專利名稱：納米脂質(zhì)體抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種畜禽和水生動物用飼料和飼料添加劑，尤其是涉及一種納米脂質(zhì) 體抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特異性IgY，這種蛇 毒活性酶可以是脂蛋白磷脂酶A2，也可以是磷脂酶A2，本發(fā)明還提供這種IgY在畜禽和水 生動物飼料和飼料添加劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前中國養(yǎng)殖業(yè)存在的問題(1)、飼料轉(zhuǎn)化率不高畜禽和水生動物體內(nèi)分泌的一種蛇毒活性酶A2 (包括脂蛋 白磷脂酶A2和磷脂酶A2)，這些酶相當(dāng)于人體內(nèi)的“蛔蟲”，會阻止消化系統(tǒng)對營養(yǎng)成份的 吸收，造成飼料轉(zhuǎn)化率不高；既制約了養(yǎng)殖企業(yè)的運(yùn)營效率，又造成長期糧食供需矛盾，使 飼料原料價格不斷攀升。(2)、傳染性疾病爆發(fā)瀕繁秋冬季腹瀉成為流行病，藍(lán)耳病、口蹄疫等高致病性疾 病經(jīng)常造成豬群、牛群大面積死亡而產(chǎn)生災(zāi)難性后果，魚蝦的傳染病爆發(fā)也不時給水產(chǎn)養(yǎng) 殖場帶來毀滅性打擊；從而，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。(3)、濫用抗生素和抗病毒化學(xué)藥由于抗生素是廣譜殺菌，它在殺滅動物體內(nèi)的 有害菌的同時，也殺滅了其中的有益菌，這就破壤了腸道菌群平衡，降低了腸道免疫力。而 現(xiàn)有的抗病毒藥，只是某一種藥對某一種病毒復(fù)制過程的某個階段產(chǎn)生一定程度的干擾或 影響而已，對已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒則毫無作用。嚴(yán)酷的現(xiàn)實(shí)是迄今為止，不會傷害宿主細(xì) 胞，又能滅活病毒真正意義上的抗病毒藥在全世界尚未研制成功。歐盟已從2006年開始禁 止在飼料中添加抗生素，中國農(nóng)業(yè)部則于2005年對畜禽抗病毒西藥全面禁止使用。養(yǎng)殖企 業(yè)迫切需要不會破壞菌群平衡又無殘留的抗菌藥和確切有效的抗病毒藥。(4)、教槽料中普遍使用血漿蛋白歐洲基于生物安全等原因，早已禁止在飼料中 添加動物的血液制品。許多農(nóng)業(yè)專家指出“血漿蛋白粉等同源動物性飼料乃摧毀養(yǎng)豬業(yè)之 罪魁”。鑒于以上存在的問題，研究開發(fā)一種無毒、無殘留、無耐藥性、無生物安全隱患安 全高效的新型飼料和飼料添加劑，有效改善畜禽和水生動物本身的營養(yǎng)性能，提高豬場乳 豬和斷乳仔豬以及其它畜禽和水生動物的成活率和日增重，降低料肉比；同時，以新一代抗 菌藥和抗病毒藥代替抗生素和抗病毒化學(xué)藥用于預(yù)防和治療動物感染性疾??；從而達(dá)到提 升養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益的目的。這已成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的迫切需求，也是擺在各國農(nóng)業(yè)科學(xué)家 和養(yǎng)殖業(yè)界面前的任務(wù)和重大課題。

發(fā)明內(nèi)容
動物小腸會分泌一種特殊的蛇毒活性酶A2 (包括脂蛋白磷脂酶和磷脂酶)，這種 酶會催化水解脂類和養(yǎng)份，從而阻礙腸道對營養(yǎng)成份的吸收。
本發(fā)明的目的是提供一種納米脂質(zhì)體抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合 IgY以及抗蛇毒活性酶A2特異性IgY，包括納米脂質(zhì)體抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY以及 抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY、抗磷脂酶A2特異性IgY以及抗磷脂酶 A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY，這種新型IgY抗體能特異性抑制脂蛋白磷脂酶A2和磷脂 酶A2，使動物體內(nèi)的養(yǎng)份不致被小腸分泌的脂蛋白磷脂酶A2和磷脂酶A2水解，從而很好地 乳化，形成脂肪微粒，擴(kuò)大胰脂酶與脂肪等營養(yǎng)成份的接觸面積，促進(jìn)營養(yǎng)消化吸收。同時， 本發(fā)明的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性IgY以及抗磷脂酶A2和腸道病原體特異 性IgY還特別具有能有效抑制腸道內(nèi)的病毒和致病菌的功效；從而，達(dá)到有效阻止病毒和 致病菌感染，徹底消除腸道炎癥，改善腸道健康，增強(qiáng)腸胃消化功能，提高畜禽和水生動物 對飼料中營養(yǎng)成份的吸收的目的。以這種新型IgY作為核心成份制成的高效安全的畜禽和 水生動物用飼料和飼料添加劑，不含抗生素和抗病毒化學(xué)藥，也不含任何生長激素；它既會 抑制腸道分泌的專門破壞營養(yǎng)吸收的脂蛋白磷脂酶A2和磷脂酶A2，又可抑滅腸道多種病 毒和致病菌(包括腸毒性大腸桿菌、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等以及 水生動物的病原體和禽類的病原體)，改善畜禽和水生動物腸道健康和營養(yǎng)性能，提高畜禽 和水生動物的平均日增重和成長均勻度，降低料肉比；是對現(xiàn)今全世界普遍沿用的傳統(tǒng)飼 料和飼料添加劑的一次創(chuàng)新和一場革命。這種新型飼料和飼料添加劑在提高飼料利用率和 降低料肉比方面，以及在抑滅各種病毒和致病菌方面，比目前全球普遍采用的含抗生素和 化學(xué)藥的飼料和飼料添加劑以及含抗菌肽和植物提取物的飼料和飼料添加劑，具有許多優(yōu) 點(diǎn)和更大的優(yōu)勢。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種納米脂質(zhì)體抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù) 合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特異性IgY的制備方法，包括一種納米脂質(zhì)體抗脂蛋白磷脂酶 A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法以及一種納米脂質(zhì)體抗脂蛋白磷脂酶A2特異 性IgY的制備方法，一種納米脂質(zhì)體抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法 以及一種納米脂質(zhì)體抗磷脂酶A2特異性IgY的制備方法，具體內(nèi)容如下一種納米脂質(zhì)體抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，包 括以下步驟(1)采用基因工程技術(shù)重組脂蛋白磷脂酶A2表達(dá)蛋白首先用RT-PCR方法克隆脂蛋白磷脂酶A2的成熟肽編碼區(qū)基因；然后將脂蛋白磷脂酶A2基因從真核表達(dá)載體pCGN-PLDl亞克隆至帶有綠色熒光 標(biāo)記蛋白的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中；再與腺病毒骨架載體一起在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，陽性重組子經(jīng)Pac I線性化后，轉(zhuǎn)染入病毒組裝細(xì)胞系293細(xì)胞，構(gòu)建專一性的脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表 達(dá)蛋白，并用該病毒顆粒感染嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞，高效表達(dá)脂蛋白磷脂酶A2重組腺 病毒表達(dá)蛋白；把已被鑒定的脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白用氯化銫梯度離心純化，再 在QBI-293A細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增；(2)制備畜禽和水生動物腸道主要病原體復(fù)合抗原首先篩選引致禽畜和水生動物腸道感染性疾病的主要病原體，并進(jìn)行分類組合；接著，分別制備相應(yīng)的各種復(fù)合抗原；
(3)制備含抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的免疫蛋選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的無特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽，分別采 用上述制備的各種復(fù)合抗原在皮下注射，在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注 射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始 揀取高免疫蛋，并對應(yīng)不同的抗原，對所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；(4)制備抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY粗品首先將不同抗原分別免疫的禽所產(chǎn)高免疫蛋用0. 5%新潔而滅溶液或0. 1% KMnO4 溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī) 中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/L的 NaOH溶液或者lmol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)PH至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置8小時左右，稀釋 液通過8000-12000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后，采用細(xì)菌病毒濾除裝置，第一道細(xì)菌濾除裝置是用0. 22 μ m膜除菌過濾器 除去沙門菌細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0. 1 μ m膜除支原體過濾器除去支原體；第三 道病毒濾除裝置是用除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。以確保 所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌；將所制得的不同的抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合 IgY,以不同IgY相互混合的方式，進(jìn)一步組合成更多種不同的抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水 生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY。(5)抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY純品制備，將 所制得的各種抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY粗品分別過 離子交換柱和凝膠交換柱進(jìn)行純化，即得相應(yīng)的復(fù)合純IgY。(6)抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY納米化首先取所制成的各種抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合 IgY濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得各種抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體 特異性復(fù)合IgY干粉；再將所得干粉加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I-IOOnm之間、粒度 ^ 15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體 特異性復(fù)合IgY或IgY干粉；(7)把納米化抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY制成 脂質(zhì)體液晶微囊把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將任意一種納米化抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽 水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液配成IgY溶液，以每處理 0. 5min間歇0. 5min的方式超聲處理2min，立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至凝膠狀，漩渦振蕩 使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而35000r/min超速離心30min以分離除去未包入的 IgY，沉淀后用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，即制得納米脂質(zhì) 體化的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY。一種納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY的制備方法，包括以下步驟(1)采用基因工程技術(shù)重組脂蛋白磷脂酶A2表達(dá)蛋白首先用RT-PCR方法克隆脂蛋白磷脂酶A2的成熟肽編碼區(qū)基因；
