進(jìn)提出了要求。臨床治療中，針對不同疾病的有效基因治療方法應(yīng)具備以下特點利用最佳條件高效并特異性靶向傳遞治療基因到目的細(xì)胞；同時，還要保持該基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和長期表達(dá)特性。目前，常采用血液直接注射的方法將藥物引入體內(nèi)，然后通過載體歸巢的方法將目的基因靶向傳遞至細(xì)胞或者器官。因此，現(xiàn)階段已經(jīng)有研究應(yīng)用生物工程和基因重組的方法以不同病毒載體為基礎(chǔ)開發(fā)出靶向基因治療傳遞系統(tǒng)。腺病毒和腺相關(guān)病毒載體已經(jīng)因為它們具有結(jié)合和感染機(jī)理單一的優(yōu)點而被應(yīng)用于靶向基因傳遞策略。盡管這些經(jīng)過改進(jìn)的病毒載體已經(jīng)被成功應(yīng)用于體外靶向特異性細(xì)胞，但卻因為它們自身的非特異導(dǎo)向性(特別是在肝臟細(xì)胞)以及改構(gòu)以后影響病毒載體的感染能力等缺點，使得它們在體內(nèi)的應(yīng)用受到了限制。與腺病毒不同，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒是介導(dǎo)多核酸進(jìn)入細(xì)胞(如真核細(xì)胞)的另一種重要工具?！敖閷?dǎo)”一詞包括多種將多核苷酸轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的方法。其中包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染等。逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，因此病毒基因組是RNA，當(dāng)宿主細(xì)胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒后， 基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成為DNA中間體，介導(dǎo)病毒基因高效整合入感染細(xì)胞的染色體DNA中。整合的DNA中間體是指前病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒家族是包膜單鏈RNA病毒，主要感染哺乳動物，如牛、猴、羊和人以及禽類和鼠類等。逆轉(zhuǎn)錄病毒在眾多RNA病毒中，以它們通過RNA合成DNA 拷貝并且能夠整合入感染細(xì)胞的基因組的多種特殊方式而顯示出其獨特的應(yīng)用價值。逆轉(zhuǎn)錄病毒家族中按照目前國際病毒分類標(biāo)準(zhǔn)，可分為7個屬α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬 Alpharetrovirus, β 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬 Betaretrovirus, γ 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬 Gammaretrovirus, δ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬 Deltaretrovirus, ε逆轉(zhuǎn)錄病毒屬Epsilonretrovirus,慢病毒屬 Lentivirus和泡沫病毒屬Spumavirus。其中，慢病毒包括HIV-1、HIV-2和SIV ； γ逆轉(zhuǎn)錄病毒包括白血病病毒(鼠白血病病毒MLVs和貓白血病病毒)。如何將逆轉(zhuǎn)錄病毒應(yīng)用于體內(nèi)靶向特異性細(xì)胞或組織目前還是一個難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法，以克服克服現(xiàn)有技術(shù)存在的靶向傳遞逆轉(zhuǎn)錄病毒制備效率低、體內(nèi)靶向性差的問題。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備方法，依次包括下述步驟 步驟一、通過免疫小鼠制備抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白(VSV-G)以及特異性靶向標(biāo)志物的抗體細(xì)胞。步驟二、分別構(gòu)建相應(yīng)的抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫，分別篩選能夠與逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白或特異性靶蛋白特異性結(jié)合的噬菌體個體。