專利名稱：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(在下文中也稱為ACE)抑制活性的肽。更具 體地，本發(fā)明涉及具有ACE抑制活性的肽，當(dāng)其作為降血壓劑用于藥用組合物以及用作患 有高血壓的人用特別用途食品、營(yíng)養(yǎng)食品、功能性食品、特定保健用食品、標(biāo)榜有降血壓作 用的食品和飲品等時(shí)，其廣泛地適用于抑制血壓上升以及適用于預(yù)防高血壓等。
背景技術(shù)：
ACE為在血壓和體液量調(diào)節(jié)中起重要作用的蛋白水解酶，并且在控制血壓上升 的凝乳酶_血管緊張素系統(tǒng)中具有將血管緊張素I轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)的高血壓活性的血管緊 張素II的活性。已經(jīng)對(duì)這種酶的抑制劑進(jìn)行了多種研究，并且已知它們具有降低血壓的 活性(D. W. Cushman 等人，Biochemical Pharmacology, Vol. 20，第 1637-1648 頁(yè)(1971)； Robert J. L.等人，The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 204，第281-288頁(yè)(1977))。關(guān)于ACE抑制劑，已經(jīng)研究了多種藥劑，并且有多 禾中為市售的(Yoshihiro Kaneko 等人，“Igaku no Ayumi，，(Progress in Medical Science), vol. 122，第 62-85 頁(yè)，1972 ；Toshio Hisayoshi 等人“Hitome de Wakaru Koketsuatsu “ (Hypertension Recognizable at a Glance),2nd edition,第 54-55 Jit, 1998 ；Noboru Toda 等 Α " Jyunkankei Chiryoyaku no Sayo Mekanizumu" (Action Mechanism of Circulating system Therapeutic Agents),第 260-265 頁(yè)，1998)。另夕卜， 已經(jīng)從酪蛋白和多種食品如明膠、沙丁魚(yú)和鰹中發(fā)現(xiàn)能夠抑制ACE的肽。例如，酪蛋白 由來(lái)的肽 VPP(Val-Pro-Pro，IC50 :9 μ Μ)、酪蛋白由來(lái)的肽 IPP (Ile-Pro-Pro，IC50 :5μΜ)、 和酪蛋白由來(lái)的肽VAP(Val-Ala-Pr0，IC5tl :2 μ Μ)、和玉米蛋白α-玉米醇溶蛋白由來(lái)的 LQP (Leu-Gin-Pro, IC50 :2 μ Μ)為已知的(Yasunori Nakamura 等人，Journal of Dairy Science, Vol. 78，第 777-783 頁(yè)(1995) ；Shinsuke Miyoshi 等人，Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 55(5),第 1313-1318 頁(yè)(1991) ；Susumu Maruyama 等人， Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 51 (6)，第 1581—1586 頁(yè)(1987))。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，考慮到其中已經(jīng)廣泛地對(duì)ACE抑制劑進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)的現(xiàn)有技術(shù)狀 況，本發(fā)明的發(fā)明人努力開(kāi)發(fā)一種全新的并且有效的ACE抑制劑。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人從不同的觀點(diǎn)進(jìn)行研究，結(jié)果，著眼于肽而合成了大 量的肽，特別是寡肽，然后對(duì)如此得到的肽進(jìn)行篩選。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了具有優(yōu)異的ACE抑制活 性的肽，并且體外試驗(yàn)的結(jié)果確認(rèn)了這些肽可用作降血壓劑，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及以下的第(1)到(9)項(xiàng)
(1)包括由SEQ ID NO 1表示的氨基酸序列的肽；或