然后將脂蛋白磷脂酶A2基因從真核表達(dá)載體pCGN-PLDl亞克隆至帶有綠色熒光 標(biāo)記蛋白的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中；再與腺病毒骨架載體一起在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，陽性重組子經(jīng)Pac I線性化后，轉(zhuǎn)染入病毒組裝細(xì)胞系293細(xì)胞，構(gòu)建專一性的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋 白，并用該病毒顆粒感染嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞，高效表達(dá)脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒 表達(dá)蛋白；把已被鑒定的脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白用氯化銫梯度離心純化，再 在QBI-293A細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增；(2)制備脂蛋白磷脂酶A2抗原將制得的脂蛋白磷脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例加入福 氏佐劑，然后置入高速勻漿機(jī)中，以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得脂 蛋白磷脂酶A2抗原。(3)制備含抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY的免疫蛋選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的無特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽，分別采 用上述制備的脂蛋白磷脂酶A2抗原在皮下注射，在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、 方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20 天開始揀取高免疫蛋，并對所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；(4)制備抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY粗品首先將所產(chǎn)高免疫蛋用0. 5%新潔而滅溶液或0. KMnO4溶液或其它同類消毒 液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋 黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/L的NaOH溶液或者lmol/ L的HCL溶液調(diào)節(jié)PH至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置8小時左右，稀釋液通過8000_12000r/ min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后，采用除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，以確保 所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌；即制得抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY。(5)制備抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY純品將所制得的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY粗品分別過離子交換柱和凝膠交換柱 進(jìn)行純化，即得相應(yīng)的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性純IgY。(6)將抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY納米化首先取所制成的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得 抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY干粉；再將所得干粉加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I-IOOnm之間、粒度 ^ 15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY干粉；(7)把納米化抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY制成脂質(zhì)體液晶微囊把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY加入 4mmol/L磷酸鹽緩沖液配成IgY溶液，以每處理0. 5min間歇0. 5min的方式超聲處理2min， 立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而 35000r/min超速離心30min以分離除去未包入的IgY，沉淀后用水洗二次，離心，得沉淀，用 lOmmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，即制得納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY。
一種納米脂質(zhì)體化的抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，包括 以下步驟(1)采用基因工程技術(shù)重組磷脂酶A2表達(dá)蛋白首先用RT-PCR方法克隆磷脂酶A2的成熟肽編碼區(qū)基因；然后將磷脂酶A2基因從真核表達(dá)載體pCGN-PLDl亞克隆至帶有綠色熒光標(biāo)記蛋 白的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中；再與腺病毒骨架載體一起在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，陽性重組子經(jīng)Pac I線性化后，轉(zhuǎn)染入病毒組裝細(xì)胞系293細(xì)胞，構(gòu)建專一性的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋 白，并用該病毒顆粒感染嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞，高效表達(dá)磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋 白；把已被鑒定的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白用氯化銫梯度離心純化，再在 QBI-293A細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增；(2)制備畜禽和水生動物腸道主要病原體復(fù)合抗原首先篩選引致禽畜和水生動物腸道感染性疾病的主要病原體，并進(jìn)行分類組合；接著，分別制備相應(yīng)的各種復(fù)合抗原；(3)制備含抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的免疫蛋選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的無特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽，分別采 用上述制備的各種復(fù)合抗原在皮下注射，在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注 射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始 揀取高免疫蛋，并對應(yīng)不同的抗原，對所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；(4)制備抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY粗品首先將不同抗原分別免疫的禽所產(chǎn)高免疫蛋用0. 5%新潔而滅溶液或0. 1% KMnO4 溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī) 中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/L的 NaOH溶液或者lmol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)PH至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置8小時左右，稀釋 液通過8000-12000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后，采用細(xì)菌病毒濾除裝置，第一道細(xì)菌濾除裝置是用0. 22 μ m膜除菌過濾器 除去沙門菌細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0. 1 μ m膜除支原體過濾器除去支原體；第三 道病毒濾除裝置是用除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。以確保 所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌；將制得的不同的抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY，以不同 IgY相互混合的方式，進(jìn)一步組合成更多種不同的抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體 特異性復(fù)合IgY。(5)抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY純品制備，將所制得 的各種抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY粗品分別過離子交換柱和 凝膠交換柱進(jìn)行純化，即得相應(yīng)的復(fù)合純IgY。(6)抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY納米化首先取所制成的各種抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY濃 縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得各種抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY干粉；再將所得干粉加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I-IOOnm之間、粒度 ^ 15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性 復(fù)合IgY或IgY干粉；(7)把納米化抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY制成脂質(zhì)體 液晶微囊把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將任意一種納米化抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽 水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液配成IgY溶液，以每處理 0. 