步驟三、根據(jù)步驟二中篩選獲得的噬菌體，將編碼抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白與特異性靶向標(biāo)志物的單鏈可變區(qū)片斷的cDNA克隆，重組表達(dá)雙向特異性配體。步驟四、雙向特異性配體與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)合。上述步驟一中，特異性靶向標(biāo)志物的抗體是指抗EGFR (EGF受體)、EpCAM (表皮細(xì)胞粘附分子)、EphA2 (Eph受體酪氨酸激酶A2)、Her2 (人EGF受體2)等特異性腫瘤或某種疾病的標(biāo)志物分子。本發(fā)明中所描述的以雙向特異性配體介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向體內(nèi)細(xì)胞和組織的制備方法通過聯(lián)合使用逆轉(zhuǎn)錄病毒以及雙向特異性親和配體將基因選擇性傳遞到靶細(xì)胞或者組織。在以下具體的實施例中，逆轉(zhuǎn)錄病毒為慢病毒。其他逆轉(zhuǎn)錄病毒也可以在該系統(tǒng)中應(yīng)用于靶向傳遞基因。選擇性傳遞基因到靶細(xì)胞或者組織已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療、感染性疾病的治療和基因紊亂疾病的治療等。本發(fā)明中所說的雙向特異性親和配體可以選擇性結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶向細(xì)胞或者組織。該配體可以先與逆轉(zhuǎn)錄病毒混合，然后應(yīng)用于治療；將二者同時應(yīng)用于治療；或者在病毒應(yīng)用后再用配體治療。雙向特異性配體至少有2個結(jié)合區(qū)域。一個可以與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合，另一個可以與靶細(xì)胞或者組織結(jié)合。2 個結(jié)合部分通過共價鍵結(jié)合在一起。好的雙向特異性配體不會抑制病毒與細(xì)胞的融合。其中，雙向特異性配體包括雙向特異性抗體、雙向特異性適體、雙向特異性小分子及嵌合體 (一個結(jié)合區(qū)域是小分子，另一個結(jié)合區(qū)是抗體)。本發(fā)明中，雙向特異性配體可以包括2個以上的結(jié)合區(qū)域。例如特異性結(jié)合于病毒表面蛋白的多適體?？梢酝ㄟ^多聚體載體(例如多賴氨酸，聚丙烯酸或類似物)形成雙向特異性親和配體被偶聯(lián)于多個特異性靶向細(xì)胞表面蛋白的抗體。將雙向特異性配體與病毒結(jié)合后，去除多余的未結(jié)合配體后即可用于治療。同時， 還可以通過偶聯(lián)的方法將雙向特異性配體共價偶聯(lián)(或加入交聯(lián)試劑進(jìn)行偶聯(lián)，例如戊醛或DIC)于病毒，但需要進(jìn)一步確定雙向特異性配體與病毒復(fù)合物的穩(wěn)定性，。盡管，近來的許多研究證實慢病毒可以在體內(nèi)以假型病毒的模式傳遞至特異性靶細(xì)胞。然而，重要的是細(xì)胞的非特異性傳遞仍然存在。該問題主要是因為嵌合包膜蛋白上的非特異性結(jié)合區(qū)未能得到很好的封閉。雙特異性配體則能通過特異性封閉慢病毒載體而較好地解決這個問題。一個好的雙向特異性配體可以通過其一端與包膜糖蛋白非特異性結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而其另一端則可以特異性將病毒直接導(dǎo)向靶位。這一策略與嵌合包膜蛋白相比具有兩個優(yōu)點第一，它阻斷了病毒的非特異性結(jié)合區(qū)；第二，在病毒制備的時候保證了病毒包膜蛋白的完整性，從而降低對病毒包裝的影響，使病毒的制備達(dá)到較高的滴度。該病毒傳遞系統(tǒng)與傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向策略相比較具有三個優(yōu)點
(1)通過雙向配體的封閉端阻斷并封閉所傳遞病毒的非特異性結(jié)構(gòu)表位的結(jié)合能力；
(2)通過本發(fā)明所述的方法篩選并構(gòu)建的雙向特異性配體具有靶向和封閉逆轉(zhuǎn)錄病毒非特異性結(jié)合區(qū)的雙重作用；
(3)通過本發(fā)明所述的方法篩選并構(gòu)建的雙向特異性配體與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合不影響逆轉(zhuǎn)錄病毒制備的滴度。
具體實施例方式下面將通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明
實施例1 制備雙向特異性抗體靶向Her2腫瘤細(xì)胞傳遞慢病毒的具體方法，依次包括下述步驟
步驟一、通過免疫小鼠制備抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白(VSV-G)以及抗Her2抗體細(xì)胞。a. VSV-G 抗原選擇