包括其中將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加入到由SEQ ID NO :1表示的氨基酸序列中的氨基 酸序列并且具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的肽。
(2)包括由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的肽；或
包括其中將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加入到由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列中的氨基 酸序列并且具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的肽。
(3)包括由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列的肽；或
包括其中將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加入到由SEQ ID NO :3表示的氨基酸序列中的氨基 酸序列并且具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的肽。
(4)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，其包括第(1)到C3)中任一項(xiàng)的肽作為活性成分。
(5)包括第⑴到(3)中任一項(xiàng)的肽的食品或飲品。
(6)包括第⑴到(3)中任一項(xiàng)的肽作為活性成分的藥用組合物。
(7)權(quán)利要求(6)的藥用組合物，其為用于預(yù)防和/或治療由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶異 常引起的疾病的藥劑。
(8)第(1)到(3)中任一項(xiàng)的肽在生產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中的應(yīng)用。
(9)第⑴到(3)中任一項(xiàng)的肽在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 異常引起的疾病的藥劑中的應(yīng)用。


圖1表示乳酪由來(lái)肽的HPLC色譜圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的肽的具體例子包括以下(a)到(f)的肽
(a)包括由SEQ ID NO 1表示的氨基酸序列的肽；
(b)包括由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的肽；
(c)包括由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列的肽；
(d)包括其中將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加入到由SEQ ID NO :1表示的氨基酸序列中的 氨基酸序列并且具有ACE抑制活性的肽；
(e)包括其中將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加入到由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列中的 氨基酸序列并且具有ACE抑制活性的肽；和
(f)包括其中將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加入到SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列中的氨 基酸序列并且還具有ACE抑制活性的肽。
在下文中，包括由SEQ ID NO :1表示的氨基酸序列(Met-Ala-Pro)的肽、包括由 SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列(Ile-His-Ala)的肽、和包括由SEQ ID NO 3表示的氨基 酸序列(Ile-Gln-Ala)的肽還分別稱為MAP、IHA和IQA。
關(guān)于包括其中將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加入到由SEQ ID NO :1到3表示的氨基酸序列 中的氨基酸序列并且還具有ACE抑制活性的肽，對(duì)于被加入的氨基酸沒(méi)有具體限制，可以 使用任選的氨基酸，只要得到的肽具有ACE抑制活性。對(duì)于要加入的氨基酸的數(shù)目沒(méi)有具 體限制，可以使用任選數(shù)目的氨基酸，只要得到的肽具有ACE抑制活性。然而，通常，加入的氨基酸的數(shù)目為1到10，優(yōu)選為1到5，更優(yōu)選為1到3，更優(yōu)選為1或2，特別優(yōu)選為1。