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      一種魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽nplp基因、編碼的蛋白及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):3568821閱讀:316來(lái)源:國(guó)知局
      專(zhuān)利名稱(chēng):一種魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽nplp基因、編碼的蛋白及其應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域,具體涉及一種魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因、編碼的蛋白及其 應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      脊椎動(dòng)物的生殖活動(dòng)主要受“腦/下丘腦_腦垂體_性腺”軸調(diào)控。腦垂體分泌產(chǎn) 生的GtH在脊椎動(dòng)物的生殖調(diào)控中起了主導(dǎo)作用,因此,對(duì)于GtH分泌的調(diào)節(jié),一直以來(lái)都 是生殖生理科學(xué)家們研究探索的重點(diǎn)。近年來(lái),在對(duì)GtH分泌的正調(diào)節(jié)方面取得了突破性 的進(jìn)展。在2003年,兩個(gè)獨(dú)立的研究小組分別發(fā)現(xiàn)kissp印tin和它的受體突變會(huì)使人類(lèi)的 性腺功能減退和青春期遲滯,而進(jìn)一步在kissp印tin或GPR54基因敲除的小鼠中也發(fā)現(xiàn)類(lèi) 似的表型。Kissp印tin通過(guò)調(diào)控GnRH的釋放,從而刺激腦垂體GtH的合成與釋放,進(jìn)而調(diào)控 各種生殖活動(dòng)。最近的研究表明TAC3及TACR3的突變也會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)青春期遲滯,表明TAC3/ TACR3是人類(lèi)生殖軸中的重要調(diào)節(jié)因子。以上這些神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),極大地拓展 了人類(lèi)對(duì)生殖神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的認(rèn)識(shí)。在內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)中,雙重調(diào)控現(xiàn)象普遍存在。但 是,一直以來(lái),對(duì)GtH負(fù)調(diào)控的因子卻知之甚少。我們發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)、青鏘、河飩等硬骨魚(yú)類(lèi) kiss2基因的旁側(cè)中存在著一個(gè)可能編碼神經(jīng)肽的新基因。通過(guò)基因同線(xiàn)性分析,我們發(fā)現(xiàn) 這個(gè)基因亦存在于鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳類(lèi)等其他類(lèi)群的基因組中。由于該基因編碼的蛋白質(zhì)序列具 有神經(jīng)肽前體蛋白的典型特征,如信號(hào)肽、前體蛋白剪切位點(diǎn)以及在不同物種相對(duì)保守的 成熟肽,我們將該基因命名為神經(jīng)肽樣前體蛋白基因(Neurop印tide-lik印recursor),簡(jiǎn) 稱(chēng) NPLP。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因。本發(fā)明另一目的在于提供上述魚(yú)類(lèi)神經(jīng)跑NPLP基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明另一目的在于提供上述蛋白質(zhì)經(jīng)斷裂得到的成熟肽。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因和成熟肽的應(yīng)用。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)通過(guò)搜索EST數(shù)據(jù)庫(kù),我們?cè)诎唏R魚(yú)中發(fā)現(xiàn)了一條編碼NPLP的EST序列。結(jié)合 NPLP在其他物種的序列特征,我們?cè)诎唏R魚(yú)基因組中預(yù)測(cè)了 NPLP的ORF框。在ORF兩側(cè)設(shè) 計(jì)特異引物,我們克隆并測(cè)序了包含斑馬魚(yú)NPLP ORF框的一段cDNA序列(圖1)。在斑馬 魚(yú)中,NPLP的蛋白前體由102個(gè)氨基酸組成,N-端的信號(hào)肽由26個(gè)氨基酸組成。蛋白酶切 割NPLP蛋白前體可能會(huì)產(chǎn)生14個(gè)氨基酸的成熟肽,寫(xiě)成NPLP-14。成熟肽的C-末端可能 存在酰胺化修飾,寫(xiě)成NPLP-14A,序列如SEQ ID NO 3所示。根據(jù)已知硬骨NPLP序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到代表金魚(yú)NPLP的中間 片段。再根據(jù)得到的中間片段設(shè)計(jì)特異引物,分別進(jìn)行3' RACE和5' RACEPCR得到金魚(yú) NPLP cDNA全長(zhǎng)。如圖2所示,金魚(yú)NPLP cDNA全長(zhǎng)865bp,其中開(kāi)放讀碼框?yàn)?09bp,5 ‘
