專利名稱：抗結(jié)核桿菌cfp-10單克隆抗體tbcd6及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白IO(CFP-IO)的單 克隆抗體的制備及應(yīng)用，是利用細(xì)胞工程、抗體工程技術(shù)，獲得分泌抗CFP-10的單克隆抗 體的雜交瘤細(xì)胞系，通過(guò)同品系的小鼠誘導(dǎo)腹水，制備抗CFP-10的單克隆抗體TBCD6，鑒定 為IgM、κ型，再通過(guò)親和純化、電泳、免疫等技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)該抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核早期診斷技術(shù)是一直困擾醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的一個(gè)重要難題。20世紀(jì)，因抗生素 研究的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，人類曾成功地控制了結(jié)核病。但是，由于抗藥性不斷出現(xiàn)與積累， 結(jié)核分枝桿菌對(duì)于21世紀(jì)的人類依然是一個(gè)現(xiàn)實(shí)威脅。更嚴(yán)重的是，近年來(lái)，全球人類免 疫缺陷病毒(HIV)和艾滋病(AIDS)的流行已成為全球結(jié)核病發(fā)病率及死亡率第三次回升 的主要原因，同時(shí)結(jié)核病也是AIDS病人最常見的機(jī)會(huì)感染和致死病因。結(jié)核病和艾滋病并 發(fā)的趨勢(shì)，使得治療難上加難。診斷是治療的前提，如果能夠早期診斷，結(jié)核病的危害會(huì)大 幅度減小。中國(guó)作為結(jié)核菌高感染率地區(qū)和HIV感染的快速增長(zhǎng)地區(qū)，提高結(jié)核病及HIV/ AIDS合并結(jié)核感染的早期準(zhǔn)確診斷水平刻不容緩。傳統(tǒng)的早期診斷手段是結(jié)核菌素皮試。這是基于遲發(fā)型超敏反應(yīng)原理的一種皮膚 試驗(yàn)。但是兩個(gè)缺陷使得這種診斷方法的意義非常有限。其一該方法不能區(qū)分曾經(jīng)感染 過(guò)結(jié)核桿菌的健康者與結(jié)核桿菌正在活動(dòng)的發(fā)病者；其二 該方法不能區(qū)分結(jié)核桿菌的感 染者與卡介苗的注射者。所以，傳統(tǒng)的早期診斷方法只能提供非常有限的參考信息，確診往 往要等到病人出現(xiàn)結(jié)核病灶之后。而這時(shí)候再做治療已經(jīng)晚了，特別是對(duì)耐藥結(jié)核桿菌，病 人預(yù)后很差。ELISP0T技術(shù)帶來(lái)了結(jié)核病早期診斷的革命。其一，由于ELISP0T方法采用結(jié)核 分枝桿菌特異性的多肽，可以避免卡介苗注射者的交叉反應(yīng)；其二，由于ELISP0T檢測(cè)的 是病人當(dāng)時(shí)的細(xì)胞免疫水平，可以有效區(qū)別健康的TB攜菌者與發(fā)病的TB活動(dòng)病人。但是 ELISP0T檢測(cè)步驟繁瑣，需要特殊儀器設(shè)備且試劑昂貴，在多數(shù)低收入的結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家和 地區(qū)較難推廣。發(fā)展一種快速、靈敏的結(jié)核早期診斷方法已迫在眉睫?；谝陨媳尘埃卷?xiàng)目選定 目前公認(rèn)的結(jié)核分枝桿菌特異抗原蛋白CFP-10為靶抗原，利用現(xiàn)代生物信息學(xué)和分子生 物學(xué)技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成幾段候選的CFP-10特異的抗原肽序列，采用融合雜交瘤技術(shù)建立穩(wěn) 定分泌抗結(jié)核分枝桿菌特異抗原蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，并大量制備、純化和鑒 定這些單克隆抗體。該單克隆抗體的成功獲得，為建立新型的結(jié)核病診斷方法——基于免 疫學(xué)技術(shù)的診斷奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理、診斷、預(yù)后及療效判定等方面的研究 起到重要作用。本發(fā)明用到雜交瘤細(xì)胞技術(shù)。該技術(shù)將免疫小鼠的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融 合，以建立分泌均質(zhì)抗體的雜交瘤細(xì)胞系，也稱為單克隆抗體技術(shù)。該技術(shù)涉及到動(dòng)物免 疫、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞克隆培養(yǎng)和免疫測(cè)定等一系列方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白IO(CFP-IO)的單克隆抗 體，具有SEQ No. 1 的氨基酸序列Gly Asp Leu Lys Thr Gln lie Asp GlnVal Glu Ser Thr Ala0該單克隆抗體亞型為IgM、κ型，命名為TBCD6，能特異性識(shí)別結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液 蛋白IO(CFP-IO)的aa 23_36⑶LKTQIDQVESTA抗原肽序列?？