具體例子包括以下的肽包括由SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列 (Leu-Met-Ala-Pro)的肽、包括由 SEQ ID NO :5 表示的氨基酸序列(Arg-Met-Ala-Pro)的 肽、包括由SEQ ID NO :6表示的氨基酸序列(Met-Ala-Pro-Pro)的肽、包括由SEQ ID NO 7 表示的氨基酸序列(Arg-Met-Ala-Pro-Pro)的肽、等等。本發(fā)明的肽可為向其加入工業(yè)用鹽如鹽酸鹽、乙酸鹽、硫酸鹽、琥珀酸鹽或酒石酸 鹽的那些，但是優(yōu)選加入可食用的或可藥用的鹽。本發(fā)明的肽可單獨(dú)使用和作為兩種或多種肽的混合物使用。本發(fā)明的肽可通過(guò)常規(guī)的肽合成法生產(chǎn)，或者，它們可通過(guò)乳蛋白如酪蛋白的酶 促水解或化學(xué)水解制備。此外，可采用微生物發(fā)酵。本發(fā)明的ACE抑制劑包含本發(fā)明的肽，并且可以不同的形式被使用，如食品和飲 品、特定保健用食品、營(yíng)養(yǎng)功能性食品、特別用途食品、健康食品、準(zhǔn)藥物(quasi-drug)、藥 用組合物等。例如，其可作為藥用組合物或準(zhǔn)藥物直接給用，或作為如健康食品和特定保健 用食品的特別用途食品、或營(yíng)養(yǎng)功能性食品直接攝??；或者通過(guò)預(yù)先將其加入到各種食品 中而被攝取，各種食品如牛乳、軟飲品、發(fā)酵乳、酸乳、乳酪、面包、小點(diǎn)心、脆餅、和比薩片。為了生產(chǎn)上述食品，可以將水、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、維生素類、礦物質(zhì)類、有機(jī)酸、 果汁、香料等作為主要成分合并。例子包括動(dòng)植物性蛋白如全脂奶粉、脫脂奶粉、部分脫脂 奶粉、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白濃縮物、乳清蛋白分離物、α -酪蛋白、β -酪蛋白、κ -酪 蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳鐵蛋白、大豆蛋白、卵蛋白、肉蛋白及其水解物；多種 乳由來(lái)成分，如黃油、乳清礦物質(zhì)、奶油、乳清、乳清礦物質(zhì)、非蛋白氮、唾液酸、磷脂和乳糖； 碳水化合物，如蔗糖、葡萄糖、果糖、糖醇類、麥芽糖、低聚糖類、改性淀粉(糊精以及可溶性 淀粉、British淀粉、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)和食用纖維；動(dòng)物性油脂，如豬油和魚(yú) 油；植物性油脂，如棕櫚油、紅花油、玉米油、菜籽油、椰子油及其分餾油(fractional oil) 包括氫化油、酯交換油等；多種維生素，如維生素A、維生素B類、維生素C、維生素D類、維生 素E、維生素K類、維生素P、維生素Q、尼克酸(niacin)、煙酸(nicotinic acid)、泛酸、生物 素、肌醇、膽堿、葉酸；礦物質(zhì)如鈣、鉀、鎂、鈉、氯、銅、鐵、錳、鋅、硒、氟、硅、碘；和有機(jī)酸和 有機(jī)酸鹽，如蘋果酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸等；并且可任選地選擇和加入其中的一種或兩種 或多種。如有需要，除了合成產(chǎn)品之外，還優(yōu)選將它們作為含有大量它們的食品加入。當(dāng)本發(fā)明的產(chǎn)品用作藥用組合物或準(zhǔn)藥物時(shí)，它們可作為多種鹽給藥。例如可將 其作為與鹽酸、乙酸、甲酸等的鹽給藥。給藥方法包括經(jīng)口給藥、經(jīng)皮給藥、經(jīng)腸給藥、經(jīng)血 管給藥、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、滴鼻劑、滴眼劑、吸入、直腸給藥等。另外，它們可以不同 的形式給藥。例如，可以片劑、錠劑、膠囊、顆粒、粉末、糖漿、懸浮液、溶液等形式給藥。這些 不同的藥劑可以根據(jù)常用方法使用通常用于藥劑生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)助劑制備，常規(guī)助劑 如填料、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、矯味劑、增溶劑、助懸劑和具有基本試劑的包衣劑。因?yàn)楸景l(fā)明的肽具有ACE抑制活性，它們可用于預(yù)防和/或治療與凝乳酶_血管 緊張素系統(tǒng)、奎寧-激肽釋放酶系統(tǒng)等中的與ACE有關(guān)的疾病。與ACE有關(guān)的疾病包括高 血壓、動(dòng)脈硬化、血管肥厚、心肌梗塞、心力衰竭、心臟肥大、腎機(jī)能不全、糖尿病等。