專利名稱：一種高效純化金屬離子結合蛋白的離子交換層析分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛋白質的分離純化方法，特別是涉及一種使用新型離子交換層析純化金屬離子結合蛋白的分離純化方法。
背景技術：
許多蛋白質中含有金屬離子輔基，這些金屬離子對蛋白質的結構和性質具有重要的意義。金屬離子結合蛋白質的純化過程存在一些困難，在純化過程中金屬離子的喪失會導致蛋白質喪失天然結構，并進一步影響該蛋白質在離子交換層析過程中同其它雜蛋白的分辨率。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種純化金屬離子結合蛋白的新型離子交換層析純化方法。本發(fā)明采用的技術方案步驟如下1)選取含有金屬離子結合蛋白的待分離原料，沉淀離心去除脂類等雜質后收集上清液獲得蛋白混合物；2)在所得蛋白混合物中添加適量的蛋白結合金屬離子；3)選擇不與蛋白結合金屬離子沉淀的緩沖液作為離子交換層析緩沖液；4)在離子交換層析緩沖液中添加適量的蛋白結合金屬離子；5)將蛋白混合物經過離子交換層析和凝膠過濾層析聯(lián)用的組合層析，分離得到金屬離子結合蛋白。本發(fā)明所述的待分離原料為轉基因動物乳液、轉基因工程菌的發(fā)酵液、轉基因動物細胞的發(fā)酵液等，優(yōu)選為轉基因哺乳動物乳液，所述的金屬離子結合蛋白優(yōu)選為轉基因人源α-乳清白蛋白、乳轉鐵蛋白等；以下僅以一種蛋白的分離來加以說明，但本發(fā)明的保護不局限與此；牛乳中總蛋白濃度為30-38g/L，重組人源乳清蛋白濃度0. 5-4. Og/L，優(yōu)選蛋白濃度為1.0-3. 5g/L。本發(fā)明所述的沉淀方法可采用酸性沉淀、凝乳酶沉淀或硫酸銨沉淀的方法。在采用酸性沉淀時，需在室溫下將待分離原料調節(jié)PH到3. 5-5. 5，優(yōu)選的PH值為4. 0-5. 0，靜置 15分鐘，離心收集上清液。在采用凝乳酶法時，向待分離原料中加入濃度為5%的凝乳酶溶液，牛乳與凝乳酶溶液體積比例為20-500 1，優(yōu)選的比例為50-200 1，室溫下反應10 分鐘，離心收集上清液。在采用硫酸銨沉淀方法時，調節(jié)待分離原料的PH到5. 0-10.0，優(yōu)選的PH值為6. 0-8.0，并通過加入硫酸銨粉末使得乳清中硫酸銨飽和度為20%-60%，以摩爾數計為0. 86-2. 95M，優(yōu)選的硫酸銨飽和度為30% -60%，以摩爾數計為1. 33-2. 37M，振蕩2 小時，離心收集上清液或收集沉淀并使用20mM磷酸鹽緩沖液復溶后備用。本發(fā)明所述的蛋白結合金屬離子為鈣離子、三價鐵離子等，在蛋白混合物和離子交換緩沖液中的添加濃度優(yōu)選為l_50mM。蛋白結合金屬離子有利于保持金屬離子結合蛋白的空間結構，有效地提高其在離子交換層析分離純化中的分辨率。本發(fā)明所述的離子交換層析中，離子交換層析介質采用瓊脂糖材料為基質，所述的配基可為DEAE、Q、SP等，優(yōu)選為DEAE。本發(fā)明所述的離子交換層析中，可用的緩沖體系為Tris-HCl緩沖液，甘氨酸-HCl 緩沖液和甘氨酸-NaOH緩沖液，優(yōu)選的緩沖體系為Tris-HCl緩沖液；低鹽緩沖液優(yōu)選為 20-100mM,pH6. 0-8. 0的Tris-HCl緩沖液，添加蛋白結合金屬離子濃度優(yōu)選為l_50mM ；高鹽緩沖液優(yōu)選為20-100mM，pH6. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液，洗脫鹽濃度為0. 5-2. 0M，優(yōu)選濃度為 0. 6-1. 2M，添加蛋白結合金屬離子濃度優(yōu)選為l-50mM。本發(fā)明所述的離子交換層析中，將處理得到的蛋白混合物溶液調節(jié)pH到 5. 0-10. 0，優(yōu)選的 pH 值為 6. 0-8. 0。本發(fā)明所述的離子交換層析中，本領域技術人員可根據金屬離子結合蛋白的種類選擇合適的離子交換層析介質、層析柱和進樣速度將經預處理后的蛋白混合物溶液進樣到用低鹽緩沖液平衡好的離子交換層析柱中，層析過程使用^Onm紫外吸收波長進行蛋白質的檢測，進樣的蛋白混合物溶液體積為0. 5-5. 0倍層析柱體積，優(yōu)選為1. 0-3. 0倍層析柱體積。本領域技術人員可調節(jié)工藝參數以得到不同的金屬離子結合蛋白的初步純化產品或純品；由于本發(fā)明的離子交換層析過程中添加適量的蛋白結合金屬離子，從而有效的保持金屬離子結合蛋白的天然結構，通過本步驟可以有效地純化金屬離子結合蛋白。本發(fā)明所述的凝膠過濾層析中，將金屬離子結合蛋白的初步純化產品再經凝膠過濾層析除去剩余雜質以得到純品，凝膠過濾層析介質為瓊脂糖介質，優(yōu)選為Superdex 75。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，由于采用了在離子交換層析過程中添加蛋白結合金屬離子的方法，可有效地提高金屬離子結合蛋白與雜蛋白之間的性質差異，實現(xiàn)金屬離子結合蛋白的高效純化，得到不同的金屬離子結合蛋白初步純化產品或純品；采用了凝膠過濾層析對初步純化產品進行了進一步的精制純化，得到了高純度的金屬離子結合蛋白的純品； 采用以離子交換層析為核心的復合工藝方法，生產工藝穩(wěn)定，適于進行金屬離子結合蛋白的規(guī)?；a，產品純度高，工藝回收率高。