      3非翻譯區(qū)為53bp,3'非翻譯區(qū)為503bp。它編碼的蛋白前體為102個(gè)氨基酸,其中N-端信 號(hào)肽由26個(gè)氨基酸組成(如SEQ ID NO :2所示),編碼該蛋白前提的基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0:1所示。成熟肽由14個(gè)氨基酸組成,成熟肽的C末端存在酰胺化修飾,序列如 SEQ ID NO 3 所示。序列比對(duì)分析表明,NPLP蛋白前體在不同脊椎動(dòng)物中序列變異較大。但是,形成 成熟肽和蛋白前體斷裂識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸序列相對(duì)來(lái)說(shuō)較為保守。在不同物種中,斷裂蛋 白前體都會(huì)產(chǎn)生非常保守的NPLP-14A(圖3)。硬骨魚(yú)類(lèi)與哺乳類(lèi)NPLP只存在一至兩個(gè)氨 基酸的變異。這些結(jié)果表明NPLP成熟肽在進(jìn)化中相當(dāng)保守,提示它們?cè)诓煌奈锓N中的生 物功能可能也具有相似性。魚(yú)類(lèi)中的NPLP-14A的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示。采用real-time PCR技術(shù)分析腦中NPLP在斑馬魚(yú)第一次卵泡發(fā)育成熟過(guò)程中的 變化,結(jié)果表明在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的早期,NPLP基因的表達(dá)逐漸上升;在黃體生成早 期,NPLP基因的表達(dá)達(dá)到頂峰;隨著卵母細(xì)胞發(fā)育的進(jìn)一步成熟,NPLP基因表達(dá)開(kāi)始下降, 在卵母濾泡細(xì)胞發(fā)育成熟后下降至更低水平。采用real-time PCR技術(shù)分析NPLP在雌性成熟金魚(yú)的組織表達(dá)情況,結(jié)果表明 金魚(yú)NPLP主要在視頂蓋-丘腦、延髓和下丘腦中表達(dá),在腸、卵巢和心臟等外周組織中也有 少量表達(dá)。對(duì)NPLP-14A免疫陽(yáng)性細(xì)胞在金魚(yú)腦中進(jìn)行表達(dá)定位,結(jié)果顯示NPLP免疫陽(yáng) 性信號(hào)主要分布于視前區(qū)(preoptic region)、前端下丘腦(anterior hypothalamus) > 丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial thalamic nucleus)、內(nèi)側(cè)縱束(medial longitudinal fasciculus)禾口中間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(intermediate reticular formation)的神經(jīng)樣細(xì)胞中。用不同濃度的金魚(yú)NPLP-14和NPLP-14A離體孵育成熟金魚(yú)垂體原代培養(yǎng)細(xì)胞,結(jié) 果顯示10nM和IOOOnM NPLP-14A分別處理30分鐘和120分鐘能夠顯著抑制金魚(yú)原代培 養(yǎng)的垂體細(xì)胞LH的釋放(P < 0. 05) ;IOnM和IOOOnMNPLP-14處理30分鐘和120分鐘也 能顯著抑制金魚(yú)原代培養(yǎng)的垂體細(xì)胞LH的釋放(P < 0. 05),但其生理活性不如NPLP-14A ; 0. InM NPLP-14和NPLP-14A分別處理30分鐘和120分鐘能夠微弱地降低體細(xì)胞LH的釋 放。用lOng/g和lOOOng/g體重金魚(yú)NPLP-14A在體腹腔注射雌性成熟金魚(yú),結(jié)果顯 示10ng/g體重NPLP-14A注射組血清中LH的含量在注射后Ih和6h顯著低于血清中LH水 平(P < 0. 05) ; 1000ng/g體重NPLP-14A注射組血清中LH的含量在注射后lh、3h和6h顯 著低于對(duì)照組血清中LH水平。因此,本發(fā)明魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因可以用于魚(yú)類(lèi)生殖調(diào)控;該基因編碼的蛋白 質(zhì),以及蛋白質(zhì)經(jīng)斷裂后產(chǎn)生的成熟肽均可用于魚(yú)類(lèi)人工催產(chǎn)中。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因在魚(yú)類(lèi)腦中大量表達(dá),編碼的蛋白質(zhì)作為前體,經(jīng)斷 裂產(chǎn)生的成熟肽具有生殖調(diào)控的功能,可通過(guò)化學(xué)合成的方法進(jìn)行利用開(kāi)發(fā),使用方便,效 果顯著。


