專利名稱：一種保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法。
背景技術(shù)：
霞水母屬刺胞動物門，缽水母綱，旗口水母目，霞水母科，觸須4m_6m，廣泛分布于 我國沿海，尤其夏季會在近海區(qū)域集中出現(xiàn)，給漁業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境以及游泳者都造成了嚴(yán) 重的影響，霞水母觸手上刺絲囊細(xì)胞的毒素能引起被蜇傷者皮疹、瘙癢、水腫、肌肉疼痛、血 壓降低、呼吸困難甚至死亡。霞水母毒素是一類結(jié)構(gòu)新穎的海洋生物蛋白，具有多種生物活 性，如溶血活性、抗氧化活性、心臟血管毒性、肝臟毒性、酶活性和神經(jīng)毒性等，為開發(fā)新型 的海洋藥物提供重要的先導(dǎo)化合物，而如何有效地得到高生物活性的水母毒素是研究其毒 素結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物活性以及對水母毒素進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用的前提。以霞水母毒素的溶血活性為活性指標(biāo)，溶血活性作為一個非常重要的生物活性。 它是指能夠?qū)е录t細(xì)胞破裂并伴隨著釋放出血紅蛋白的現(xiàn)象，而具有溶血活性的物質(zhì)統(tǒng)稱 為溶血素。溶血素主要存在于蜂毒、蛇毒、蜈蚣毒素、水母毒素等動物分泌的毒素中，同時 也存在在于一些細(xì)菌產(chǎn)物中如Escherichia coli的α-hemolysin、Bacillus cereus的 hemolysin BL(HBL) ^P Bordetella pertussis 白勺 FHAhemolysin ·。胃i一@ 蛋白類物質(zhì)，如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerugi. nosa)的磷脂酶C和美人魚發(fā)光桿菌 (Photobacteri. Um damselae)的磷脂酶D，這些磷脂酶通過酶解細(xì)胞膜表面的磷脂分子層 而造成細(xì)胞破裂出現(xiàn)溶血現(xiàn)象；另外還有由一些細(xì)菌產(chǎn)生的，能夠通過在紅細(xì)胞膜上形成 小孔而產(chǎn)生溶血作用的溶血素。因此以溶血活性為活性指示，研究有對霞水母毒素生物活 性的保護(hù)作用具有重要意義。在提取霞水母毒素的過程中，很多細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶也被釋放出來，而蛋白酶的催 化作用具有極高的效率，能夠迅速的造成活性蛋白的降解而使其活性降低甚至喪失。目前 保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法主要集中在向毒素中添加甘油、蔗糖、谷胱甘肽等物質(zhì)來 穩(wěn)定毒素蛋白，雖然能起到一定的作用，但并不能從根本上解決活性蛋白被蛋白酶迅速降 解導(dǎo)致的活性降低這一根本問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為—種保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法在霞水母毒素內(nèi)添加金屬酶抑制劑或酸性 蛋白酶抑制劑，進(jìn)而有效保護(hù)霞水母毒素生物活性。所述在0. 5-5mg/ml的霞水母毒素內(nèi)添加終濃度0. l_20mM的金屬酶抑制劑EDTA 和終濃度2-6 μ g/mL的酸性蛋白酶抑制劑P印Stantin A，進(jìn)而抑制毒素中蛋白酶的溶血活性。所述霞水母毒素按如下步驟進(jìn)行提取
1)將冷凍于-80—20 °C下的霞水母觸角于0-8 °C自溶2_96h，而后以0_8 °C下 5000-30000g離心5-30min，收集沉淀霞水母刺絲囊細(xì)胞，待用；2)將上述每5-50mg的霞水母刺絲囊細(xì)胞內(nèi)加入0. 5_2mL在0_8°C預(yù)冷的10_30mM pH6. 0-8. 0緩沖液，然后在振動頻率2500-5000rpm下破碎l_5min，其中每破碎10_30s將霞 水母刺絲囊細(xì)胞取出置于冰水中冷卻l-5min ；3)將破碎后霞水母刺絲囊細(xì)胞在0-8°C下，5000-30000g離心5_30min，上清液即
為霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素。所述步驟1)中自溶后用20-60目的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去除觸手殘片。所述步驟2)中霞水母刺絲囊破碎時利用Mini-Beadbeater組織研磨器破碎； 所述緩沖液為0-8°C預(yù)冷的10-30mM pH6. 0-7. 0的PBS緩沖液或0_8°C預(yù)冷的10_30mM pH7. 0-8. 0 的 Tris-HCl 緩沖液。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)1、資源非常豐富。本發(fā)明利用了霞水母這種豐富的海洋生物資源，為霞水母這種 低值資源獲得高值化發(fā)展提供了新的途徑。2、提取速度快。本發(fā)明能夠快速的從霞水母體內(nèi)獲取大量的毒素，為其進(jìn)一步應(yīng) 用提供了必要條件。3、操作簡單方便。本發(fā)明僅是通過向提取的毒素內(nèi)加入蛋白酶抑制劑，即可使其 生物活性得到很好的保持，操作簡單方便。4、提取的霞水母毒素生物活性高。本發(fā)明能夠快速有效地抑制毒素中蛋白酶活 性，使具有生物活性的蛋白得到有效保護(hù)，從而獲取具有高生物活性的霞水母毒素蛋白。為 霞水母活性物質(zhì)的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、機(jī)理研究以及開發(fā)利用提供有力的保障。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例利用組織研磨器Mini-Beadbeater破碎霞水母刺絲囊細(xì)胞不 同時間的破碎效果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1霞水母刺絲囊的制備將Ikg冰凍的霞水母觸手于4°C下自溶過夜后，用20-60目的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去除 霞水母觸手殘片，收集上清液倒掉。然后10000g，4°C下冷凍高速離心15min并收集下層沉 淀，用生理鹽水(0. 154mol · L-1NaCl溶液)于4°C反復(fù)洗滌3次至上層液澄清，并將刺絲囊 細(xì)胞沉淀冷凍干燥后，-20°C下冷凍保存?zhèn)溆谩７Q取冷凍干燥的刺絲囊細(xì)胞5mg，加入1. OmL預(yù)冷到0°C的10mMpH6. OPBS緩沖 液于破碎管中，用組織研磨器Mini-Beadbeater在功率2500rpm下破碎3min，期間每破碎 10s，將破碎管取出置于冰水中冷卻lmin。破碎完畢，取5 μ L破碎液于顯微鏡下觀察破碎 情況。然后于4°C，5000g冷凍離心5min，收集上層液，即為霞水母毒素。以牛血清白蛋白 (BSA)作標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法測定上清液中的霞水母毒素的蛋白濃度。實(shí)施例2
與實(shí)施例1不同之處在于稱取冷凍干燥的刺絲囊細(xì)胞10mg，加入1. 2mL預(yù)冷到8°C的20mMpH7. OPBS緩沖 液于破碎管中，用組織研磨器Mini-Beadbeater在功率4200rpm下破碎3min，期間每破碎 20s，將破碎管取出置于冰水中冷卻2min。破碎完畢，取5 μ L破碎液于顯微鏡下觀察破碎情 況。然后于4°C，IOOOOg冷凍離心15min，收集上層液，即為霞水母毒素。以牛血清白蛋白 (BSA)作標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法測定上清液中的霞水母毒素的蛋白濃度。實(shí)施例3 稱取冷凍干燥的刺絲囊細(xì)胞15mg，加入1. 3mL預(yù)冷到3°C 20mMpH7. 5Tris_HCl緩 沖液于破碎管中，用組織研磨器Mini-Beadbeater在功率4600rpm下破碎3min，期間每破 碎30s，將破碎管取出置于冰水中冷卻3min。破碎完畢，取5 μ L破碎液于顯微鏡下觀察破 碎情況。然后于4°C，20000g冷凍離心20min，收集上層液，即為霞水母毒素。以牛血清白蛋 白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法測定上清液中的霞水母毒素的蛋白濃度。實(shí)施例4 稱取冷凍干燥的刺絲囊細(xì)胞20mg，加入1. 4mL預(yù)冷到5°C的20mMpH8. OTris-HCl 緩沖液于破碎管中，用組織研磨器Mini-Beadbeater在功率4800rpm下破碎5min，期間每破 碎30s，將破碎管取出置于冰水中冷卻4min。