專利名稱：帶可去除標(biāo)記的核苷酸及制備方法和用于基因測序的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種帶可去除標(biāo)記的核苷酸及其制 備方法和用于基因測序的方法。
背景技術(shù)：
在傳統(tǒng)的基因測序技術(shù)中，采用的是雙脫氧鏈終止法(Sanger)。加入核苷酸到反 應(yīng)體系中進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，核苷酸上的堿基逐步結(jié)合到DNA待測模板的不同位點(diǎn)，在一次 合成結(jié)束時(shí)，由于每個(gè)堿基停止的位置不同，導(dǎo)致生成的各段DNA雙鏈長短不一，則利用電 泳將其分開，然后標(biāo)記ATCG，根據(jù)不同的停止位點(diǎn)測定各堿基。該測序技術(shù)成本較高，速度 慢，不能進(jìn)行大規(guī)模平行測序。目前采用的一種測序方法是首先將模板與引物雜交；然后加入DNA聚合酶和修 飾過的核苷酸，該核苷酸連接有熒光標(biāo)記物(Fluorophore)，DNA聚合反應(yīng)時(shí)該熒光標(biāo)記物 可使反應(yīng)暫停；反應(yīng)暫停時(shí)測定此處的堿基；最后去除該熒光標(biāo)記物，使DNA聚合反應(yīng)繼 續(xù)。由上可知，該方法采用將熒光標(biāo)記物堵住核苷酸的3端-OH的方式來達(dá)到暫停的目的， 但是在后續(xù)去除熒光標(biāo)記物時(shí)必須切除-OH上的終止集團(tuán)，每次反應(yīng)之后在切除熒光標(biāo)記 物時(shí)都無法達(dá)到100%的效率，這樣會導(dǎo)致反應(yīng)無法繼續(xù)進(jìn)行，就不能測得更長的基因序 列。另外一種連接測序方法，則測序長度較短，過程復(fù)雜，其應(yīng)用有若干限制。這里，我們提出一種新的大規(guī)模、平行測序方法，可以解決現(xiàn)有高通量測序技術(shù)中 存在的若干問題，通過標(biāo)記后信號放大，降低成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種帶可去除標(biāo)記的核苷酸，旨在解決現(xiàn)有高通量測 序技術(shù)中存在的測序長度較短、信號低、成本高等問題。為了實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，提供了一種新的基因測序方法，是利用帶可去除標(biāo)記的特定 核苷酸，通過標(biāo)記/去標(biāo)記的方式按順序讀出堿基序列，包括以下步驟A.對于第一次延 伸反應(yīng)，在每個(gè)待測位點(diǎn)上利用所述帶可去除標(biāo)記的A，T，C，G四種核苷酸之一進(jìn)行延伸 反應(yīng)，使得每個(gè)磁珠上有少量DNA在當(dāng)前位點(diǎn)上連接所述帶可去除標(biāo)記的核苷酸；B.對于 第二次延伸反應(yīng)，則連接普通的無標(biāo)記的相同的核苷酸，從而達(dá)到對磁珠上100% DNA的延 伸；C.通過飽和熒光標(biāo)記的鏈酶親和素或量子點(diǎn)對帶可去除標(biāo)記的DNA進(jìn)行染色，從而達(dá) 到對磁珠上信號的足夠放大；D.利用大規(guī)模、高像素的CCD，讀取大通量的堿基信號；E.去 除步驟A中核苷酸上的可去除標(biāo)記，連同其轉(zhuǎn)染信號，對所述帶可去除標(biāo)記的A，T，C，G四 種核苷酸中的另外一種重復(fù)前述步驟A至E，并不斷循環(huán)，以讀取每個(gè)磁珠上DNA模板的堿 基序列。持續(xù)A，T，C，G四個(gè)堿基的，(A-E)的循環(huán)，直至所需的長度為止。本發(fā)明還提供了一種帶可去除標(biāo)記的核苷酸，結(jié)構(gòu)通式如下
權(quán)利要求
一種基因測序方法，是利用帶可去除標(biāo)記的特定核苷酸，通過標(biāo)記/去標(biāo)記的方式按順序讀出堿基序列，其特征在于，包括以下步驟A.對于第一次延伸反應(yīng)，在每個(gè)待測位點(diǎn)上利用所述帶可去除標(biāo)記的A，T，C，G四種核苷酸之一進(jìn)行延伸反應(yīng)，使得每個(gè)磁珠上有少量DNA在當(dāng)前位點(diǎn)上連接所述帶可去除標(biāo)記的核苷酸；B.對于第二次延伸反應(yīng)，則連接普通的無標(biāo)記的相同的核苷酸，從而達(dá)到對磁珠上100％DNA的延伸；C.通過飽和熒光標(biāo)記的鏈酶親和素或量子點(diǎn)對帶可去除標(biāo)記的DNA進(jìn)行染色達(dá)到對標(biāo)記信號的放大；D.