專利名稱：一種人凝血因子Ⅷ的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人凝血因子VDI的制備工藝，屬于生物制藥領域。
背景技術：
在血友病中，80%的病人患有血友病A，該類病人主要缺少正常人所擁有的人凝血 因子通，因此，人凝血因子VDI是治療血友病的救命藥。為了避免潛在的血液來源的病毒傳 染，出于安全考慮，目前我國尚無對血液制品進口解禁的打算，我國市場上除了 SFDA審批 的德國拜耳公司的重組人凝血因子通，中國市場完全為國內企業(yè)生產(chǎn)，均為從血液中提取。 現(xiàn)有的凝血因子生產(chǎn)過程中均要求兩步病毒滅活，而安全性及產(chǎn)品的治療有效性(產(chǎn)品比 活性)最為關鍵。面對目前國內人凝血因子VDI的短缺，在現(xiàn)階段研發(fā)生產(chǎn)安全性高、產(chǎn)品比 活性好的人凝血因子VDI有著積極的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種人凝血因子VDI的制備工藝。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的其制備工藝如下 制備工藝如下
(1)取符合藥典要求的血漿冷沉淀室溫融解l-2h，處理成1.8-2. 2cm的方塊；
(2)冷沉淀溶解加入冷沉淀4.5-6倍重量份的含有6IU/ml肝素鈉的注射用水溶解； 調節(jié)pH至6. 9-7. 1，同時攪拌12-18min ；
(3)鋁膠吸附加入冷沉淀重量12%的含量為3%的鋁膠；調節(jié)pH6.8-7. 2，攪拌 8-12min ；在離心溫度18_22°C，轉速14000rmp/min的狀況下，離心12_18min ；去沉淀，取上 清液，再根據(jù)每毫升上清液的體積加入肝素鈉2IU的方法加入肝素鈉；
(4)酸沉淀調節(jié)pH6. 25-6. 45 ；降溫至 10_13°C，轉速 14000rmp/min，離心 12_18min， 去沉淀，取上清液；
(5)S/D滅活加入11%S/D溶液，至終溶液含S/D濃度為1%，終溶液含土溫-80為1.0%， 含磷酸三丁酯0. 3% ；攪拌均勻后升溫至22°C _26°C，連續(xù)攪拌5. 5-6. 5h ；
(6)過濾;
(7)DEAE s印HaroseFF層析柱平衡用平衡液平衡層析柱至出液pH值為6. 8-7. 2，平 衡液流速1.2 — 1.5L/分鐘；
(8)層析平衡液流速0.8—1. OL/分鐘； 洗滌洗滌液流速0. 8—1. OL/分鐘； 洗脫洗脫液流速0. 5-0. 61/分鐘；
(9)DEAE s印HaroseFF層析柱再生用1. 2mol/L NaCl再生層析柱，再生流速0. 5— 0. 6L/分鐘；
DEAE sepHaroseFF層析柱處理0. 5mol/LNaOH洗滌層析柱，洗滌流速0. 5—0. 6L/分
鐘；
4DEAE s印HaroseFF層析柱保存0. 2 mo 1/LNaOH洗滌層析柱并保存，洗滌流速0. 8— 1. OL/分鐘；
(10)用透析液超濾，配液用十萬分子量膜的超濾器超濾得收集液，預濃縮至收集液 的一半，將制品濃縮轉移到配制罐內攪拌均勻，配液；
(11)分裝；
(12)凍干；
①制品常溫進柜；
②隔板10分鐘從常溫降至0°C，保持30分鐘；
③隔板30分鐘從0°C降到_40°C，在_40°C保持1.5小時；
④開真空泵到真空達到0.3mbar穩(wěn)定；
⑤1小時隔板升溫到_33°C，保持1小時；
⑥5小時隔板升溫到0°C，保持30小時；
⑦2小時隔板升溫到10°C，保持6小時；
⑧2小時隔板升溫到35°C，保持6小時；
⑨1小時使真空到0.05mbar，保持1小時；
(13)干熱病毒滅活
99. 5 士 0. 5 °C水浴干熱滅活30分鐘； 其中