菇Y(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白 IO(CFP-IO)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞已由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏；地址中國(guó)武漢武 漢大學(xué)；保藏日期2010年8月17日；保藏編號(hào)為CCTCC NO. C201082。本發(fā)明的第二個(gè)目的提供抗CFP-10單克隆抗體的制備方法，通過(guò)以下步驟和技 術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)動(dòng)物的免疫選擇6周齡的BALB/C小鼠，以抗原肽(CFP-10的第23_36位氨 基酸，14肽⑶LKTQIDQVESTA)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。14肽⑶LKTQIDQVESTA通過(guò)固相法合成，在 美國(guó)ABI公司的多肽合成儀(431A)上進(jìn)行，采用Fmoc (9-芴甲氧羰基)方案，合成步驟按 照ABI公司的多肽合成操作手冊(cè)進(jìn)行。經(jīng)高效液相色譜純化，純度> 95%，序列鑒定通過(guò)質(zhì) 譜分析。(2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0并使之保持良好的生長(zhǎng) 狀態(tài)用于細(xì)胞融合。(3)細(xì)胞融合采用聚乙二醇融合法。以BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞， 在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，含20 % FCS的HAT培養(yǎng)基培 養(yǎng)一天，取(1)中小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞和(2)中的小鼠骨髓瘤細(xì)胞，將上述兩種細(xì)胞混合離 心，然后以聚乙二醇(PEG 6000)介導(dǎo)細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，接種至飼養(yǎng)細(xì)胞 培養(yǎng)板，適當(dāng)條件培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞的篩選將上述培養(yǎng)物在HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在細(xì)胞集落 長(zhǎng)到大小合適時(shí)，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液做抗體鑒定，篩選陽(yáng)性克隆。(5)雜交瘤細(xì)胞的克隆化以有限稀釋法克隆雜交瘤細(xì)胞，將稀釋到一定密度的 細(xì)胞接種至96孔板，使每孔只有一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)。形成細(xì)胞集落的孔取培養(yǎng)上清液做酶聯(lián)免 疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，鑒定陽(yáng)性克隆。重復(fù)有限稀釋克隆若干次，直到雜交瘤細(xì)胞的陽(yáng)性孔 率達(dá)到100%。將克隆化后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)做抗體鑒定及理化性狀分析。(6)單抗腹水的誘導(dǎo)在接種雜交瘤細(xì)胞前一周，給BALB/C小鼠腹腔注射降植烷 每只0. 5ml，然后每只接種5X IO6陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，10天后收集腹水離心，測(cè)定抗體效價(jià)， 并純化單克隆抗體。(7)單克隆抗體的純化利用Protein L親和純化法純化腹水中的單克隆抗體。(8)本發(fā)明得到一個(gè)產(chǎn)生抗CFP-10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，即TB⑶6，TB⑶6 雜交瘤細(xì)胞系經(jīng)3次克隆化，持續(xù)培養(yǎng)六月余，分泌抗體穩(wěn)定。該細(xì)胞株經(jīng)液氮凍存，復(fù) 蘇后生長(zhǎng)良好，抗體分泌未見衰退。ELISA間接法測(cè)得TB⑶6培養(yǎng)上清效價(jià)為1 256， 腹水效價(jià)分別為1 16384。經(jīng)單克隆抗體免疫球蛋白亞型分析顯示該雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生 的抗體類型為IgM。TB⑶6已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號(hào)是=CCTCC No.C201082。本發(fā)明提供產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，它是由免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0經(jīng)融合、篩選、克隆、傳代和反復(fù)凍存、復(fù)蘇后獲得的小鼠雜交瘤細(xì) 胞系TB⑶6，能穩(wěn)定分泌抗CFP-10的單克隆抗體TB⑶6。