圖1為分離純化工藝流程圖。圖2為離子交換層析分離純化人源α-乳清白蛋白和牛源α-乳清白蛋白。圖3為凝膠過濾I分離純化人源α -乳清白蛋白。圖4為凝膠過濾II分離純化牛源α -乳清白蛋白。實施例1取25mL轉基因人源α-乳清白蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為1.4g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為1.0g/L。乳液調節(jié)pH4. 6，靜置15分鐘后使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心30分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得乳清80mL，總蛋白濃度為9. 5g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為1. 6g/L，牛源α -乳清白蛋白濃度為1. 2g/L。向乳清中添加氯化鈣粉末使得氯化鈣濃度為50mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH到8. 0，進樣到用20mM，pH8. 0，含50mM氯化鈣的Tris-HCl緩沖液預平衡好的DEAE Sepharose FF離子交換層析柱中，柱內徑1. 5 厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速 10ml/min,上樣完畢后用20mM，pH8. 0，50M氯化鈣的Tris-HCl緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線。使用20mM，含IM NaCl的pH8. 0的Tris-HCl緩沖液進行線形洗脫， 收集人源α-乳清白蛋白活性峰18mL，總蛋白濃度為3.8g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為 1.2g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 2g/L;收集牛源α-乳清白蛋白活性峰18mL，總蛋白濃度為1.5g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為0.2g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為1. Og/L。取離子交換層析人源α -乳清白蛋白活性峰18mL進樣到用20mM，pH7. 0含0. IM 硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100,紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min， 上樣完畢后繼續(xù)用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共30mL，總蛋白濃度為0. 9g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為0. 7g/L，工藝回收率60%，純度78%，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. lg/L。取離子交換層析牛源α -乳清白蛋白活性峰ISmL進樣到用20mM，pH7. 0含0. IM 硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100,紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min， 上樣完畢后繼續(xù)用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共30mL，總蛋白濃度為0. 6g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 5g/L，工藝回收率60%，純度83%，人源α-乳清白蛋白濃度為0.05g/L。實施例2取25mL轉基因人源α-乳清白蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為1.4g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為1.0g/L。乳液調節(jié)pH4. 7，靜置15分鐘后使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心15分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得乳清20mL，總蛋白濃度為9. 5g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為1. 6g/L，牛源α -乳清白蛋白濃度為1. 2g/L。向乳清中添加硝酸鈣粉末使得硝酸鈣濃度為30mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH到9. 0，進樣到用20mM，pH9. 0，30mM硝酸鈣的Tris-HCl緩沖液預平衡好的Q Sepharose FF離子交換層析柱中，柱內徑1. 5厘米， 柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速IOml/ min，上樣完畢后用20mM，pH9. 0含0. M硫酸銨，30M硝酸鉀的Tris-HCl緩沖液繼續(xù)沖洗至 ^Onm紫外吸收信號回到基線。