5min間歇0. 5min的方式超聲處理2min，立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至凝膠狀，漩渦振蕩 使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而35000r/min超速離心30min以分離除去未包入的 IgY，沉淀后用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，即制得納米脂質(zhì) 體化的抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY?！N納米脂質(zhì)體化的抗磷脂酶A2特異性IgY的制備方法，包括以下步驟(1)采用基因工程技術(shù)重組磷脂酶A2表達(dá)蛋白首先用RT-PCR方法克隆磷脂酶A2的成熟肽編碼區(qū)基因；然后將磷脂酶A2基因從真核表達(dá)載體pCGN-PLDl亞克隆至帶有綠色熒光標(biāo)記蛋 白的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中；再與腺病毒骨架載體一起在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，陽性重組子經(jīng)Pac I線性化后，轉(zhuǎn)染入病毒組裝細(xì)胞系293細(xì)胞，構(gòu)建專一性的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋 白，并用該病毒顆粒感染嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞，高效表達(dá)磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋 白；把已被鑒定的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白用氯化銫梯度離心純化，再在 QBI-293A細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增；(2)制備磷脂酶A2抗原將制得的磷脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐劑， 然后置入高速勻漿機(jī)中，以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得磷脂酶A2抗原。(3)制備含抗磷脂酶A2特異性IgY的免疫蛋選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的無特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽，分別采 用上述制備的磷脂酶A2抗原在皮下注射，在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注 射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始 揀取高免疫蛋，并對所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；(4)制備抗磷脂酶A2特異性IgY粗品首先將所產(chǎn)高免疫蛋用0. 5%新潔而滅溶液或0. KMnO4溶液或其它同類消毒 液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋 黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/L的NaOH溶液或者lmol/ L的HCL溶液調(diào)節(jié)PH至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置8小時左右，稀釋液通過8000_12000r/ min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后，采用除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，以確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌；即制得抗磷脂酶A2特異性IgY。(5)制備抗磷脂酶A2特異性IgY純品將所制得的抗磷脂酶A2特異性IgY粗品分別過離子交換柱和凝膠交換柱進(jìn)行純 化，即得相應(yīng)的抗磷脂酶A2特異性純IgY。(6)將抗磷脂酶A2特異性IgY納米化首先取所制成的抗磷脂酶A2特異性IgY濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗脂磷 脂酶A2特異性IgY干粉；再將所得干粉加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I-IOOnm之間、粒度 ^ 15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗磷脂酶A2特異性IgY干粉；(7)把納米化抗磷脂酶A2特異性IgY制成脂質(zhì)體液晶微囊把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗磷脂酶A2特異性IgY加入4mmol/L 磷酸鹽緩沖液配成IgY溶液，以每處理0. 5min間歇0. 5min的方式超聲處理2min，立即在水 浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而35000r/min 超速離心30min以分離除去未包入的IgY，沉淀后用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/L的 磷酸鹽緩沖液稀釋，即制得納米脂質(zhì)體化的抗磷脂酶A2特異性IgY。以下對步驟(1)和步驟(2)以及步驟⑷分別進(jìn)一步具體說明。1.步驟(1)的操作步驟如下(101)在培養(yǎng)皿中加入DMEM5%培養(yǎng)5X 106 QBI-293A細(xì)胞；(102)移去培養(yǎng)液，小心加入脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白混合液，十字 形慢慢晃動3次，在37°C的CO2孵箱中培養(yǎng)90分鐘；(103)加入 DMEM5% ；(104)再培養(yǎng)72小時，這時在IOml溶液中大約有5X109 5X1010個脂蛋白磷
脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白顆粒；(105)進(jìn)行脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白滴度測定，收集細(xì)胞，600g離心 5分鐘沉淀細(xì)胞，去上清液后加入最小體積病毒保存溶液重懸細(xì)胞，-200C /37°C凍融3次， 臺式離心機(jī)上以最大速率離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液，然后進(jìn)行病毒滴定；(106)-20°c /37°C凍融 3 次；(107)轉(zhuǎn)入無菌離心管中，臺式離心機(jī)上以最大速率離心10分鐘，收集上清液凍 存于-20°C或 _80°C ；(108)在培養(yǎng)瓶中加入107 QBI-293A細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；(109)將細(xì)胞裂解液上清液加入DMEM5%中，混勻，移去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入混合液， 十字形慢慢晃動混勻3次，370C的CO2孵箱中培養(yǎng)90分鐘；(110)加入 DMEM5%至 30ml ；(111)再培養(yǎng)48 72小時，600g離心5分鐘收集細(xì)胞，棄上清液，加入1/10原始 體積的溶液重懸細(xì)胞，-20°C /37°C凍融3次，臺式離心機(jī)上以最大速率沉淀細(xì)胞碎片，收集 上清液；(112)移入50ml離心管中，臺式離心機(jī)上最大速率離心10分鐘，取出上清液保 存；(113)在培養(yǎng)瓶中加入107 QBI-293A細(xì)胞；
(114)將細(xì)胞裂解液上清液加入DMEM5%混勻，從培養(yǎng)瓶中移去培養(yǎng)液，加入混合 液感染細(xì)胞，十字形緩慢晃動3次混勻，37°C培養(yǎng)90分鐘；(115)加入 DMEM5%M 30ml/ 瓶；(116)再培養(yǎng)48-72小時，進(jìn)行MOI測定估計(jì)病毒滴度，用標(biāo)準(zhǔn)的氯化銫密度梯度 離心法純化病毒，則獲得大量純化的脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白保存液。2. 1.步驟(2)中的禽畜和水生動物腸道感染性疾病的主要病原體為豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病原體A.細(xì)菌類a.腸毒性大腸埃希氏菌，b. C型魏氏梭菌菌株，c.豬鏈球菌，B.病毒類a.豬傳染性胃腸炎病毒，b.豬流行性腹瀉病毒，C.豬輪狀病毒；水生動物主要感染病原體A.細(xì)菌類a.柱狀嗜纖維菌，b.嗜水氣單胞菌，c.氣單胞菌，d.孤菌，C.真菌類a.水霉菌，b.綿霉菌，c.絲囊霉菌，d.鰓霉菌，D.病毒類a.呼腸孤病毒，b.魚皰疹病毒；牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病原體A.細(xì)菌類牛腸毒性大腸埃希氏菌，B.病毒類a.牛傳染性胃腸炎病毒，b.牛流行性腹瀉病毒，c.牛輪狀病毒；禽黃白痢等腸炎病原體a.禽大腸桿菌，b.沙門氏菌，
c.金黃色葡萄球菌。2. 2.步驟(2)中制備畜禽水生動物腸道主要病原體復(fù)合抗原的具體步驟為制備豬用復(fù)合抗原A.制備脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道致病菌復(fù)合抗原a.制作腸道致病菌復(fù)合抗原成份，按照腸毒性大腸埃希氏菌和C型魏氏梭菌以及豬鏈球菌的培養(yǎng)特性和培養(yǎng)條件， 分別選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；然后將腸毒性大腸埃 希氏菌、C型魏氏梭菌、豬鏈球菌三種細(xì)菌按重量比1-10 1-10 1-10的比例混合，再采 用超聲粉碎機(jī)將所培養(yǎng)的大腸桿菌和C型魏氏梭菌以及豬鏈球菌粉碎，獲得含全菌和菌體 成份的混合物；b.抗原制作，將制得的含全菌和菌體成份的混合液與前述采用基因重組技術(shù)制成的脂蛋白磷 脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例混合均勻，得到復(fù)合蛋白液，再將 這種復(fù)合蛋白液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐劑，然后置入高速勻漿機(jī)中，以 30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道致病菌復(fù)合 抗原；B.制備豬腸道病毒復(fù)合抗原a.制備豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒復(fù)合抗原成份，將豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒以及豬輪狀病毒、三種病毒之標(biāo)準(zhǔn)毒 株，采用常規(guī)方法增殖培養(yǎng)，再提純，將所增殖并提純的豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹 瀉病毒以及豬輪狀病毒按重量比1-10 1-10 1-10的比例混合，然后加入十二烷基硫酸 鈉，調(diào)整濃度為1. 8-2. 5%，裂解30分鐘，即分別得到豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉 病毒以及豬輪狀病毒組合的病毒裂解液；b.制備病毒復(fù)合抗原，將豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒以及豬輪狀病毒三者組合的病毒裂解 液以重量比1-10 1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，OOOrpm高速勻化，形 成油包水乳液，即制得豬腸道病毒復(fù)合抗原；水生動物類復(fù)合抗原A.制備脂蛋白磷脂酶A2和水生動物致病菌復(fù)合抗原a.制作水生動物致病細(xì)菌抗原成份，按照柱狀嗜纖維菌、嗜水氣單胞菌、氣單胞菌和孤菌四種標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)特性和 培養(yǎng)條件，分別選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；b.制作水生動物真菌抗原成份，按照水霉菌、綿霉菌、絲囊霉菌和鰓霉菌四種標(biāo)準(zhǔn)真菌株的培養(yǎng)特性和培養(yǎng)條件， 分別選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行真菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物提純、分裝；c.超聲粉碎增加抗原性，將所培養(yǎng)好的嗜纖維菌、嗜水氣單胞菌、氣單胞菌、孤菌以及水霉菌、綿霉菌、絲囊 霉菌、鰓霉菌按重量比 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 的比 例混合，然后加以超聲粉碎，得到水生動物腸道致病細(xì)菌和真菌菌體成份；