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該單克隆抗體TBCD6在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白 10檢測(cè)和樣本中的CFP-10蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定性和定量中的應(yīng)用，通過(guò)下述途徑實(shí)現(xiàn)①以單克隆抗體TB⑶6為探針，用SDS-PAGE電泳通過(guò)免疫印跡方法(Western Blot)方法，對(duì)結(jié)核桿菌及其培養(yǎng)物、各種體液樣本、基因重組及人工合成樣本中的CFP-10 蛋白的情況進(jìn)行鑒定。②以單克隆抗體TBCD6為結(jié)合抗體，用免疫沉淀方法來(lái)鑒定上①所述試驗(yàn)樣本中 CFP-10的表達(dá)。③以單克隆抗體TB⑶6作為包被抗體或檢測(cè)抗體，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)對(duì)結(jié)核桿菌培養(yǎng)物、各種體液樣本、基因重組及人工合成樣本中的CFP-10蛋白的 表達(dá)水平進(jìn)行定性和定量分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供了一種抗結(jié)核分枝桿菌特異抗原CFP-10的單克隆抗體， 尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。制備方法簡(jiǎn)單易行，更為重要的是該方法制備的單克隆抗體可以有多種 用途，如對(duì)臨床和實(shí)驗(yàn)室的結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌培養(yǎng)物、結(jié)核分枝桿菌、臨床體液樣本、基 因重組蛋白中CFP-10分子表達(dá)情況進(jìn)行定性和定量分析，以及各種研究用途。說(shuō)明書附1為單克隆抗體TB⑶6的免疫球蛋白亞型分析。圖2采用免疫沉淀和western-blot方法檢測(cè)重組ESAT-6/CFP-10融合蛋白、結(jié)核 分枝桿菌和其它分枝桿菌及其培養(yǎng)上清液等樣本中CFP-10蛋白的表達(dá)。圖3用單抗作為包被抗體，重組ESAT-6/CFP-10融合蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原的酶聯(lián)免 疫吸附試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1.抗CFP-10的單克隆抗體的制備方法(1)小鼠的免疫首次免疫，將交聯(lián)KLH的CFP-10的14肽(序列 aa23-36⑶LKTQIDQVESTA)以弗氏完全佐劑乳化，第2、3次以不完全佐劑乳化，每BALB/C小 鼠0. 2ml (含CFP-10抗原肽200 μ g)，背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，每?jī)芍芤淮巍?周后加強(qiáng)免疫一 次，于3天后進(jìn)行細(xì)胞融合。(2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的培養(yǎng)把來(lái)自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株以 含10% FBS-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，在含5% CO2飽和濕度的37°C孵箱中培養(yǎng)。融合前一天 傳代以保證融合時(shí)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。(3)細(xì)胞融合以BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，在融合前一天，接種 BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，含20 % FCS的HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)一天，次日取脾臟， 置200目不銹鋼篩網(wǎng)中，剔除脂肪和結(jié)締組織，撕開包膜，分離脾細(xì)胞，離心洗滌細(xì)胞1 2次后用培養(yǎng)液重懸。收集小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，離心，洗滌2次后用培養(yǎng)液重懸，作為 待融合的SP2/0細(xì)胞。以1. OX IO8個(gè)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞與1. OX IO7個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0混合，在50% PEG6000作用下融合。兩種細(xì)胞混合后洗滌一次，離心棄上清，輕彈管 壁懸開細(xì)胞(勿加液體)用37°C預(yù)溫的50% PEG6000(pH 8. 0) 0. 8ml于60 90秒內(nèi)逐滴 加入細(xì)胞沉淀中，其間輕輕振搖離心管，但勿吹打，靜置1分鐘，然后按先慢后快的原則，于 第1分鐘內(nèi)加完Iml無(wú)血清RPMI 1640，于第2分鐘內(nèi)加完2ml無(wú)血清RPMI 1640，于第3 分鐘內(nèi)加完7ml無(wú)血清RPMI 1640，以后1分鐘內(nèi)逐漸加入37°C預(yù)溫的無(wú)血清RPMI1640培 養(yǎng)基30 40ml。800轉(zhuǎn)/分鐘低速離心5 10分鐘。