先制備混合液，混合液按29. 41g檸檬酸三鈉、90g甘氨酸和1. Ilg氯化鈣混合后加注 射用水至1L，控制pH值6. 8-7. 2的方法制備；
平衡液按IOOml 1. 2mol/L的NaCl和IOOml混合液加注射用水至1L，控制pH值 6. 8-7. 2的方法制備；
洗脫液按208 ml 1. 2mol/L的NaCl和IOOml混合液加注射用水至1L，控制pH值 6. 8-7. 2的方法制備；
洗滌液含0. 14 mol/L NaCl和0. 02mol/L檸檬酸三納，余量為水，pH在6. 8-7. 2 ； 透析液含200mmol/L NaCl、10mmol/L檸檬酸三鈉、120mmol/L甘氨酸和lmmol/L氯化 鈣，余量為水，PH在6. 8-7. 2 ；
11%S/D溶液按IlOml吐溫-80和33ml磷酸三丁酯加注射用水至lKg，攪拌至清亮的方 法制備；
以上百分比除特別說明，其余均為重量百分比。本發(fā)明采用離子交換層析技術，并在生產(chǎn)工藝采用鋁膠吸附及酸沉淀去除雜質， 使產(chǎn)品比活性顯著提高，制品質量得到明顯改善，同時產(chǎn)品得率提高了 30-35%;此外生產(chǎn) 過程中采用S/D法去除脂包膜病毒及99. 5士0. 5°C干熱法去除非脂包膜病毒，經(jīng)過這2次病 毒滅活步驟顯著提高了臨床用藥的安全性。
具體實施例方式實施例
一、基本要求
1、原料血漿的采集和質量應符合血液制品生產(chǎn)用人血漿的規(guī)定；2、生產(chǎn)設備管線器具應清潔消毒等。二、主要試劑配制
0.lmol/L醋酸量取6. 6體積的冰醋酸與93. 4體積的水混合；
1.2mol/L氯化鈉將70. 2g氯化鈉溶于水，定容至IL ；
混合液，混合液按29. 41g檸檬酸三鈉、90g甘氨酸和1. Ilg氯化鈣混合后加注射用水 至1L，控制pH值6. 8-7. 2的方法制備；
平衡液按IOOml 1. 2mol/L的NaCl和IOOml混合液加注射用水至1L，控制pH值 6. 8-7. 2的方法制備；
洗脫液按208 ml 1. 2mol/L的NaCl和IOOml混合液加注射用水至1L，控制pH值 6. 8-7. 2的方法制備；
洗滌液含0. 14 mol/L NaCl和0. 02mol/L檸檬酸三納，余量為水，pH在6. 8-7. 2 ； 透析液含200mmol/L NaCl、10mmol/L檸檬酸三鈉、120mmol/L甘氨酸和lmmol/L氯化 鈣，余量為水，PH在6. 8-7.2 ；
11%S/D溶液按IlOml吐溫-80和33ml磷酸三丁酯加注射用水至lKg，攪拌至清亮的方 法制備；
二、工藝工程
本發(fā)明具體實施方式
在發(fā)明內容中得以體現(xiàn)，發(fā)明內容可以直接用于實施例。括制備工藝如發(fā)明內容中所述的包括取冷沉淀室溫融解l_2h，處理成2cm的方 塊；冷沉淀溶解；鋁膠吸附；酸沉淀；S/D滅活；過濾；DEAE s印HaroseFF層析柱平衡；DEAE s印HaroseFF層析柱再生、處理和保存；層析；洗滌；洗脫；超濾，配液；分裝；凍干；干熱滅 活°
權利要求
一種人凝血因子Ⅷ的制備工藝，其特征是制備工藝如下(1)取符合藥典要求的血漿冷沉淀室溫融解1 2h，處理成1.8 2.2cm的方塊；(2)冷沉淀溶解加入冷沉淀4.5 6倍重量份的含有6IU/ml肝素鈉的注射用水溶解；調節(jié)pH至6.9 7.1，同時攪拌12 18min；(3)鋁膠吸附加入冷沉淀重量12%的含量為3%的鋁膠；調節(jié)pH6.8 7.2，攪拌8 12min；在離心溫度18 22℃,轉速14000rmp/min的狀況下，離心12 18min；去沉淀，取上清液，再根據(jù)每毫升上清液的體積加入肝素鈉2IU的方法加入肝素鈉；(4)酸沉淀調節(jié)pH6.25 