d.抗原制作，將所制得的水生動物腸道致病細(xì)菌和真菌菌體成份混合液與前述采用基因重組 技術(shù)制成的脂蛋白磷脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例混合均勻，得到 復(fù)合蛋白液；再將這種復(fù)合蛋白液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐劑，然后置入高 速勻漿機(jī)中，以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得脂蛋白磷脂酶A2和水生 動物腸道致病菌復(fù)合抗原；B.制備水生動物腸道病毒復(fù)合抗原將草魚出血病疫苗和斑點(diǎn)叉尾鮰病毒疫苗兩種疫苗按重量比1 1的比例 混合均勻后進(jìn)行超高速離心分離，再濃縮加工；然后加入十二烷基硫酸鈉，調(diào)整濃度為 1.8-2.5%，裂解30分鐘，再以重量比1-10 10-1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中， 以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得水生動物腸道病毒復(fù)合抗原；牛用復(fù)合抗原A.制備脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道致病菌復(fù)合抗原a.采用牛大腸桿菌k88、k99兩種纖毛作為抗原成份，將培養(yǎng)好的牛大腸桿菌k88、 k99兩種纖毛先按重量比1 1比例混合均勻，然后將所得混合液與前述采用基因重組技術(shù) 制成的脂蛋白磷脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例混合均勻，得到復(fù)合 蛋白液；再將這種復(fù)合蛋白液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐劑，然后置入高速勻 漿機(jī)中，以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道致 病菌復(fù)合抗原；B.制備牛腸道病毒復(fù)合抗原；a.制備牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒復(fù)合抗原成份，采用常規(guī)方法對牛傳染性胃腸炎病毒、牛流行性腹瀉病毒以及牛輪狀病毒三種病 毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行增殖培養(yǎng)，再提純，將所增殖并提純的牛傳染性胃腸炎病毒、牛流行性腹 瀉病毒、以及牛輪狀病毒按重量比1-10 1-10 1-10的比例混合，然后加入十二烷基硫 酸鈉，調(diào)整濃度為1. 8-2. 5%，裂解30分鐘，即分別得到牛傳染性胃腸炎病毒、牛流行性腹 瀉病毒、以及牛輪狀病毒組合的病毒裂解液；b.制備病毒復(fù)合抗原，將牛傳染性胃腸炎病毒、牛流行性腹瀉病毒以及牛輪狀病毒以三者組合的病毒裂 解液的比例以重量比1-10 1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，OOOrpm高 速勻化，形成油包水乳液，即制得腸道病毒復(fù)合抗原；禽用復(fù)合抗原制備脂蛋白磷脂酶A2和禽腸道致病菌復(fù)合抗原a.制作禽腸道致病細(xì)菌抗原成份，按照禽大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌三種標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)特性和培養(yǎng)條 件，分別選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；b.超聲粉碎增加抗原性，將所培養(yǎng)好的禽大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌三種禽腸道致病菌按重量 比1-10 1-10 1-10的比例混合，然后加以超聲粉碎，得到禽腸道致病菌菌體成份；c.抗原制作，
將所制得的禽腸道致病菌菌體成份混合液與前述采用基因重組技術(shù)制成的脂蛋 白磷脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例混合均勻，得到復(fù)合蛋白液；再 將這種復(fù)合蛋白液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐劑，然后置入高速勻漿機(jī)中，以 30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得脂蛋白磷脂酶A2和禽腸道致病菌復(fù)合 抗原。3.步驟(4)中復(fù)合IgY的制備方式，分別為A.對于抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法來說，按步驟(3)、(4)的方法制備抗脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道致病菌特異性復(fù)合IgY 以及抗豬腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10_1的 比例與抗豬腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道病原體 特異性復(fù)合IgY ；按步驟(3)、(4)的方法制備抗脂蛋白磷脂酶A2和水生動物腸道致病菌特異性復(fù) 合IgY以及抗水生動物腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗脂蛋白磷脂酶A2和水生動物腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比 1-10 10-1的比例與抗水生動物腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗脂蛋白磷脂 酶A2和水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY ；按步驟(3)、(4)的方法制備抗脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道病原體特異性復(fù)合IgY 以及抗牛腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10_1的 比例與抗牛腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道病原體 特異性復(fù)合IgY ；按步驟(3)、(4)的方法制備抗脂蛋白磷脂酶A2和禽腸道致病菌特異性復(fù)合IgY。B.對于抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法來說，按步驟(3)、(4)的方法制備抗磷脂酶A2和豬腸道致病菌特異性復(fù)合IgY以及抗 豬腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗磷脂酶A2和豬腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10_1的比例與 抗豬腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗磷脂酶A2和豬腸道病原體特異性復(fù)合 IgY ；按步驟(3)、(4)的方法制備抗磷脂酶A2和水生動物腸道致病菌特異性復(fù)合IgY 以及抗水生動物腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗磷脂酶A2和水生動物腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10-1的 比例與抗水生動物腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗磷脂酶A2和水生動物腸道 病原體特異性復(fù)合IgY ；按步驟(3)、(4)的方法制備抗磷脂酶A2和牛腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗 牛腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗磷脂酶A2和牛腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10_1的比例與 抗牛腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗磷脂酶A2和牛腸道病原體特異性復(fù)合 IgY ；
按步驟(3)、(4)的方法制備抗磷脂酶A2和禽腸道致病菌特異性復(fù)合IgY。本發(fā)明把按上述方法制備的抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及 抗蛇毒活性酶A2特異性IgY包括納米脂質(zhì)體抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合 IgY或抗磷脂酶A2特異性IgY或者抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY配以玉米蛋 白粉或小麥粉或氨基酸粉或工業(yè)葡萄糖等載體成份或輔料或溶劑，制成各種畜禽用及水生 動物用飼料和飼料添加劑或預(yù)配料或水劑或者水產(chǎn)養(yǎng)殖專用的浸浴劑。具體的，抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特 異性IgY包括納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY、抗磷脂酶 A2特異性IgY以及抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY在飼料添加劑上的應(yīng)用，將抗 磷脂酶A2特異性IgY或者任意一種納米脂質(zhì)體抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù) 合IgY或者抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY (包括納米脂質(zhì)體化IgY和普通IgY) 配以氨基酸粉或工業(yè)葡萄糖等載體成份或輔料或溶劑，制成家畜、家禽、水生動物用飼料添 加劑或預(yù)配料或水劑。具體的，抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特 異性IgY包括納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY、抗磷脂酶 A2特異性IgY以及抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY在飼料上的應(yīng)用，將抗磷脂酶 A2特異性IgY或者任意一種納米脂質(zhì)體抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY 或者抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY(包括納米脂質(zhì)體化IgY和普通IgY)配以 玉米蛋白粉或小麥粉或各種輔料或溶劑，制成相應(yīng)家畜、家禽、水生動物用飼料或預(yù)配料或 水劑或者水生動物專用浸浴劑。