成熟VSV-G蛋白或其結(jié)合區(qū)域可用于免疫小鼠，從而制備單鏈可變區(qū)片斷抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫。b.制備單克隆抗體的抗原免疫方法抗原成熟VSV-G蛋白
佐劑完全弗氏佐劑，不完全弗氏佐劑； 小鼠體重20g, Balb/C小鼠，雄性
免疫方法第一天，初始免疫，抗原與完全弗氏佐劑200μ 1混懸成乳濁液，皮下四點注射，每只200 μ 1 ；第14天，第二次免疫，抗原與不完全弗氏佐劑200 μ 1混懸成乳濁液，皮下四點注射，每只200 μ 1 ’第24天，第三次免疫，抗原與不完全弗氏佐劑200 μ 1混懸成乳濁液，皮下四點注射，每只200 μ 1 ；第35天，第四次免疫，抗原與不完全弗氏佐劑200 μ 1混懸成乳濁液，靜脈注射，每只200 μ 1 ；第42天，尾靜脈取血檢測抗體滴度；第45天，第五次免疫，抗原與不完全弗氏佐劑200 μ 1混懸成乳濁液，靜脈注射，每只200 μ 1 ；第66天，第六次免疫，抗原與PBS 200 μ 1混勻，腹腔注射；4天后進(jìn)行細(xì)胞融合實驗。c.抗腫瘤表面抗原Her2蛋白單鏈可變區(qū)片斷的制備
抗Her2 (人EGF受體2)單鏈可變區(qū)片斷的制備。可以參考有關(guān)文獻(xiàn)中所提示的序列片斷結(jié)構(gòu)構(gòu)建，也可以按照上述a和b的方法免疫小鼠產(chǎn)生抗體細(xì)胞。步驟二、構(gòu)建抗慢病毒或Her2抗體的單鏈可變區(qū)片斷的抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫，方法如下
a.抗VSV-G蛋白抗體單鏈可變區(qū)片斷噬菌體呈現(xiàn)文庫的制備(具體方法參見Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Editor(s): Philippa M. 0' Brienl, Robert Aitken. Series: Methods in Molecular Biology, Volume No. : 178, Print ISBN: 978-0-89603-906-3)
從上述經(jīng)免疫雄性Balb/C小鼠脾臟和骨髓中提取總RNA(具體方法參見分子克隆第三版)。使用前保存于-70° C。使用MMuLv、01igo-dT18和隨機(jī)六聚體引物以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA(具體方法參見分子克隆第三版以及ProtoScript M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書，New England Biolabs公司)。通過后續(xù)3次PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增并重組合成重鏈，κ 輕鏈和λ輕鏈的可變區(qū)基因(VH，V κ和νλ)。第一次PCR產(chǎn)物由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成。 重鏈5’引物設(shè)計時引入SfiI位點，輕鏈3’引物引入NotI位點。輕鏈5’引物同時還含有鏈接區(qū)域(Gly4Ser)3。重鏈3’端引物與之相應(yīng)。和νλ基因的等量PCR產(chǎn)物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作方法經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后將VH和Vk混合。第二次PCR，使用pfu (DNA聚合酶)擴(kuò)增并組裝重鏈和輕鏈。組裝PCR反應(yīng)包括等摩爾混合重鏈(VH)和輕鏈(V κ或V λ )基因產(chǎn)物。 第三次PCR反應(yīng)根據(jù)第二次PCR產(chǎn)物加入篩選出的相應(yīng)基因弓I物PCR構(gòu)建全長單鏈可變區(qū)片斷基因。使用Pfu聚合酶和1 μ 1第二次PCR獲得的組合產(chǎn)物反應(yīng)，此次獲得的產(chǎn)物是從 SfiI到NotI經(jīng)過充分?jǐn)U增延長的單鏈可變區(qū)片斷基因，樣品經(jīng)過純化后可用于后續(xù)克隆。使用SfiI和NotI對PCR擴(kuò)增得到的單鏈可變區(qū)片斷cDNA和pCANTAB5E噬菌體中間載體進(jìn)行雙酶切。將單鏈可變區(qū)片斷產(chǎn)物插入PCANTAB5E載體中產(chǎn)生單鏈可變區(qū)片斷基因融合文庫。b.抗Her2蛋白抗體單鏈可變區(qū)片斷噬菌體呈現(xiàn)文庫的制備方法與a相同。c.篩選文庫獲得高親和力抗體的片斷序列