6.45；降溫至10 13℃，轉速14000rmp/min，離心12 18min，去沉淀，取上清液；(5)S/D滅活加入11%S/D溶液，至終溶液含S/D濃度為1%,終溶液含土溫 80為1.0%，含磷酸三丁酯0.3%；攪拌均勻后升溫至22℃ 26℃，連續(xù)攪拌5.5 6.5h；(6)過濾；(7)DEAE sepHaroseFF層析柱平衡 用平衡液平衡層析柱至出液pH值為6.8 7.2，平衡液流速1.2—1.5L/分鐘；(8)層析平衡液流速0.8—1.0L/分鐘；洗滌洗滌液流速0.8—1.0L/分鐘；洗脫洗脫液流速0.5—0.6L/分鐘；(9) DEAE sepHaroseFF層析柱再生用1.2mol/L NaCl再生層析柱，再生流速0.5—0.6L/分鐘；DEAE sepHaroseFF層析柱處理0.5mol/LNaOH洗滌層析柱，洗滌流速0.5—0.6L/分鐘；DEAE sepHaroseFF層析柱保存0.2 mol/LNaOH洗滌層析柱并保存，洗滌流速0.8—1.0L/分鐘；(10) 用透析液超濾，配液用十萬分子量膜的超濾器超濾得收集液，預濃縮至收集液的一半，將制品濃縮轉移到配制罐內攪拌均勻，配液；(11)分裝；(12)凍干；①制品常溫進柜；②隔板10分鐘從常溫降至0℃，保持30分鐘；③隔板30分鐘從0℃降到 40℃，在 40℃保持1.5小時；④開真空泵到真空達到0.3mbar穩(wěn)定；⑤1小時隔板升溫到 33℃，保持1小時；⑥5小時隔板升溫到0℃，保持30小時；⑦2小時隔板升溫到10℃，保持6小時；⑧2小時隔板升溫到35℃，保持6小時；⑨1小時使真空到0.05mbar，保持1小時；(13)干熱病毒滅活 99.5±0.5℃水浴干熱滅活30分鐘；其中先制備混合液，混合液按29.41g檸檬酸三鈉、90g甘氨酸和1.11g 氯化鈣混合后加注射用水至1L，控制pH值6.8 7.2的方法制備；平衡液按100ml 1.2mol/L 的NaCl和100ml混合液加注射用水至1L，控制pH值6.8 7.2的方法制備；洗脫液按208 ml 1.2mol/L的 NaCl和100ml混合液加注射用水至1L，控制pH值6.8 7.2的方法制備；洗滌液含0.14 mol/L NaCl和0.02mol/L檸檬酸三納，余量為水， pH在6.8 7.2；透析液含200mmol/L NaCl、10mmol/L檸檬酸三鈉、120mmol/L甘氨酸和1mmol/L 氯化鈣，余量為水，pH在6.8 7.2；11%S/D溶液按110ml吐溫 80和33ml磷酸三丁酯加注射用水至1Kg，攪拌至清亮的方法制備；以上百分比除特別說明，其余均為重量百分比。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人凝血因子Ⅷ的制備工藝，屬于生物制藥領域。制備工藝包括取冷沉淀室溫融解1-2h，處理成1.8-2.2cm的方塊；冷沉淀溶解；鋁膠吸附；酸沉淀；S/D滅活；過濾；DEAEsepHaroseFF層析柱平衡；DEAEsepHaroseFF層析柱再生、處理和保存；層析；洗滌；洗脫；超濾，配液；分裝；凍干；干熱滅活。本發(fā)明它采用離子交換層析技術，并在生產(chǎn)工藝采用鋁膠吸附及酸沉淀去除雜質，使產(chǎn)品比活性顯著提高，制品質量得到明顯改善，同時產(chǎn)品得率提高了30-35%；此外生產(chǎn)過程中采用S/D法去除脂包膜病毒及99.5±0.5℃干熱法去除非脂包膜病毒，經(jīng)過這2次病毒滅活步驟顯著提高了臨床用藥的安全性。
文檔編號C07K14/755GK101967188SQ201010534849
公開日2011年2月9日 申請日期2010年11月8日 優(yōu)先權日2010年11月8日
發(fā)明者何淑琴, 堯振, 廖昕晰, 梁小明, 鄧志華 申請人:江西博雅生物制藥股份有限公司