然后加入20% FCS HAT培養(yǎng)基，分 別接種到加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，一般每次融合的細(xì)胞鋪4塊板，置37°C 5% 0)2孵 才苜中培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞的篩選每隔4天換1/2培養(yǎng)液(HAT) —次，10天后改用含HT培 養(yǎng)液。融合后的雜交瘤細(xì)胞在含HT的選擇性培養(yǎng)液中大約持續(xù)培養(yǎng)兩周。在細(xì)胞集落長(zhǎng) 到適當(dāng)大小時(shí)(在10倍物鏡下觀察，細(xì)胞克隆大小以占滿一個(gè)視野為宜)，吸取培養(yǎng)液上 清，適當(dāng)稀釋后做ELISA，篩選陽(yáng)性克隆。采用ELISA間接法篩選陽(yáng)性雜交瘤克隆。主要步 驟①0. OlM pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋ESAT-6/CFP-10重組融合蛋白，以及合成的CFP-10 特異多肽，濃度200ng/ml，分別于96孔酶標(biāo)板加入0. Iml/孔包板，4 °C過(guò)夜；②0. 0IM pH7. 4PBS-Tween 20洗板三次；③用2% BSA-0. OlM pH 7. 2的PBS封閉1小時(shí)；④同上洗 板；⑤加入1 5稀釋的雜交瘤培養(yǎng)上清，0.1ml/孔，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(免疫小鼠的血清)、 陰性對(duì)照(SP2/0培養(yǎng)上清液)和空白對(duì)照，室溫反應(yīng)2小時(shí)；⑥洗板；⑦加1 5000稀釋 的羊抗小鼠Ig(G+M)-HRP，0. Iml/孔，室溫反應(yīng)1小時(shí)；⑧洗板；⑨加入底物(TMB)室溫避光 反應(yīng)5 10分鐘；⑩2M H2S04終止反應(yīng)；450nm測(cè)定其OD值，以P/N彡2. 1為陽(yáng)性。(5)雜交瘤細(xì)胞的克隆化雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)按有限稀釋法進(jìn)行，選擇抗 體檢測(cè)陽(yáng)性(ESAT-6/CFP-10重組融合蛋白和合成的CFP-10特異多肽均陽(yáng)性)的雜交瘤孔 細(xì)胞作適當(dāng)增殖后，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞。用完全1640培養(yǎng)基稀釋成10個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種 到已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0. 1ml，7-10天后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并檢測(cè)上清 液中抗體水平，選擇5個(gè)抗體滴度最高的，呈單個(gè)克隆細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，作再次克隆化培 養(yǎng)。此方法可重復(fù)多次，直至單克隆孔抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為100%。(6)誘生腹水在接種雜交瘤細(xì)胞前一周，給BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只 0. 5ml，然后每只接種5. OX IO6陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，10天后收集腹水測(cè)定抗體效價(jià)。(7)單克隆抗體的純化采用親和純化法(Protein G交聯(lián)的S印harose)純化腹水 中單克隆抗體。①腹水用冷Binding Buffer (結(jié)合緩沖液)稀釋3倍后，于4°C IOOOOrpm 離心15分鐘去除沉淀物。②將預(yù)裝有S印harose-Protein L的親和純化柱用10倍柱床體 積的Binding Buffer充分流洗。③將稀釋的腹水上柱，控制流速8 10滴/分鐘。④將 流穿的腹水重復(fù)上柱一次。⑤用20倍柱床體積的Binding Buffer充分洗滌，直至流穿液 A280吸光值小于0.01。⑥用Elution Buffer (洗脫緩沖液)洗脫結(jié)合的單克隆抗體，控制 流速8 10滴/分鐘，收集洗脫液于預(yù)加有0. Iml的磷酸鉀緩沖液(PH7.9，0.5M)的收集 管中，每管收集0. 5ml含抗體的洗脫液，共收集20管以上。⑦于A280nm檢測(cè)每管洗脫液 的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脫液。⑧將收集的洗脫液置于透析卡中，并于0. IM PH7.0的PBS中透析。每隔6小時(shí)換液一次，共透析24小時(shí)。⑨將透析后的抗體溶液稀釋 (1 100)后，于280nm測(cè)蛋白含量。⑩將純化的抗體分裝于小管中，置于低溫冰箱備用。(8)單克隆抗體的亞型鑒定采用Serotec公司的小鼠單克隆抗體免疫球蛋白分型試劑盒分析。將純化的單抗作適當(dāng)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。試 驗(yàn)結(jié)果為TBCD6雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體為IgM、κ型，具有SEQ No. 1的氨基酸序 列Gly Asp Leu Lys Thr Gln lie Asp Gln Val GluSer Thr Ala。