分別使用成熟的VSV-G結(jié)合區(qū)與Her2抗原蛋白在噬菌體文庫中篩選高親和力克隆。使用96孔板篩選呈現(xiàn)特異性單鏈可變區(qū)片斷的噬菌體顆粒。將不同的蛋白抗原按照 (50-600 μ g/ml)包被于孔中。每個文庫中加入IO11和IO12個噬菌體顆粒，室溫孵育2小時。 用PBST (0. l%Tween-20)洗10次，去除未結(jié)合的噬菌體。然后用PBS洗10次。用50 μ 1 的50mM甘胺鹽酸ρΗ2.0 (10分鐘后立即中和至pH7. 4)。洗脫結(jié)合的噬菌體。將洗脫下來的噬菌體感染指數(shù)生長時期的大腸桿菌TGl細(xì)胞。挑取單一噬菌體感染的克隆并擴(kuò)增噬菌體顆粒。加入M13K07或KM13輔助噬菌體培養(yǎng)，每個抗原選擇2_3輪后，使用ELISA方法鑒定抗原結(jié)合能力。
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步驟三、構(gòu)建靶向Her2腫瘤細(xì)胞傳遞慢病毒的雙向特異性單鏈可變區(qū)片斷，方法如下
使用連接體(Gly4Ser)混合兩單鏈可變區(qū)片斷(抗VSV-G和抗Her2腫瘤表面抗原)并表達(dá)雙向特異性抗體(具體方法參見Generation of Bispecific and Tandem Diabodies, Chapter 14, Robert Aitken (ed. ), Antibody Phage Display, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 562)。第一次PCR為獨立產(chǎn)生兩個不同單鏈可變區(qū)片斷的反應(yīng)。第一個單鏈可變區(qū)片斷的5’引物與第二個單鏈可變區(qū)片斷的3’引物分別引入適當(dāng)?shù)目捎糜诳寺〉南拗菩悦盖形稽c。第二個單鏈可變區(qū)片斷的5’引物含有連接區(qū)域的部分可以與第一個單鏈可變區(qū)的3’ 引物相配對。經(jīng)凝膠純化后取兩個PCR的等量產(chǎn)物混合后，經(jīng)pfu (DNA聚合酶)組裝并延伸(不加引物)。第三次反應(yīng)由第二次PCR產(chǎn)物加入具有適當(dāng)酶切位點的第一次單鏈可變區(qū)片斷5’引物和第二次單鏈可變區(qū)片斷3’引物構(gòu)建全長(2個單鏈可變區(qū)片斷串聯(lián)體)2。將 PCR產(chǎn)物純化后克隆進(jìn)入CMV載體，并在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生雙向特異性抗體(scFV2)。步驟四、雙向抗體與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)合將適量抗VSV-G和抗Her2腫瘤表面抗原的雙向抗體與有GFP標(biāo)記或無標(biāo)記的的慢病毒混合。實施例2 制備雙向特異性抗體靶向PSCA腫瘤細(xì)胞傳遞慢病毒的具體方法，依次包括下述步驟
前列腺癌是發(fā)病率較高的腫瘤之一，是目前美洲男性腫瘤致死的第二大病因。前列腺癌常因為轉(zhuǎn)移入骨和表現(xiàn)為激素非依賴性腫瘤生長形式而導(dǎo)致死亡。生理性前列腺腫瘤模型的發(fā)現(xiàn)和建立，如LAPC-9移植瘤模型，為前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)理和治療相關(guān)領(lǐng)域的研究奠定了基礎(chǔ)。通過前列腺癌細(xì)胞抗原(PSCA)靶向前列腺腫瘤細(xì)胞的具體方法是
步驟一、通過免疫小鼠制備抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白(VSV-G)以及抗PSCA抗體細(xì)胞。具體方法與實施例1相同，不同之處在于靶向特異性腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物為PSCA蛋白。步驟二、構(gòu)建抗慢病毒或PSCA抗體的單鏈可變區(qū)片斷的抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫。具體方法與實施例1相同，不同之處在于靶向特異性腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物為PSCA蛋白。步驟三、構(gòu)建靶向PSCA腫瘤細(xì)胞傳遞慢病毒的雙向特異性單鏈可變區(qū)片斷，具體方法與實施例1相同，不同之處在于靶向特異性腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物為PSCA蛋白。步驟四、雙向特異性配體與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)合。具體方法與實施例1相同。