本發(fā)明畜禽或水生動物食用含有這種抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合 IgY以及抗蛇毒活性酶A2特異性IgY包括納米脂質(zhì)體抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特 異性復(fù)合IgY或抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY或者抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合 IgY或抗磷脂酶A2特異性IgY的飼料、飼料添加劑或預(yù)配料和水劑后，或者水生動物采用 這種納米脂質(zhì)體抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY或抗脂蛋白磷脂酶A2特 異性IgY或者抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY或抗磷脂酶A2特異性IgY專用浸 浴劑浸浴后，抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY抗體或抗脂蛋白磷脂酶A2 特異性IgY抗體或者抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY抗體或抗磷脂酶A2特異性 IgY抗體就會布滿畜禽或水生動物的腸道粘膜表面，抑制會影響營養(yǎng)吸收的脂蛋白磷脂酶 A2或磷脂酶A2，改善飼料轉(zhuǎn)化效率。特別是，抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合 IgY抗體或者抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY抗體還會阻止病毒和致病菌感染， 維護(hù)腸道健康，增強(qiáng)整體免疫力，有效預(yù)防和治療致病菌和病毒引致的疾病；從而，進(jìn)一步 增加營養(yǎng)吸收，降低料肉比，提升養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)例1 :IgY的含量檢測應(yīng)用SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉一聚丙烯凝膠)電泳測定法，分別對按以上工藝 所制取的抗脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道病原體特異性復(fù)合IgY、抗脂蛋白磷脂酶A2和水生動 物腸道病原體特異性復(fù)合IgY、抗脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道病原體特異性復(fù)合IgY、抗脂蛋
24白磷脂酶A2和禽腸道致病菌特異性復(fù)合IgY粗提物進(jìn)行檢測，結(jié)果含IgY 45-52%。IgY 粗提物經(jīng)二次過柱純化后，得到純IgY。經(jīng)SDS-PAGE分析，純度達(dá)到PAGE純，如下表所示
權(quán)利要求
一種納米脂質(zhì)體化的抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，它可以是抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY，其特征在于包括以下步驟(1)采用基因工程技術(shù)重組脂蛋白磷脂酶A2表達(dá)蛋白，首先用RT PCR方法克隆脂蛋白磷脂酶A2的成熟肽編碼區(qū)基因；然后將脂蛋白磷脂酶A2基因從真核表達(dá)載體pCGN PLD1亞克隆至帶有綠色熒光標(biāo)記蛋白的穿梭質(zhì)粒pAdTrack CMV中；再與腺病毒骨架載體一起在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，陽性重組子經(jīng)Pac I線性化后，轉(zhuǎn)染入病毒組裝細(xì)胞系293細(xì)胞，構(gòu)建專一性的脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白，并用該病毒顆粒感染嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞，高效表達(dá)脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白；把已被鑒定的脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白用氯化銫梯度離心純化，再在QBI 293A細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增；(2)制備畜禽和水生動物腸道主要病原體復(fù)合抗原首先篩選引致畜禽和水生動物腸道感染性疾病的主要病原體，并進(jìn)行分類組合；再分別制備相應(yīng)的各種復(fù)合抗原；(3)制備含抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的免疫蛋選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的無特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽，分別采用制備的各種復(fù)合抗原在皮下注射，在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始揀取高免疫蛋，并對應(yīng)不同的抗原，對所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；(4)制備抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY粗品，首先將不同抗原分別免疫的禽所產(chǎn)高免疫蛋用0.5％新潔而滅溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用1mol/L的NaOH溶液或者1mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)PH至5.5～6.0，4～6℃下靜置8小時左右，稀釋液通過8000 12000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后，采用除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，以確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌；將制得的不同的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY，進(jìn)一步組合成更多種不同的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY；(5)抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY純品制備，將所制得的各種抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY粗品分別過離子交換柱和凝膠交換柱進(jìn)行純化，即得相應(yīng)的復(fù)合純IgY；(6)抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY納米化，首先取所制成的各種抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得各種抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY干粉；再將所得干粉加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在1 100nm之間、粒度≥15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY或IgY干粉；(7)把納米化抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY制成脂質(zhì)體液晶微囊，把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將任意一種納米化抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液配成IgY溶液，以每處理0.5min間歇0.5min的方式超聲處理2min，立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而35000r/min超速離心30min以分離除去未包入的IgY，沉淀后用水洗二次，離心，得沉淀，用10mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，即制得納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY。
2. —種納米脂質(zhì)體化的抗蛇毒活性酶A2特異性IgY的制備方法，它可以是抗脂蛋白磷 脂酶A2特異性IgY，其特征在于包括以下步驟(1)采用基因工程技術(shù)重組脂蛋白磷脂酶A2表達(dá)蛋白，首先用RT-PCR方法克隆脂蛋白磷脂酶A2的成熟肽編碼區(qū)基因；然后將脂蛋白磷脂酶A2基因從真核表達(dá)載體pCGN-PLDl亞克隆至帶有綠色熒光標(biāo)記 蛋白的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中；再與腺病毒骨架載體一起在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，陽性重組子經(jīng)Pac I線 性化后，轉(zhuǎn)染入病毒組裝細(xì)胞系293細(xì)胞，構(gòu)建專一性的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白，并 用該病毒顆粒感染嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞，高效表達(dá)脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá) 蛋白；把已被鑒定的脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白用氯化銫梯度離心純化，再在 QBI-293A細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增；(2)磷脂酶A2抗原制作將制得的脂蛋白磷脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐 劑，然后置入高速勻漿機(jī)中，以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得脂蛋白 磷脂酶A2抗原；(3)制備含抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY的免疫蛋選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的無特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽，采用制備的 脂蛋白磷脂酶A2重組表達(dá)蛋白抗原在皮下注射，在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、 方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20 天開始揀取高免疫蛋，并進(jìn)行編碼標(biāo)記；(4)抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY粗品的制備首先將所產(chǎn)高免疫蛋用0. 5%新潔而滅溶液或0. 