該單克隆抗體亞型 為IgM、κ型，命名為TB⑶6，能特異性識(shí)別結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白IO(CFP-IO)的aa 23-36⑶LKTQIDQVESTA抗原肽序列。抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白IO(CFP-IO)單克隆抗 體雜交瘤細(xì)胞已由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏；地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)；保藏日期 2010 年 8 月 17 日；保藏編號(hào)為=CCTCC NO. C201082。結(jié)果參見附

圖1。實(shí)施例2.用該單克隆抗體進(jìn)行CFP-10的鑒定(定性)檢測(cè)本發(fā)明制備的抗CFP-10單克隆抗體可以用來(lái)鑒定的(定性檢測(cè))，鑒定方法可以 通過(guò)下述兩種方法實(shí)現(xiàn)1.免疫印跡法 Western Blotting 重組 CFP-10 和 ESAT-6/CFP-10 融合蛋白以及 結(jié)核分枝桿菌全蛋白裂解液用該單抗進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)，在相應(yīng)位置呈現(xiàn)目的條 帶，表明檢測(cè)到CFP-10蛋白的表達(dá)。具體步驟(I)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》 (科學(xué)出版社1998)。采用15%分離膠和5%濃縮膠，電泳條件為電壓150V，溴酚藍(lán)染料帶 距離膠底邊1. 5厘米左右終止電泳。(2)電轉(zhuǎn)移方法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社 1998)。用電轉(zhuǎn)移方式將其轉(zhuǎn)移至PVDF (0.22 μ m)膜上。(3)免疫印跡電轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，膜在5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1小時(shí)后，用本 發(fā)明制備的單抗TB⑶6作為一抗，室溫孵育2小時(shí)或4°C反應(yīng)過(guò)夜，用TBST (TBS加入0. 5% Tween-20)洗滌3次，每次lOmin。以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgM作為二抗，室溫反 應(yīng)2h，用上述方法洗滌后用ECL作用lmin，于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad VersaDoc 5000MP)曝光成像。2.免疫沉淀法(IP)將重組CFP-10和ESAT_6/CFP_10融合蛋白、結(jié)核分枝桿菌全 蛋白裂解液、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清液、臨床結(jié)核病人結(jié)核性胸水與該單抗進(jìn)行免疫沉淀 反應(yīng)，后經(jīng)western-blot檢測(cè)，在相應(yīng)位置呈現(xiàn)目的條帶，表明檢測(cè)到CFP-10蛋白的表達(dá)。 具體步驟①取Iug的重組蛋白或IOOug結(jié)核分枝桿菌裂解蛋白，500ul結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上 清液或臨床結(jié)核病人結(jié)核性胸水加純化的Iug抗CFP-10單克隆抗體TBCD6，4°C緩慢搖動(dòng)2 小時(shí)；再加入20微升充分重懸的Protein L Agarose，4°C緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。②2500rpm離心5分鐘，小心吸除上清，注意不能吸掉Protein L Agarose。③用0.5-1毫升TBST洗滌沉淀5次。④完成最后一次洗滌后，去除上清，加入40微升IX SDS-PAGE電泳上樣緩沖液重 懸沉淀，瞬時(shí)高速離心把樣品離心至管底。⑤100°C或沸水浴處理3-5分鐘，取部分樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時(shí)不用的樣 品-20°C保存。⑥電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。⑦轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置于5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1小時(shí)。