      圖1是本發(fā)明的斑馬魚(yú)神經(jīng)肽NPLP基因cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列,其中,信號(hào)肽用下劃虛線(xiàn)表示,成熟肽用陰影表示,蛋白酶切割位點(diǎn)用下劃實(shí)線(xiàn)表示;圖2是本發(fā)明的金魚(yú)神經(jīng)肽NPLP基因cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列其中,信 號(hào)肽用下劃虛線(xiàn)表示,成熟肽用陰影表示,蛋白酶切割位點(diǎn)用下劃實(shí)線(xiàn)表示;圖3是本發(fā)明的一種魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP的序列比對(duì)分析,其中,序列對(duì)比用Clastal W進(jìn)行,信號(hào)肽用下劃虛線(xiàn)表示,成熟肽用陰影表示,蛋白酶切割位點(diǎn)用下劃實(shí)線(xiàn)表示;圖4是本發(fā)明的一種魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因在各個(gè)組織的表達(dá)分析,其中,TE 端 腦;OTT 視頂蓋-丘腦;CE 小腦;ME 延髓;Hy 下丘腦;P 垂體;H 心臟;L 肝臟;K:腎 臟;G 鰓;I:腸;0:卵巢;圖5是本發(fā)明的一種魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因在卵泡發(fā)生階段的表達(dá)變化,其中,PG 初生長(zhǎng)期(I期);PV 卵黃發(fā)生早期(II期);EV 卵黃發(fā)生早期(III期早期);MV 卵黃發(fā) 生中期(III期中期);re 完全生長(zhǎng)期(III期晚期);GV 卵母細(xì)胞生發(fā)泡期(IV期);圖6是本發(fā)明的一種魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP腹腔注射成熟期雌性金魚(yú)LH釋放的影響。
      具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明,但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1.金魚(yú)腦總RNA的提取取健康金魚(yú),解剖后立即分離出腦組織。采用Trizol試劑法提取獲得金魚(yú)腦總 RNA,其0D26(1/28(1 = 1.85,電泳結(jié)果顯示,28S rRNA, 18S rRNA條帶清晰,28S條帶亮度為18S 的兩倍,表明所得總RNA未被蛋白質(zhì)、酚和基因組DNA污染,純度高。2. cDNA第一鏈的合成取5 μ g金魚(yú)腦總RNA樣品進(jìn)行DNA酶處理以去除基因組DNA的污染,與RNA Oligo dT(序列如SEQ ID N0:4所示)混合,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,所的產(chǎn)物置于_20°C保存?zhèn)溆谩?.斑馬魚(yú)NPLP基因cDNA全序列的克隆通過(guò)搜索EST數(shù)據(jù)庫(kù),我們?cè)诎唏R魚(yú)中發(fā)現(xiàn)了一條編碼NPLP的EST序列。結(jié)合 NPLP在其他物種的序列特征,我們?cè)诎唏R魚(yú)基因組中預(yù)測(cè)了 NPLP的ORF框。在ORF兩側(cè)設(shè) 計(jì)特異引物,我們克隆并測(cè)序了包含斑馬魚(yú)NPLP ORF框的一段cDNA序列(圖1)。在斑馬 魚(yú)中,NPLP的蛋白前體由102個(gè)氨基酸組成,N-端的信號(hào)肽由26個(gè)氨基酸組成。蛋白酶切 割NPLP蛋白前體可能會(huì)產(chǎn)生14個(gè)氨基酸的成熟肽,寫(xiě)成NPLP-14。成熟肽的C-末端可能 存在酰胺化修飾,寫(xiě)成NPLP-14A。4.金魚(yú)NPLP基因cDNA全序列的克隆根據(jù)已知硬骨NPLP序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到代表金魚(yú)NPLP的中間 片段。再根據(jù)得到的中間片段設(shè)計(jì)特異引物,分別進(jìn)行3' RACE和5' RACEPCR得到金魚(yú) NPLP cDNA全長(zhǎng)。如圖4-6所示,金魚(yú)NPLP cDNA全長(zhǎng)865bp,其中開(kāi)放讀碼框?yàn)?09bp,5 ‘ 非翻譯區(qū)為53bp,3'非翻譯區(qū)為503bp。它編碼的蛋白前體為102個(gè)氨基酸,其中N-端信 號(hào)肽由26個(gè)氨基酸組成,成熟肽由14個(gè)氨基酸組成,成熟肽的C末端存在酰胺化修飾(圖 2)。5.魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP的序列比對(duì)分析