1% KMnO4溶液或其它同類消毒液將 免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩 濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/L的NaOH溶液或者lmol/L的 HCL溶液調(diào)節(jié)PH至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置8小時左右，稀釋液通過8000_12000r/min 高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后，采用除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，以確保所制 備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌；即制得抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY ；(5)抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY純品制備將所制得的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY粗品過離子交換柱和凝膠交換柱進(jìn)行純化， 即得抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY純品；(5)抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY納米化首先取所制成的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗脂 蛋白磷脂酶A2特異性IgY干粉；再將所得干粉加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I-IOOnm之間、粒度> 15000 目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY干粉；(6)把納米化抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY制成脂質(zhì)體液晶微囊。把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗磷脂酶A2特異性IgY加入4mmol/L磷 酸鹽緩沖液配成IgY溶液，以每處理0. 5min間歇0. 5min的方式超聲處理2min，立即在水 浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而35000r/min 超速離心30min以分離除去未包入的IgY，沉淀后用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/L的 磷酸鹽緩沖液稀釋，即制得納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異 性復(fù)合IgY的制備方法和權(quán)利要求2所述的一種納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2特異 性IgY的制備方法，其特征在于所述步驟(1)的操作步驟如下(101)在培養(yǎng)皿中加入DMEM5%培養(yǎng)5X106QBI-293A細(xì)胞；(102)移去培養(yǎng)液，小心加入脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白混合液，十字形慢 慢晃動3次，在37°C的CO2孵箱中培養(yǎng)90分鐘；(103)加入DMEM5% ；(104)再培養(yǎng)72小時，這時在IOml溶液中大約有5X109 5X 1010個脂蛋白磷脂酶 A2重組腺病毒表達(dá)蛋白顆粒；(105)進(jìn)行脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白滴度測定，收集細(xì)胞，600g離心5分 鐘沉淀細(xì)胞，去上清液后加入最小體積病毒保存溶液重懸細(xì)胞，-20°C /37°C凍融3次，臺式 離心機(jī)上以最大速率離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液，然后進(jìn)行病毒滴定；(106)-20°C/37°C凍融 3 次;(107)轉(zhuǎn)入無菌離心管中，臺式離心機(jī)上以最大速率離心10分鐘，收集上清液凍存 于-20°C或 _80°C ；(108)在培養(yǎng)瓶中加入107QBI-293A細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；(109)將細(xì)胞裂解液上清液加入DMEM5%中，混勻，移去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入混合液，十字 形慢慢晃動混勻3次，370C的CO2孵箱中培養(yǎng)90分鐘；(110)加入DMEM5%至 30ml ；(111)再培養(yǎng)48 72小時，600g離心5分鐘收集細(xì)胞，棄上清液，加入1/10原始體積 的溶液重懸細(xì)胞，-20°C /37°C凍融3次，臺式離心機(jī)上以最大速率沉淀細(xì)胞碎片，收集上清 液；(112)移入50ml離心管中，臺式離心機(jī)上最大速率離心10分鐘，取出上清液保存；(113)在培養(yǎng)瓶中加入107QBI-293A細(xì)胞；(114)將細(xì)胞裂解液上清液加入DMEM5%混勻，從培養(yǎng)瓶中移去培養(yǎng)液，加入混合液感 染細(xì)胞，十字形緩慢晃動3次混勻，37°C培養(yǎng)90分鐘；(115)加入DMEM5%至 30ml/ 瓶；(116)再培養(yǎng)48-72小時，進(jìn)行MOI測定估計(jì)病毒滴度，用標(biāo)準(zhǔn)的氯化銫密度梯度離心法純化病毒，則獲得大量純化的脂蛋白磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白保存液。
4. 一種納米脂質(zhì)體化的抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，它 可以是抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY，包括以下步驟(1)采用基因工程技術(shù)重組磷脂酶A2表達(dá)蛋白， 首先用RT-PCR方法克隆磷脂酶A2的成熟肽編碼區(qū)基因；然后將磷脂酶A2基因從真核表達(dá)載體pCGN-PLDl亞克隆至帶有綠色熒光標(biāo)記蛋白的 穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中；再與腺病毒骨架載體一起在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，陽性重組子經(jīng)Pac I線 性化后，轉(zhuǎn)染入病毒組裝細(xì)胞系293細(xì)胞，構(gòu)建專一性的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白，并 用該病毒顆粒感染嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞，高效表達(dá)磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白；把已被鑒定的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白用氯化銫梯度離心純化，再在QBI-293A 細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增；(2)制備畜禽和水生動物腸道主要病原體復(fù)合抗原首先篩選引致畜禽和水生動物腸道感染性疾病的主要病原體，并進(jìn)行分類組合； 再分別制備相應(yīng)的各種復(fù)合抗原；(3)制備含抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的免疫蛋選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的無特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽，分別采用 制備的各種復(fù)合抗原在皮下注射，在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二 次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始揀取高 免疫蛋，并對應(yīng)不同的抗原，對所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；(4)制備抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY粗品，首先將不同抗原分別免疫的禽所產(chǎn)高免疫蛋用0. 5%新潔而滅溶液或0. 1% KMnO4溶 液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中 將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/L的 NaOH溶液或者lmol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)PH至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置8小時左右，稀釋 液通過8000-12000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后，采用除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，以確保所制 備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌；將制得的不同的抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY，進(jìn)一步組合成更多種不同 的抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY ；(5)抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY純品制備，將所制得的各種抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY粗品分別過離子交換柱和 凝膠交換柱進(jìn)行純化，即得相應(yīng)的復(fù)合純IgY ；(6)抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY納米化，首先取所制成的各種抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY濃縮液用冷凍干燥機(jī) 干燥，即制得各種抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY干粉；再將所得干粉加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I-IOOnm之間、粒度> 15000 目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY或IgY干粉；(7)把納米化抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY制成脂質(zhì)體液晶微囊，把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將任意一種納米化抗磷脂酶A2和畜禽水生動物腸 道病原體特異性復(fù)合IgY加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液配成IgY溶液，以每處理0. 5min間 歇0. 5min的方式超聲處理2min，立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn) 相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而35000r/min超速離心30min以分離除去未包入的IgY，沉淀 后用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，即制得納米脂質(zhì)體化的抗 磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY。