使用20mM，含IM NaCl的Tris-HCl緩沖液進行線形洗脫， 收集人源α-乳清白蛋白活性峰18mL，總蛋白濃度為3. 7g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為 1. lg/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 3g/L;收集牛源α -乳清白蛋白活性峰18mL，總蛋白濃度為1.6g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為0.3g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 9g/L。取離子交換層析洗脫峰ISmL進樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共30mL，總蛋白濃度為0. 8g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為0. 65g/L，工藝回收率56%，純度81%，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. lg/L。
取離子交換層析穿透峰ISmL進樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共30mL，總蛋白濃度為0. 6g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 48g/L，工藝回收率58%，純度80%，人源α-乳清白蛋白濃度為0. 06g/L。實施例3取25mL含有轉基因人源α -乳清白蛋白的CHO細胞分泌液，總蛋白濃度為IOg/ L，人源α-乳清白蛋白濃度為1.4g/L。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)分泌液pH到 9. 0，緩慢加入硫酸銨粉末到硫酸銨飽和度為50%，以摩爾記數為2. 37M，在室溫下振蕩2小時后，將沉淀樣品使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心30分鐘并收集上清液20mL，上清液總蛋白濃度9.5g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為1. 6g/L。向處理所得蛋白混合物中添加氯化鈣粉末使得氯化鈣濃度為40mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)蛋白溶液pH到6. 0，進樣到用20mM，pH6. 0， 40mM氯化鈣的Tris-HCl緩沖液預平衡好的DEAE Sepharose FF離子交換層析柱中，柱內徑1. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH6. 0，40M氯化鈣的1Tris-HCl緩沖液繼續(xù)沖洗至 ^Onm紫外吸收信號回到基線。再用20mM，含IM NaCl,pH6. 0的Tris-HCl緩沖液進行階梯式洗脫并收集洗脫峰18mL，總蛋白濃度為4.0g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為1. 4g/L。取離子交換層析洗脫峰ISmL進樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共30mL，總蛋白濃度為0. 9g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為0. 8g/L，工藝回收率69 %，純度89 %。實施例4取25mL轉基因人源乳轉鐵蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為1.7g/L，牛源乳轉鐵蛋白濃度為0. lg/L。向牛乳中加入濃度為5%的凝乳酶溶液，牛乳與凝乳酶溶液體積比例為50 1，室溫下反應10分鐘，使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心10分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得乳清20mL，總蛋白濃度為9. 5g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為2. Og/L，牛源乳轉鐵蛋白濃度為0. 12g/L。向乳清中添加硝酸鐵粉末使得硝酸鐵濃度為50mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)乳清pH到8. 0，進樣到用20mM，pH8. 0，50mM 硝酸鐵的Tris-HCl緩沖液預平衡好的SP Sepharose FF離子交換層析柱中，柱內徑1. 5 厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速 10ml/min,上樣完畢后用20mM，pH8. 0，50M硝酸鐵的Tris-HCl緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線。使用20mM，含IM NaCl的Tris-HCl緩沖液進行線形洗脫，收集人源乳鐵蛋白活性峰18mL，總蛋白濃度為3. 8g/L，人源乳鐵蛋白濃度為1. 2g/L，牛源乳鐵蛋白濃度為0. 05g/L ；收集牛源乳鐵蛋白活性峰18mL，總蛋白濃度為1. 5g/L，人源乳鐵蛋白濃度為0.9g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0.01g/L。
