專利名稱：一種alpha螺旋狀陽離子多肽分子及其制法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及生物醫(yī)用高分子材料及其應用領域，具體涉及一種alpha螺旋狀 陽離子多肽分子及其制法和應用。
背景技術：
基因治療自1989年首次進入臨床試驗，至今已有二十余年，它為很多疾病(尤 其是癌癥)提供了一種新的治療方法?；蛑委煴仨氁幸粋€能將目的基因導入機體細 胞的載體系統(tǒng)?；蛑委熢谂R床的成功應用與否，其技術瓶頸是能否開發(fā)出一個安全 而高效的基因藥物傳遞系統(tǒng)(International Journal of Pharmaceutics，2001，229 1-21 ； Nature Biotechnology, 2000，18: 33-37 ； Gene Therapy, 2005，12: 1734-1751)。 目 前，常用于基因傳輸?shù)妮d體系統(tǒng)包括兩類病毒性載體和非病毒性載體。前者具有較高 的基因表達效率，但存在安全性和免疫原性等風險，1999年，美國曾出現(xiàn)第一例采用病 毒性載體基因治療死亡的病例(Genetherapy，2003，10: 1135-1141)。盡管非病毒性載 體對基因的表達效率較病毒性載體低，但非病毒性基因載體具有毒性低、低免疫原性以 及易于規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，在基因治療應用中備受矚目。近年來，關于非病毒性基因載體，報道了陽離子聚合物、接枝共聚物、脂質體 以及陽離子多肽等作為基因的載體，也具有較高的基因表達效率(Journal of Controlled Release, 2004，94 1-14 ； Nature Materials, 2006，5 439-451)。如聚乙烯亞胺 (polyethylenimine, PEI)中的伯胺可用來與DNA結合，而仲胺和叔胺可用于內涵體釋 放DNA，因此，其基因表達效率高，被認為是目前非病毒基因載體的標準。但PEI毒 性大，因此，難以推廣應用。多肽作為基因載體，由于其生物相容性高，近年來備受關 注。如組氨酸(Biochimica EtBiophysica Acta-Biomembranes，2006，1758 301-307)、 賴氨酸(Biochemical and BiophysicalResearch Communications, 2007, 357 511-516) 和精氨酸(Bioconjugate Chemistry, 2001，12: 1005-1011 ； Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research, 2003，1640 129-136)構成的多肽均可用作為基因的載 體。在多肽作為基因載體的設計中，賴氨酸與組氨酸用來與DNA結合，而組氨酸可 用來內涵體釋放DNA。多肽序列中還可引入半胱氨酸，在多肽/DNA復合體中，半 胱氨酸中的二硫鍵可發(fā)生發(fā)生交聯(lián)反應，有效增加復合體穩(wěn)定性。此外，Niidome等 (Biomaterials，2000, 21: 1811-1819)設計了兩親性陽離子多肽KALA作基因載體， 該多肽分子可以形成alpha螺旋結構，能有效穿過細胞膜提高基因表達效率。專利申 請CN101235384A公布了一種新型非病毒陽離子型基因載體的制備方法；專利申請 CN1844170A公布了一種溫敏聚異丙基丙烯酰胺-聚賴氨酸綴合物轉基因載體的制備； 專利申請CN1462763A公布了多聚賴氨酸淀粉納米顆粒與制備方法及作為基因載體的應 用；專利申請US7112442和US6387700公布了由色氨酸、半胱氨酸和賴氨酸組成的多肽 作為基因的載體材料。盡管基因載體材料的研究備受關注，也取得一些進展，但仍有很 多問題有待解決。迫切需要設計和開發(fā)出一種合成方法簡單、基因表達效率高、毒性小的基因載體。

發(fā)明內容