5. 一種納米脂質(zhì)體化的抗蛇毒活性酶A2特異性IgY的制備方法，它可以是抗磷脂酶 A2特異性IgY，其特征在于包括以下步驟(1)采用基因工程技術(shù)重組磷脂酶A2表達(dá)蛋白，首先用RT-PCR方法克隆磷脂酶A2的成熟肽編碼區(qū)基因；然后將磷脂酶A2基因從真核表達(dá)載體pCGN-PLDl亞克隆至帶有綠色熒光標(biāo)記蛋白的 穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中；再與腺病毒骨架載體一起在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，陽性重組子經(jīng)Pac I線 性化后，轉(zhuǎn)染入病毒組裝細(xì)胞系293細(xì)胞，構(gòu)建專一性的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白，并 用該病毒顆粒感染嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞，高效表達(dá)磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白；把已被鑒定的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白用氯化銫梯度離心純化，再在QBI-293A 細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增；(2)磷脂酶A2抗原制作將制得的磷脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐劑，然后 置入高速勻漿機(jī)中，以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得磷脂酶A2抗原；(3)制備含抗磷脂酶A2特異性IgY的免疫蛋選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的無特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋禽，采用制備的 磷脂酶A2重組表達(dá)蛋白抗原在皮下注射，在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注 射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始 揀取高免疫蛋，并進(jìn)行編碼標(biāo)記；(4)抗磷脂酶A2特異性IgY粗品的制備首先將所產(chǎn)高免疫蛋用0. 5%新潔而滅溶液或0. 1% KMnO4溶液或其它同類消毒液將 免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩 濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/L的NaOH溶液或者lmol/L的 HCL溶液調(diào)節(jié)PH至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置8小時左右，稀釋液通過8000_12000r/min 高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后，采用除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，以確保所制 備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌；即制得抗磷脂酶A2特異性IgY ；(5)抗磷脂酶A2特異性IgY純品制備將所制得的抗磷脂酶A2特異性IgY粗品過離子交換柱和凝膠交換柱進(jìn)行純化，即得抗 磷脂酶A2特異性IgY純品；(5)抗磷脂酶A2特異性IgY納米化首先取所制成的抗磷脂酶A2特異性IgY濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗磷脂酶A2 特異性IgY干粉；再將所得干粉加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I-IOOnm之間、粒度> 15000 目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗磷脂酶A2特異性IgY干粉；(6)把納米化抗磷脂酶A2特異性IgY制成脂質(zhì)體液晶微囊，把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗磷脂酶A2特異性IgY加入4mmol/L磷 酸鹽緩沖液配成IgY溶液，以每處理0. 5min間歇0. 5min的方式超聲處理2min，立即在水 浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而35000r/min 超速離心30min以分離除去未包入的IgY，沉淀后用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/L的 磷酸鹽緩沖液稀釋，即制得納米脂質(zhì)體化的抗磷脂酶A2特異性IgY。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種納米脂質(zhì)體化的抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合 IgY的制備方法和權(quán)利要求5所述的一種納米脂質(zhì)體化的抗磷脂酶A2特異性IgY的制備方 法，其特征在于所述步驟(1)的操作步驟如下(101)在培養(yǎng)皿中加入DMEM5%培養(yǎng)5X106QBI-293A細(xì)胞；(102)移去培養(yǎng)液，小心加入磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白混合液，十字形慢慢晃動3 次，在37°C的CO2孵箱中培養(yǎng)90分鐘；(103)加入DMEM5% ；(104)再培養(yǎng)72小時，這時在IOml溶液中大約有5X109 5X 1010個磷脂酶A2重組 腺病毒表達(dá)蛋白顆粒；(105)進(jìn)行磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白滴度測定，收集細(xì)胞，600g離心5分鐘沉淀 細(xì)胞，去上清液后加入最小體積病毒保存溶液重懸細(xì)胞，-20°C /37°C凍融3次，臺式離心機(jī) 上以最大速率離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液，然后進(jìn)行病毒滴定；(106)-20°C/37°C凍融 3 次;(107)轉(zhuǎn)入無菌離心管中，臺式離心機(jī)上以最大速率離心10分鐘，收集上清液凍存 于-20°C或 _80°C ；(108)在培養(yǎng)瓶中加入107QBI-293A細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；(109)將細(xì)胞裂解液上清液加入DMEM5%中，混勻，移去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入混合液，十字 形慢慢晃動混勻3次，370C的CO2孵箱中培養(yǎng)90分鐘；(110)加入DMEM5%至 30ml ；(111)再培養(yǎng)48 72小時，600g離心5分鐘收集細(xì)胞，棄上清液，加入1/10原始體積 的溶液重懸細(xì)胞，-20°C /37°C凍融3次，臺式離心機(jī)上以最大速率沉淀細(xì)胞碎片，收集上清 液；(112)移入50ml離心管中，臺式離心機(jī)上最大速率離心10分鐘，取出上清液保存；(113)在培養(yǎng)瓶中加入107QBI-293A細(xì)胞；(114)將細(xì)胞裂解液上清液加入DMEM5%混勻，從培養(yǎng)瓶中移去培養(yǎng)液，加入混合液感 染細(xì)胞，十字形緩慢晃動3次混勻，37°C培養(yǎng)90分鐘；(115)加入DMEM5%至 30ml/ 瓶；(116)再培養(yǎng)48-72小時，進(jìn)行MOI測定估計(jì)病毒滴度，用標(biāo)準(zhǔn)的氯化銫密度梯度離心 法純化病毒，則獲得大量純化的磷脂酶A2重組腺病毒表達(dá)蛋白保存液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異 性復(fù)合IgY的制備方法以及權(quán)利要求4所述的一種納米脂質(zhì)體化的抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的禽畜和水生動物腸道感染 性疾病的主要病原體為豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病原體A.細(xì)菌類a.腸毒性大腸埃希氏菌，b.C型魏氏梭菌菌株，c.豬鏈球菌，B.病毒類a.豬傳染性胃腸炎病毒，b.豬流行性腹瀉病毒，c.豬輪狀病毒；水生動物主要感染病原體 A.細(xì)菌類a.柱狀嗜纖維菌，b.嗜水氣單胞菌，c.氣單胞菌，d.孤菌，C.真菌類a.水霉菌，b.綿霉菌，c.絲囊霉菌，d.鮑、霉菌，D.病毒類a.呼腸孤病毒，b.魚皰疹病毒；牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病原體A.細(xì)菌類牛腸毒性大腸埃希氏菌，B.病毒類a.牛傳染性胃腸炎病毒，b.牛流行性腹瀉病毒，c.牛輪狀病毒；禽黃白痢等腸炎病原體a.禽大腸桿菌，b.沙門氏菌，c.金黃色葡萄球菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異 性復(fù)合IgY的制備方法以及權(quán)利要求4所述的一種納米脂質(zhì)體化的抗磷脂酶A2和腸道病 原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中制備畜禽水生動物腸道主要病原體復(fù)合抗原的具體步驟為制備豬用復(fù)合抗原A.制備脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道致病菌復(fù)合抗原a.制作腸道致病菌復(fù)合抗原成份，按照腸毒性大腸埃希氏菌和C型魏氏梭菌以及豬鏈球菌的培養(yǎng)特性和培養(yǎng)條件，分別 選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；然后將腸毒性大腸埃希氏 菌、C型魏氏梭菌、豬鏈球菌三種細(xì)菌按重量比1-10 1-10 1-10的比例混合，再采用超 聲粉碎機(jī)將所培養(yǎng)的大腸桿菌和C型魏氏梭菌以及豬鏈球菌粉碎，獲得含全菌和菌體成份 的混合物；b.抗原制作，將制得的含全菌和菌體成份的混合液與前述采用基因重組技術(shù)制成的脂蛋白磷脂酶 A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例混合均勻，得到復(fù)合蛋白液，再將這種復(fù)合 蛋白液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐劑，然后置入高速勻漿機(jī)中，以30，OOOrpm 高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道致病菌復(fù)合抗原；B.制備豬腸道病毒復(fù)合抗原a.制備豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒復(fù)合抗原成份，將豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒以及豬輪狀病毒、三種病毒之標(biāo)準(zhǔn)毒株，采 用常規(guī)方法增殖培養(yǎng)，再提純，將所增殖并提純的豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病 毒以及豬輪狀病毒按重量比1-10 1-10 1-10的比例混合，然后加入十二烷基硫酸鈉， 調(diào)整濃度為1. 8-2. 5%，裂解30分鐘，即分別得到豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病 毒以及豬輪狀病毒組合的病毒裂解液；b.制備病毒復(fù)合抗原，將豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒以及豬輪狀病毒三者組合的病毒裂解液以 重量比1-10 1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，OOOrpm高速勻化，形成油 包水乳液，即制得豬腸道病毒復(fù)合抗原；水生動物類復(fù)合抗原A.制備脂蛋白磷脂酶A2和水生動物致病菌復(fù)合抗原a.制作水生動物致病細(xì)菌抗原成份，按照柱狀嗜纖維菌、嗜水氣單胞菌、氣單胞菌和孤菌四種標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)特性和培養(yǎng) 條件，分別選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；b.制作水生動物真菌抗原成份，按照水霉菌、綿霉菌、絲囊霉菌和鰓霉菌四種標(biāo)準(zhǔn)真菌株的培養(yǎng)特性和培養(yǎng)條件，分別 選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行真菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；c.超聲粉碎增加抗原性，將所培養(yǎng)好的嗜纖維菌、嗜水氣單胞菌、氣單胞菌、孤菌以及水霉菌、綿霉菌、絲囊霉 菌、鰓霉菌按重量比 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 的比例 混合，然后加以超聲粉碎，得到水生動物腸道致病細(xì)菌和真菌菌體成份；d.