取離子交換層析洗脫峰ISmL進樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集170mL處的蛋白峰共30mL，總蛋白濃度為0. 35g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為0. 3g/L，工藝回收率21 %，純度86 %，牛源乳轉鐵蛋白濃度為0. 002g/L。取離子交換層析穿透峰ISmL進樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集170mL處的蛋白峰共30mL，總蛋白濃度為0. lg/L，牛源乳轉鐵蛋白濃度為0. 02g/L,工藝回收率，純度20 %，人源乳轉鐵蛋白濃度為0. 06g/L。實施例5取IOOmL含有轉基因人源乳轉鐵蛋白的E. Coli發(fā)酵液，總蛋白濃度為20g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為0.6g/L。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)蛋白溶液pH到7.0，緩慢加入硫酸銨粉末到蛋白溶液硫酸銨飽和度為40%，以摩爾記數為1. 84M，在室溫下振蕩2小時后，將沉淀樣品使用Sigma 3k30離心機4攝氏度下，調離心力為IOOOOg離心30分鐘收集沉淀，并使用85mL pH7. 0的20mM磷酸鹽緩沖液復溶，上清液總蛋白濃度10g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為0. 5g/L。向蛋白溶液中添加氯化鐵粉末使得氯化鐵濃度為30mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)蛋白溶液pH到7. 0，進樣到用20mM，pH7. 0， 30mM氯化鐵的Tris-HCl緩沖液預平衡好的CM Sepharose FF離子交換層析柱中，柱內徑 1.5厘米，柱床高度10厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM，pH7. 0，30mM氯化鐵的Tris-HCl緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm 紫外吸收信號回到基線。再用20mM，含lMNaCl，pH7. 0的Tris-HCl緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰18mL，總蛋白濃度為4g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為0. 5g/L。取離子交換層析洗脫峰ISmL進樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設備GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集170mL處的蛋白峰共30mL，總蛋白濃度為0. 4g/L，人源乳轉鐵蛋白濃度為0. 3g/L，工藝回收率60%，純度75%。
權利要求
1.高效純化金屬離子結合蛋白的離子交換層析分離純化方法，其步驟包括1)選取含有金屬離子結合蛋白的待分離原料，沉淀離心去除脂類等雜質后收集上清液獲得蛋白混合物；2)在所得蛋白混合物中添加適量的蛋白結合金屬離子；3)選擇不與蛋白結合金屬離子沉淀的緩沖液作為離子交換層析緩沖液；4)在離子交換層析緩沖液中添加適量的蛋白結合金屬離子；5)將蛋白混合物經過離子交換層析和凝膠過濾層析聯(lián)用的組合層析，分離得到金屬離子結合蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其中的待分離原料為轉基因動物乳液、轉基因工程菌的發(fā)酵液、轉基因動物細胞的發(fā)酵液。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述的蛋白質是有金屬離子結合能力的蛋白，如重組人源α-乳清白蛋白，牛源α-乳清白蛋白，重組人乳轉鐵蛋白等。
4.如權利要求1所述的方法，蛋白結合金屬離子為鈣離子、三價鐵離子等。
5.如權利要求1所述的方法，離子交換層析所用的緩沖液為Tris-HCl緩沖液。
6.如權利要求1所述的方法，離子交換層析介質為常用的蛋白質層析介質，如瓊脂糖基質的DEAE、Q、SP離子交換層析介質等。
全文摘要
本發(fā)明一種高效純化金屬離子結合蛋白的離子交換層析分離純化方法，其步驟為選取含有金屬離子結合蛋白的待分離物料，添加沉淀劑進行沉淀粗分離獲得蛋白混合物。在蛋白混合物中添加適量的蛋白結合金屬離子，以保持目標蛋白的三級結構。將處理所得蛋白混合物進行離子交換層析分離操作，并在層析緩沖液中添加適量的蛋白結合金屬離子，由于該金屬離子輔基可以有效地保持目標蛋白的天然結構，因此可以有效地提高目標蛋白與雜蛋白在離子交換層析中的分辨率。進一步通過凝膠過濾層析可以得到高純度、高回收率的金屬離子結合蛋白的純品，生產工藝穩(wěn)定，適于規(guī)模化生產。
文檔編號C07K1/36GK102382168SQ20101027146
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權日2010年9月3日
發(fā)明者張焱, 羅堅, 蘇志國, 馬光輝 申請人:中國科學院過程工程研究所