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      序列比對(duì)分析表明,NPLP蛋白前體在不同脊椎動(dòng)物中序列變異較大。但是,形成 成熟肽和蛋白前體斷裂識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸序列相對(duì)來(lái)說(shuō)較為保守。在不同物種中,斷裂蛋 白前體都會(huì)產(chǎn)生非常保守的NPLP-14A。硬骨魚(yú)類(lèi)與哺乳類(lèi)NPLP只存在一至兩個(gè)氨基酸的 變異。這些結(jié)果表明NPLP成熟肽在進(jìn)化中相當(dāng)保守,提示它們?cè)诓煌奈锓N中的生物功能 可能也具有相似性(圖3)。實(shí)施例2金魚(yú)NPLP的組織表達(dá)采用real-time PCR技術(shù)分析NPLP在雌性成熟金魚(yú)的組織表達(dá)情況,結(jié)果表明 金魚(yú)NPLP主要在視頂蓋-丘腦、延髓和下丘腦中表達(dá),在腸、卵巢和心臟等外周組織中也有 少量表達(dá)(圖4)。實(shí)施例3斑馬魚(yú)NPLP基因在卵泡發(fā)生階段的表達(dá)變化斑馬魚(yú)卵泡細(xì)胞發(fā)育可分為初生長(zhǎng)期(primary growth, PG, stage I)、卵黃 發(fā)生前其月(previtellogenic, PV, stage II)、卵黃發(fā)生早其月(early vitellogenic, EV, early stage III)、卵黃發(fā)生中期(mid-vitellogenic,MV,mid-stage III)、完全生長(zhǎng)期 (full-grown, FG, late stage III)和卵母細(xì)胞生發(fā)泡期(germinal vesicle, GV, stage IV)(圖 5)。采用real-time PCR技術(shù)分析腦中NPLP在斑馬魚(yú)第一次卵泡發(fā)育成熟過(guò)程中的 變化,結(jié)果表明在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的早期,NPLP基因的表達(dá)逐漸上升;在黃體生成早 期,NPLP基因的表達(dá)達(dá)到頂峰;隨著卵母細(xì)胞發(fā)育的進(jìn)一步成熟,NPLP基因表達(dá)開(kāi)始下降, 在卵母濾泡細(xì)胞發(fā)育成熟后下降至更低水平。實(shí)施例4金魚(yú)NPLP對(duì)LH釋放的影響將性腺發(fā)育成熟的雌性金魚(yú)(體重120克左右)分成六組,每組7-9條魚(yú)。在實(shí) 驗(yàn)前馴養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí),先將金魚(yú)用MS-222麻醉后,稱(chēng)量每組中個(gè)體體重。根據(jù)體重 分別由腹腔注入0. 7%魚(yú)類(lèi)生理鹽水(對(duì)照組)或lng/gBW-1000ng/gBW 26RFa和100ng/g Bff 7RFa。分別在注射后lh、3h和6h從尾椎靜脈采血,每次采血0.6ml。將采集的血液樣品 裝入1.5ml離心管中,在冰上放置4 6h后,于4°C 12,000Xg離心15min,取血清,采用放 射免疫測(cè)定方法檢測(cè)LH濃度(圖6)。
      權(quán)利要求
      一種魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
      2.權(quán)利要求1所述魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因編碼的蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為6.53,分 子量為28. 31千道爾頓,其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
      3.權(quán)利要求2所述魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因編碼的蛋白質(zhì)作為前體,經(jīng)斷裂后得到的成熟 肽,其特征在于所述成熟肽由14個(gè)氨基酸組成,氨基酸序列如SEQID NO 3所示。
      4.權(quán)利要求1所述魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因在魚(yú)類(lèi)生殖調(diào)控中的應(yīng)用。
      5.權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)在魚(yú)類(lèi)人工催產(chǎn)中的應(yīng)用。
      6.權(quán)利要求3所述成熟肽在魚(yú)類(lèi)人工催產(chǎn)中的應(yīng)用。全文摘要
      本發(fā)明公開(kāi)了一種魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因、編碼的蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示,該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明魚(yú)類(lèi)神經(jīng)肽NPLP基因在魚(yú)類(lèi)腦中大量表達(dá),編碼的蛋白質(zhì)作為前體,經(jīng)斷裂產(chǎn)生的成熟肽具有生殖調(diào)控的功能,可通過(guò)化學(xué)合成的方法進(jìn)行利用開(kāi)發(fā),使用方便,效果顯著。
      文檔編號(hào)C07K14/46GK101948840SQ20101026589
      公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
      發(fā)明者劉云, 劉曉春, 盧丹琪, 張勇, 張海發(fā), 李水生, 林浩然, 蒙子寧, 陳華譜 申請(qǐng)人:中山大學(xué)
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