破碎完畢，取5 μ L破碎液于顯微鏡下觀察破 碎情況。然后于4°C，25000g冷凍離心25min，收集上層液，即為霞水母毒素。以牛血清白蛋 白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法測定上清液中的霞水母毒素的蛋白濃度。實(shí)施例5 稱取冷凍干燥的刺絲囊細(xì)胞50mg，加入1. 5mL預(yù)冷到7°C的20mMpH8. OTris-HCl 緩沖液于破碎管中，用組織研磨器Mini-Beadbeater在功率5000rpm下破碎5min，期間每破 碎30s，將破碎管取出置于冰水中冷卻5min。破碎完畢，取5 μ L破碎液于顯微鏡下觀察破 碎情況。然后于4°C，30000g冷凍離心30min，收集上層液，即為霞水母毒素。以牛血清白蛋 白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法測定上清液中的霞水母毒素的蛋白濃度。以上利用組織研磨器Mini-Beadbeater破碎霞水母刺絲囊細(xì)胞
權(quán)利要求
1.一種保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法，其特征在于在霞水母毒素內(nèi)添加金屬酶抑 制劑或酸性蛋白酶抑制劑，進(jìn)而有效保護(hù)霞水母毒素生物活性。
2.按權(quán)利要求1所述的保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法，其特征在于所述在 0. 5-5mg/ml的霞水母毒素內(nèi)添加終濃度0. l_20mM的金屬酶抑制劑EDTA或終濃度2_6 μ g/ mL的酸性蛋白酶抑制劑P印stantin A，進(jìn)而抑制毒素中蛋白酶的溶血活性。
3.按權(quán)利要求1或2所述的保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法，其特征在于所述霞水 母毒素按如下步驟進(jìn)行提取1)將冷凍于-80—20°C下的霞水母觸角于0-8 °C自溶2-96h，而后以0_8 °C下 5000-30000g離心5-30min，收集沉淀霞水母刺絲囊細(xì)胞，待用；2)將上述每5-50mg的霞水母刺絲囊細(xì)胞內(nèi)加入0.5-2mL在0-8°C預(yù)冷的10_30mM pH6. 0-8. 0緩沖液，然后在振動頻率2500-5000rpm下破碎l_5min，其中每破碎10_30s將霞 水母刺絲囊細(xì)胞取出置于冰水中冷卻l-5min ；3)將破碎后霞水母刺絲囊細(xì)胞在0-8°C下，5000-30000g離心5-30min，上清液即為霞 水母刺絲囊細(xì)胞毒素。
4.按權(quán)利要求3所述保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法，其特征在于所述步驟1)中自 溶后用20-60目的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去除觸手殘片。
5.按權(quán)利要求3所述保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法，其特征在于所述步驟2)中 霞水母刺絲囊破碎時利用Mini-Beadbeater組織研磨器破碎；所述緩沖液為PBS緩沖液或 Tris-HCl緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種保護(hù)霞水母毒素生物活性的方法。在霞水母毒素內(nèi)添加金屬酶抑制劑或酸性蛋白酶抑制劑，進(jìn)而有效保護(hù)霞水母毒素生物活性。本發(fā)明利用豐富的霞水母資源，獲取具有較高生物活性的霞水母毒素蛋白，并能夠快速有效地抑制毒素中蛋白酶的活性，從而使生物活性蛋白得到保護(hù)，為霞水母活性物質(zhì)的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、機(jī)理研究以及開發(fā)利用提供有力的保障。
文檔編號C07K1/14GK102002094SQ20101050889
公開日2011年4月6日 申請日期2010年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月10日
發(fā)明者于華華, 馮金華, 劉松, 孟祥濤, 崔金會, 李克成, 李榮鋒, 李鵬程, 秦玉坤, 邢榮娥 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所