LAPC-9細(xì)胞來源于人骨轉(zhuǎn)移，可經(jīng)過移植入SCID小鼠后形成表達(dá)前列腺特異性抗原和野生型雄激素受體(Id)的荷瘤小鼠模型。經(jīng)過篩選后約一半為激素非依賴性和微轉(zhuǎn)移性小鼠模型，是臨床研究人前列腺腫瘤發(fā)生和發(fā)展機(jī)理的良好模型。我們制備的雙向特異性抗體可以特異性將慢病毒傳遞入活體動物的前列腺癌中， 并且我們制備的載體在LAPC-9模型系統(tǒng)中也顯示出了良好的作用。PSCA編碼一個具有 123位氨基酸的蛋白。氨基末端具有信號序列(一個碳端GPI鉚定序列和多氮糖基化位點)。 PSCA的mRNA在雄激素依賴和非依賴前列腺荷瘤小鼠體內(nèi)均表達(dá)上調(diào)。PSCA表達(dá)于80%以上的前列腺癌和LAPC-9移植瘤中，是一個確定的治療靶位。因此，在該實施例中，我們將具有抗PSCA和抗VSV-G特性的雙向特異性抗體與慢病毒載體相結(jié)合進(jìn)行靶向治療。實施例3 雙向特異性抗體靶向Her2腫瘤細(xì)胞傳遞慢病毒的體內(nèi)和體外傳遞效果的鑒定方法
a.將混合產(chǎn)物分別加入表達(dá)和不表達(dá)特異性腫瘤表面抗原Her2的腫瘤細(xì)胞:MCF_7 (Her2-)和SK0V-3 (Her2+),分別在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)第2和第3天通過流式細(xì)胞術(shù)檢測2 組不同腫瘤細(xì)胞GFP的表達(dá)效率。計數(shù)不同組細(xì)胞中GFP的陽性率，不表達(dá)特異性腫瘤表面抗原的腫瘤細(xì)胞GFP陽性率應(yīng)小于90% ；表達(dá)特異性腫瘤表面抗原的腫瘤細(xì)胞GFP陽性率應(yīng)大于90%。 b.將混合產(chǎn)物經(jīng)靜脈注射入MCF-7 (Her2-^nSK0V_3 (Her2+)荷瘤小鼠體內(nèi)，檢測GFP在腫瘤和其他組織器官細(xì)胞中的表達(dá)情況。腫瘤細(xì)胞中GFP陽性率應(yīng)大于50% ；其余組織器官細(xì)胞GFP陽性率應(yīng)小于90%。
權(quán)利要求
1.一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備方法，依次包括下述步驟步驟一、通過免疫小鼠制備抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白(VSV-G)以及特異性靶向標(biāo)志物的抗體細(xì)胞；步驟二、分別構(gòu)建相應(yīng)的抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫，分別篩選能夠與逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白或特異性靶蛋白特異性結(jié)合的噬菌體個體；步驟三、根據(jù)步驟二中篩選獲得的噬菌體，將編碼抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白與特異性靶向標(biāo)志物的單鏈可變區(qū)片斷的cDNA克隆，重組表達(dá)雙向特異性配體；步驟四、雙向特異性配體與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備方法，其特征在于所述的特異性靶向標(biāo)志物的抗體是指抗EGFR (EGF受體)、EpCAM (表皮細(xì)胞粘附分子)、 EphA2 (Eph受體酪氨酸激酶A2)、Her2 (人EGF受體2)等特異性腫瘤或某種疾病的標(biāo)志物分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法。目前，單克隆抗體和重組DNA技術(shù)的結(jié)合使得構(gòu)建在正常自然條件下所存在的以抗體為基礎(chǔ)的生物分子成為可能，但單克隆抗體治療腫瘤其藥物的靶向傳遞效率依然未能達(dá)到理想水平。本發(fā)明通過應(yīng)用抗體噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)篩選具有抗包膜蛋白的特異性抗體，同時將其與抗腫瘤表面特異性標(biāo)志物抗體的可變區(qū)片斷構(gòu)建成雙向特異性抗體或者其它生物工程形式分子，從而建立可以在體內(nèi)和體外特異性傳遞逆轉(zhuǎn)錄病毒的系統(tǒng)。本發(fā)明能阻斷并封閉傳遞病毒的非特異性結(jié)構(gòu)表位的結(jié)合能力；具有靶向和封閉逆轉(zhuǎn)錄病毒非特異性結(jié)合區(qū)的雙重作用雙重作用；并且不影響逆轉(zhuǎn)錄病毒制備的滴度。
文檔編號C07K16/28GK102344492SQ201010243428
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者劉鐳, 徐學(xué)明, 王天欣 申請人:西安杰諾瓦生物科技有限公司