抗原制作，將所制得的水生動物腸道致病細(xì)菌和真菌菌體成份混合液與前述采用基因重組技術(shù)制成的脂蛋白磷脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例混合均勻，得到復(fù)合 蛋白液；再將這種復(fù)合蛋白液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐劑，然后置入高速勻 漿機(jī)中，以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得脂蛋白磷脂酶A2和水生動物 腸道致病菌復(fù)合抗原；B.制備水生動物腸道病毒復(fù)合抗原將草魚出血病疫苗和斑點(diǎn)叉尾鮰病毒疫苗兩種疫苗按重量比11的比例混合均勻后 進(jìn)行超高速離心分離，再濃縮加工；然后加入十二烷基硫酸鈉，調(diào)整濃度為1.8-2.5%，裂 解30分鐘，再以重量比1-10 10-1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以30，OOOrpm 高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得水生動物腸道病毒復(fù)合抗原；牛用復(fù)合抗原A.制備脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道致病菌復(fù)合抗原a.采用牛大腸桿菌k88、k99兩種纖毛作為抗原成份，將培養(yǎng)好的牛大腸桿菌k88、k99 兩種纖毛先按重量比1 1比例混合均勻，然后將所得混合液與前述采用基因重組技術(shù)制 成的脂蛋白磷脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例混合均勻，得到復(fù)合蛋 白液；再將這種復(fù)合蛋白液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐劑，然后置入高速勻漿 機(jī)中，以30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道致病 菌復(fù)合抗原；B.制備牛腸道病毒復(fù)合抗原；a.制備牛傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒復(fù)合抗原成份，采用常規(guī)方法對牛傳染性胃腸炎病毒、牛流行性腹瀉病毒以及牛輪狀病毒三種病毒的 標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行增殖培養(yǎng)，再提純，將所增殖并提純的牛傳染性胃腸炎病毒、牛流行性腹瀉病 毒、以及牛輪狀病毒按重量比1-10 1-10 1-10的比例混合，然后加入十二烷基硫酸鈉， 調(diào)整濃度為1. 8-2. 5%，裂解30分鐘，即分別得到牛傳染性胃腸炎病毒、牛流行性腹瀉病 毒、以及牛輪狀病毒組合的病毒裂解液；b.制備病毒復(fù)合抗原，將牛傳染性胃腸炎病毒、牛流行性腹瀉病毒以及牛輪狀病毒以三者組合的病毒裂解液 的比例以重量比1-10 1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，OOOrpm高速勻 化，形成油包水乳液，即制得牛腸道病毒復(fù)合抗原；禽用復(fù)合抗原制備脂蛋白磷脂酶A2和禽腸道致病菌復(fù)合抗原a.制作禽腸道致病細(xì)菌抗原成份，按照禽大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌三種標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)特性和培養(yǎng)條件，分 別選擇適宜的培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、分裝；b.超聲粉碎增加抗原性，將所培養(yǎng)好的禽大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌三種禽腸道致病菌按重量比 1-10 1-10 1-10的比例混合，然后加以超聲粉碎，得到禽腸道致病菌菌體成份；C.抗原制作，將所制得的禽腸道致病菌菌體成份混合液與前述采用基因重組技術(shù)制成的脂蛋白磷 脂酶A2表達(dá)蛋白保存液按重量比1-10 10-1的比例混合均勻，得到復(fù)合蛋白液；再將這種復(fù)合蛋白液按重量比1-10 10-1的比例加入福氏佐劑，然后置入高速勻漿機(jī)中，以 30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，則制得脂蛋白磷脂酶A2和禽腸道致病菌復(fù)合 抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體化的抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù) 合IgY的制備方法和權(quán)利要求4所述的納米脂質(zhì)體化的抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性 復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于權(quán)利要求1所述步驟(4)中復(fù)合IgY的制備方式分別 為A.按權(quán)利要求1所述步驟(3)、(4)的方法制備抗脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道致病菌特 異性復(fù)合IgY以及抗豬腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10-1的比例 與抗豬腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗脂蛋白磷脂酶A2和豬腸道病原體特異 性復(fù)合IgY ；B.按權(quán)利要求1所述步驟(3)、(4)的方法制備抗脂蛋白磷脂酶A2和水生動物腸道致 病菌特異性復(fù)合IgY以及抗水生動物腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗脂蛋白磷脂酶A2和水生動物腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10-1 的比例與抗水生動物腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗脂蛋白磷脂酶A2和水生 動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY ；C.按權(quán)利要求1所述步驟(3)、(4)的方法制備抗脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道病原體特 異性復(fù)合IgY以及抗牛腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10-1的比例 與抗牛腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗脂蛋白磷脂酶A2和牛腸道病原體特異 性復(fù)合IgY ；D.按權(quán)利要求1所述步驟(3)、(4)的方法制備抗脂蛋白磷脂酶A2和禽腸道致病菌特 異性復(fù)合IgY。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米脂質(zhì)體化的抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY 的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中復(fù)合IgY的制備方式分別為A.按權(quán)利要求4所述步驟(3)、(4)的方法制備抗磷脂酶A2和豬腸道致病菌特異性復(fù) 合IgY以及抗豬腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗磷脂酶A2和豬腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10-1的比例與抗豬 腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗磷脂酶A2和豬腸道病原體特異性復(fù)合IgY ；B按權(quán)利要求4所述步驟(3)、(4)的方法制備抗磷脂酶A2和水生動物腸道致病菌特 異性復(fù)合IgY以及抗水生動物腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗磷脂酶A2和水生動物腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10-1的比例 與抗水生動物腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗磷脂酶A2和水生動物腸道病原 體特異性復(fù)合IgY ；C.按權(quán)利要求4所述步驟(3)、(4)的方法制備抗磷脂酶A2和牛腸道病原體特異性復(fù) 合IgY以及抗牛腸道病毒特異性復(fù)合IgY ；把抗磷脂酶A2和牛腸道致病菌特異性復(fù)合IgY按重量比1-10 10-1的比例與抗牛 腸道病毒特異性復(fù)合IgY混合均勻，即得到抗磷脂酶A2和牛腸道病原體特異性復(fù)合IgY ；D.按權(quán)利要求4所述步驟(3)、(4)的方法制備抗磷脂酶A2和禽腸道致病菌特異性復(fù) 合 IgY。
11.抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特異性IgY 包括抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY、 抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗磷脂酶A2特異性IgY在飼料添加劑上的 應(yīng)用，其特征在于將抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY或抗磷脂酶A2特異性IgY或任意一種 抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY或抗磷脂酶A2和畜禽水生 動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY(包括納米脂質(zhì)體化IgY和普通IgY)配以氨基酸粉或工業(yè) 葡萄糖或其它輔料或者溶劑，制成相應(yīng)的家畜、家禽或水生動物用飼料添加劑或者水劑。
12.抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特異性IgY 包括抗脂蛋白磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY、 抗磷脂酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗磷脂酶A2特異性IgY在飼料上的應(yīng)用， 其特征在于將抗脂蛋白磷脂酶A2特異性IgY或抗磷脂酶A2特異性IgY或任意一種抗脂 蛋白磷脂酶A2和畜禽水生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY或抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水 生動物腸道病原體特異性復(fù)合IgY(包括納米脂質(zhì)體化IgY和普通IgY)配以玉米蛋白粉或 小麥粉或其它輔料或者溶劑，制成相應(yīng)的家畜、家禽或水生動物用飼料或者水生動物專用 浸浴劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米脂質(zhì)體化抗蛇毒活性酶A2(含脂蛋白磷脂酶A2、磷脂酶A2)和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗蛇毒活性酶A2(含脂蛋白磷脂酶A2、磷脂酶A2)特異性IgY的制備方法，包括以下步驟(1)采用基因工程技術(shù)重組脂蛋白磷脂酶A2和磷脂酶A2表達(dá)蛋白，(2)制備畜禽水生動物腸道主要病原體復(fù)合抗原，(3)制備抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特異性IgY，(4)制備抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生物腸道病原體特異性復(fù)合IgY粗品；(5)抗蛇毒活性酶A2和腸道病原體特異性復(fù)合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特異性IgY納米化和脂質(zhì)體化。以這種特異性復(fù)合IgY或IgY制成的畜禽水生動物用飼料或飼料添加劑，可增強(qiáng)動物腸道健康，抑制會影響營養(yǎng)吸收的特殊磷脂酶，改善飼料轉(zhuǎn)化效率。
文檔編號C07K16/02GK101948542SQ20101027886
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者包晟, 張善鈞, 楊榮鑒, 汪鈴 申請人:深圳雅臣生物科技有限公司