⑧加兔抗CFP-10多抗，室溫反應(yīng)2小時(shí)。⑨洗膜4次后加抗兔IgG-HRP，室溫反應(yīng)1小時(shí)。⑩洗膜4次后ECL顯色，VersaDoc 5000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀曝光成像。結(jié)果參見附圖2，其中M 蛋白分子量Marker ；1 重組ESAT-6/CFP-10融合蛋白；2 重組CFP-10蛋白；3，4 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清；5 結(jié)核性胸水；6 鳥胞內(nèi)分枝桿菌裂解蛋 白-J 堪薩斯分枝桿菌裂解蛋白；8 結(jié)核分枝桿菌裂解蛋白。實(shí)施例3、用該單克隆抗體進(jìn)行CFP-10分子的定量檢測(cè)本發(fā)明制備的抗CFP-10單克隆抗體可以用來(lái)定量檢測(cè)重組CFP-10和ESAT-6/CFP 一 10融合蛋白、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清液、各種臨床體液樣本中結(jié)核特異抗原CFP-10水 平，檢測(cè)方法可以通過(guò)下述兩種方法實(shí)現(xiàn)1.間接 ELISA 法:①將檢測(cè)樣本適當(dāng)稀釋于0. OlM pH9. 6碳酸鹽緩沖液包被液中，同時(shí)將重組的 CFP-10和ESAT-6/CFP-10融合蛋白適當(dāng)系列濃度稀釋在包被液中，作為定量標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。 在對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)板孔中加入上述各待測(cè)樣本和系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品lOOul，室溫孵育2h或4°C 包被過(guò)夜。②倒空液體并拍干殘留液體，用0. OlM pH7. 4PBS-Tween 20洗液洗板三次。③用2% BSA-0. OlM pH 7. 2 的 PBS 封閉 1 小時(shí)。④同上洗板3次。⑤加入適當(dāng)稀釋的該單克隆抗體TB⑶6，0. Iml/孔，室溫反應(yīng)2小時(shí)。⑥同上洗板3次后，加羊抗小鼠IgM-HRP，0. Iml/孔，室溫反應(yīng)1小時(shí)。⑦用洗滌液浸泡板5min后，同上洗板4次后，加入底物(TMB)室溫避光反應(yīng)5 10分鐘。⑧2M H2S04終止反應(yīng)，450nm測(cè)定其OD值。⑨繪制標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求的待測(cè)樣本中CFP-10的表達(dá)水平。2.夾心 ELISA 法①包被用包被緩沖液將另一 CFP-10單克隆抗體TBCA6 (IgGl型)稀釋至lug/mL。 在酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加0. ImL/孔，4°C過(guò)夜。次日棄去孔內(nèi)溶液，用0. OlM pH7. 4PBS-Tween 20洗滌緩沖液洗板3次，每次3min。②封閉用2% BSA-0. OlM pH 7. 2的PBS室溫封閉1小時(shí)。③加樣加適當(dāng)稀釋的待檢樣品和系列濃度稀釋的重組CFP-10標(biāo)準(zhǔn)品0. ImL/孔 于上述已包被的反應(yīng)孔中，置濕盒中室溫反應(yīng)2小時(shí)。④洗板用洗滌緩沖液洗板3次，每次3min。⑤加二抗加入適當(dāng)稀釋的該單克隆抗體TB⑶6 (IgM型，針對(duì)CFP-10不同靶位) 或兔抗CFP-10多抗，0. Iml/孔，室溫反應(yīng)2小時(shí)。⑥加酶聯(lián)物同上洗板3次后，加羊抗小鼠IgM-HRP或抗兔IgG-HRP，0. Iml/孔，室 溫反應(yīng)1小時(shí)。⑦顯色同上洗板4次后，加入底物(TMB)室溫避光反應(yīng)5 10分鐘。⑧終止、讀板2M H2S04終止反應(yīng)，450nm測(cè)定其OD值。⑨標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程式，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線求的待測(cè)樣本中CFP-10的表達(dá)含量。結(jié)果參見附圖3和表1。表IELISA法檢測(cè)臨床體液樣本中CFP-10的陽(yáng)性率及其在結(jié)核診斷中的應(yīng)用
權(quán)利要求
一種抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10的單克隆抗體TBCD6，該單克隆抗體亞型為IgM、κ型，能與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10特異結(jié)合，由保藏號(hào)為CCTCC NO.C201082的雜交瘤產(chǎn)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10的單克隆抗體TBCD6的 制備方法，其特征在于該單克隆抗體通過(guò)的以下步驟獲得(1)小鼠免疫選擇6周齡的BALB/C小鼠，以特異的抗原肽即結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液 蛋白10基因的第23-36位氨基酸，14肽⑶LKTQIDQVESTA對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，每2周一次，共 3次；第四次加強(qiáng)免疫3天后用于融合；(2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0并使其保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài) 用于雜交瘤細(xì)胞融合；(3)細(xì)胞融合采用聚乙二醇細(xì)胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞， 在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，含20 % FCS的HAT培養(yǎng)基培 養(yǎng)一天，將步驟(1)免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞和步驟(2)小鼠的骨髓瘤細(xì)胞混合離心，然后 以聚乙二醇介導(dǎo)細(xì)胞融合，稀釋融合后的細(xì)胞，接種至培養(yǎng)板培養(yǎng)；(4)雜交瘤細(xì)胞的篩選將上述培養(yǎng)物在含HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在細(xì)胞集落長(zhǎng)到 大小合適時(shí)，吸取培養(yǎng)上清液以酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法做抗體鑒定，篩選陽(yáng)性克?。?5)雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)以有限稀釋法克隆陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞，將稀釋的細(xì)胞 接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使每孔只有一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)，形成細(xì)胞集落的孔取上清做酶聯(lián)免疫 吸附檢測(cè)，篩選和鑒定陽(yáng)性克隆，重復(fù)克隆若干次，直到雜交瘤細(xì)胞的陽(yáng)性孔率達(dá)到100%， 將克隆化后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并做抗體理化性狀分析和鑒定；(6)小鼠腹水的誘生給每只8々1^/(小鼠接種5乂106陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，收集腹水離心， 測(cè)定抗體效價(jià)，并純化腹水中的單克隆抗體；(7)單克隆抗體的純化利用ProteinL親和純化法純化腹水中的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10的單克隆抗體TBCD6在結(jié) 核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10檢測(cè)中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10的單克隆抗體TBCD6在結(jié) 核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征是通過(guò)抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、 免疫印跡法和免疫沉淀的方法檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)物以及各種體液樣本中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾 液蛋白10的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10的單克隆抗體TBCD6在結(jié) 核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10定量分析中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10的單克隆抗體TBCD6在 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10定量分析中的應(yīng)用，其特征是通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方 法對(duì)在細(xì)菌培養(yǎng)物及體液樣本中的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10表達(dá)水平進(jìn)行定性和定 量。
全文摘要
本發(fā)明提供抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10的單克隆抗體TBCD6，經(jīng)特異的抗原肽免疫小鼠，收集致敏的小鼠B淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫印跡檢測(cè)法判定陽(yáng)性克隆，建立分泌抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系TBCD6，把陽(yáng)性的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)并注射至同品系的小鼠腹腔誘導(dǎo)產(chǎn)生含抗體的腹水，經(jīng)過(guò)收集與抗體親和純化，獲得抗結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10的單克隆抗體。本發(fā)明提供的單克隆抗體在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10檢測(cè)及定量分析中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/12GK101985472SQ20101050468
公開日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者盧洪洲, 姚航平 申請(qǐng)人:浙江大學(xué);上海市公共衛(wèi)生臨床中心