理想的基因傳輸系統(tǒng)應需滿足以下條件能有效與DNA結合，形成穩(wěn)定的載體 /DNA復合體；能有效與細胞膜相互作用，高效地穿透細胞膜，將基因傳送到細胞內； 內涵體中能高效地將DNA釋放；載體材料對人體無毒或毒性很小。為達到上述目的，本 發(fā)明提出一種新型alpha螺旋狀陽離子多肽分子及其用于基因傳輸。本發(fā)明采用的技術方案是設計一種具有alpha螺旋狀陽離子多肽分子作為基因載 體材料。alpha螺旋結構的穿透細胞能力，組氨酸有利于內涵體釋放基因，賴氨酸或精氨 酸提供正電荷與DNA結合形成復合體，靶向基團則向腫瘤部位定向傳輸基因。
權利要求
1.一種alpha螺旋狀陽離子多肽分子，其特征在于，結構通式為
2.—種alpha螺旋狀陽離子多肽分子，其特征在于，結構通式為
3.權利要求1所述的一種alpha螺旋狀陽離子多肽分子的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟(1)合成單體多肽分子，提純；(2)將單體多肽分子溶于水中，濃度為10 200mg/mL；(3)將偶氮二甲酰胺溶于二甲基亞砜中，偶氮二甲酰胺的濃度為0.1 2mg/yL；(4)將多肽的水溶液與偶氮二甲酰胺的二甲基亞砜溶液混合，其中多肽與偶氮二甲酰 胺的摩爾比為1 10 1 100，攪拌1 10天，得到溶液；(5)將步驟(4)得到的溶液用去離子水透析1 5天后，收集透析袋中的產(chǎn)物并冷凍 干燥，得到alpha螺旋狀陽離子多肽分子粗產(chǎn)物；(6)提純粗產(chǎn)物。
4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述透析袋的截斷分子量為500 10000。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種alpha螺旋狀陽離子多肽分子的制備方法，其特征在 于，所述單體多肽分子的結構式為
6.權利要求2所述的一種alpha螺旋狀陽離子多肽分子的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟(1)合成單體多肽分子，提純；(2)將單體多肽分子溶于水中，濃度為10 200mg/mL；(3)將偶氮二甲酰胺溶于二甲基亞砜中，偶氮二甲酰胺的濃度為0.1 2mg/yL;(4)將多肽的水溶液與偶氮二甲酰胺的二甲基亞砜溶液混合，其中多肽與偶氮二甲酰 胺的摩爾比為1 10 1 100，攪拌1 10天，得到溶液；2(5)將步驟(4)得到的溶液用去離子水透析1 5天后，收集透析袋中的產(chǎn)物并冷凍 干燥，得到alpha螺旋狀陽離子多肽分子粗產(chǎn)物；(6)提純粗產(chǎn)物。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種alpha螺旋狀陽離子多肽分子的制備方法，其特征在 于，所述單體多肽分子的結構式為
8.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述透析袋的截斷分子量為500 10000。
9.權利要求1或2所述的一種alpha螺旋狀陽離子多肽分子在基因傳輸中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種alpha螺旋狀陽離子多肽分子及其制法和應用。本發(fā)明多肽分子由alpha螺旋性主鏈與側鏈構成。主鏈由賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、組氨酸構成；側鏈主要由組氨酸、賴氨酸、精氨酸和靶向基團構成。組氨酸有利于內涵體釋放基因，增加基因表達效果；賴氨酸或精氨酸可提供正電荷，與DNA結合形成穩(wěn)定復合體；靶向基團有利于提高基因表達效率。利用本發(fā)明alpha螺旋狀陽離子多肽分子得到的多肽/DNA復合物粒徑大小在100-500nm之間，表面帶正電荷。本發(fā)明具有多肽分子量分布窄、多肽與基因復合方法簡單、穩(wěn)定性和基因表達效率高、毒性低等特點。
文檔編號C07K7/08GK102010461SQ20101050470
公開日2011年4月13日 申請日期2010年10月11日 優(yōu)先權日2010年10月11日
發(fā)明者章莉娟, 郭新東, 錢宇 申請人:華南理工大學