利用大規(guī)模、高像素的CCD，讀取大通量的堿基信號；E.去除步驟A中核苷酸上的可去除標(biāo)記，連同其轉(zhuǎn)染信號，對所述帶可去除標(biāo)記的A，T，C，G四種核苷酸中的另外一種重復(fù)前述步驟A至E，并循環(huán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測序方法，其特征在于，在所述步驟A之前還包括以下步 驟將一通用引物雜交到所有磁珠上的所有DNA模板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測序方法，其特征在于，所述方法包括步驟A中，每次延伸占據(jù)少量DNA模板，并在每次CCD讀取延伸反應(yīng)后將標(biāo)記物徹底去 除；步驟B中，則連接普通的無標(biāo)記核苷酸；前述步驟A、B重復(fù)多次，其有效讀取長度由可接受的最終信噪比決定。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因測序方法，其特征在于，所述對標(biāo)記物進(jìn)行去除的方法 包括若攜帶可去除標(biāo)記的核苷酸中的可切除位點(diǎn)為雙硫鍵，則通過DTT、β-巰基乙醇或 TCEP-鹽酸切除修飾物；若攜帶可去除標(biāo)記的核苷酸中的可切除位點(diǎn)為吡喃醇結(jié)構(gòu)，則通過酸性試劑進(jìn)行切除。
5.一種帶可去除標(biāo)記的核苷酸，結(jié)構(gòu)通式如下
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的帶可去除標(biāo)記的核苷酸，其特征在于，所述可切除位點(diǎn)-R的 結(jié)構(gòu)由雙硫鍵構(gòu)成，即-s-s-，可通過還原劑打開。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的帶可去除標(biāo)記的核苷酸，其特征在于，所述可切除位點(diǎn)-R為 吡喃醇結(jié)構(gòu)，即
8.一種帶可去除標(biāo)記的核苷酸的制備方法，其特征在于，所述方法包括A.將氨基修飾物結(jié)合到核苷酸中的堿基上，生成攜帶氨基末端的核苷酸；B.對標(biāo)記物進(jìn)行化學(xué)修飾，使其包含一可切除位點(diǎn)，并對標(biāo)記物進(jìn)行醛基修飾；C.將步驟A中生成的攜帶氨基末端的核苷酸，與步驟B中生成的攜帶醛基末端的標(biāo)記 物進(jìn)行反應(yīng)，以酯鍵結(jié)合，生成所述帶可去除標(biāo)記的核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的帶可去除標(biāo)記的核苷酸的制備方法，其特征在于，所述可切 除位點(diǎn)的生成過程包括對標(biāo)記物進(jìn)行化學(xué)修飾，生成雙硫鍵-S-S-作為可切除位點(diǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的帶可去除標(biāo)記的核苷酸的制備方法，其特征在于，所述可切 除位點(diǎn)的生成過程包括對標(biāo)記物進(jìn)行化學(xué)修飾，生成吡喃醇結(jié)構(gòu)作為可切除位點(diǎn)，即
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種帶可去除標(biāo)記的核苷酸及其制備方法和用于基因測序的方法。基因測序的方法包括A.對于第一次延伸反應(yīng)，在每個(gè)待測位點(diǎn)上利用帶可去除標(biāo)記的A，T，C，G四種核苷酸之一進(jìn)行延伸反應(yīng)，使得每個(gè)磁珠上有少量DNA在當(dāng)前位點(diǎn)上連接帶可去除標(biāo)記的核苷酸；B.對于第二次延伸反應(yīng)，則連接普通的無標(biāo)記的相同的核苷酸，從而達(dá)到對磁珠上100％DNA的延伸；C.通過飽和熒光標(biāo)記的鏈酶親和素或量子點(diǎn)對帶可去除標(biāo)記的DNA進(jìn)行染色；D.利用大規(guī)模、高像素的CCD，讀取大通量的堿基信號；E.去除步驟A中核苷酸上的可去除標(biāo)記，連同其轉(zhuǎn)染信號，對另一種核苷酸重復(fù)前述步驟A至E。本發(fā)明具有低成本、高通量的特點(diǎn)，并能測得較長的基因序列。
文檔編號C07H19/20GK101935702SQ20101025145
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者盛司潼, 邵志峰, 金虹, 龔兵 申請人:深圳華因康基因科技有限公司