本發(fā)明的活性成分表現(xiàn)出優(yōu)異的安全性，因?yàn)槠渫耆珱](méi)有毒性或具有極小毒性， 并且在將其以每天500mg的劑量對(duì)小鼠經(jīng)口給藥時(shí)，發(fā)現(xiàn)根本沒(méi)有急性毒性。因此，當(dāng)將其以食品或飲品形式使用時(shí)，在其用于預(yù)防、保健和飲食品的每種情況中，對(duì)于活性成分的使 用量都沒(méi)有限制，并且當(dāng)將其用作藥物時(shí)，可根據(jù)每名患者而定在上述范圍內(nèi)選擇性地使 用本發(fā)明的活性成分。例如，在經(jīng)口攝取的情況中，本發(fā)明活性成分的使用量隨癥狀、年齡、 體重、給藥方法、劑型等的不同而不同，但是通常，其以每名成人約0. Img到l，500mg的量給 藥，一天一次或一天數(shù)次將日劑量分開(kāi)給用。另外，因?yàn)榛钚猿煞旨词乖诖罅繑z取時(shí)也不表 現(xiàn)出特別的急性毒性，可任選地以超過(guò)上述范圍的較大量使用。
以下通過(guò)參考MAP作為本發(fā)明的肽的例子描述本發(fā)明肽的生產(chǎn)方法。也可同樣地 生產(chǎn)IRA、IQA、和包含這些肽作為部分肽的其它的肽。
1. MAP的制備方法
優(yōu)選通過(guò)以下方法制備MAP。
在以下制備方法中，使用包含MAP作為其部分結(jié)構(gòu)的底物和能夠從底物切斷MAP 的酶的組合。關(guān)于底物，優(yōu)選使用酪蛋白，但是也可使用動(dòng)植物性蛋白，如乳、乳由來(lái)成 分、全脂奶粉、脫脂奶粉、部分脫脂奶粉、酪蛋白、大豆蛋白、卵蛋白、肉蛋白、豆類或小麥、或 其水解物。β-酪蛋白富含脯氨酸，脯氨酸占其序列的約17%。另外，因?yàn)樵谌槔业鞍啄z束 中包含33.6%的β-酪蛋白，可從中大量制備β-酪蛋白。
將底物溶解于水中，濃度為0. 1到70重量％，優(yōu)選為0. 1到60重量％，更優(yōu)選為 0.3到50重量％。向其中加入基于底物蛋白含量為0. 1到10重量％、優(yōu)選0.3到2重量％ 的蛋白酶N“Amanc^G(由Amano Enzyme Inc.生產(chǎn))，然后使用有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸如檸檬酸溶 液、乳酸、或鹽酸將其PH調(diào)節(jié)到4. 5到6. 0，優(yōu)選4. 5到5. 0，隨后在15到50°C、優(yōu)選在20 到400C、更優(yōu)選在30到40°C下攪拌，從而引起降解。在降解40到50小時(shí)之后，向其中加入 基于底物蛋白含量分別為0.01到10重量％、優(yōu)選0. 1到5重量％的每種Umamizyme G(由 Amano Enzyme Inc.生產(chǎn))禾口 Flavourzyme (由 Novozymes Corporation 生產(chǎn))，然后將其 PH調(diào)節(jié)到3. 5到5. 0，優(yōu)選3. 5到4. 0。在攪拌下在15到50°C、優(yōu)選20到40°C、更優(yōu)選30 到40°C繼續(xù)降解5到10天。通過(guò)在50到110°C、優(yōu)選60到100°C、更優(yōu)選80到100°C熱 處理10到20分鐘使酶失活，然后將其pH調(diào)節(jié)到4. 5到6. 0，優(yōu)選4. 5到5. 0。
2.確認(rèn)MAP生成的方法
對(duì)于確認(rèn)MAP生成的方法，通過(guò)LC-MS分析酶消解樣品的水溶性部分和MAP標(biāo)準(zhǔn) 樣品中的每一個(gè)，并且通過(guò)有或沒(méi)有與MAP標(biāo)準(zhǔn)樣品相同的MAP保留時(shí)間峰來(lái)判斷MAP的 生成。將上述1中制備的酶消解樣品在4°C和10，OOOg下離心40分鐘，回收水溶性部分并 進(jìn)一步冷凍干燥。將每個(gè)冷凍干燥樣品再以100yg/ml的濃度溶解于以下流動(dòng)相中，并注 射其5 μ 1部分。將MAP標(biāo)準(zhǔn)樣品以5 μ g/ml的濃度溶解于以下流動(dòng)相中并注射其5 μ 1的 部分。當(dāng)MAP標(biāo)準(zhǔn)樣品在以下分析條件下進(jìn)行分析時(shí)，在約17分鐘的保留時(shí)間觀察到MAP 的峰。通過(guò)在相同分析條件下分析酶消解樣品的水溶性部分，在約17分鐘觀察到峰的樣品 被判斷為是“MAP-陽(yáng)性的”，沒(méi)有觀察到該峰的樣品被判斷為是“MAP-陰性的”。
柱=CAPCELPAK C18 MG ( Φ 2. 0x250mm,由 SHISEID0 CO.，LTD.生產(chǎn))
流動(dòng)相包含0. 05%甲酸的4%乙腈溶液
流速0. 17ml/min
柱溫40°C
檢測(cè)器ESI(+)
分子量318
參考實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不受其限制。
實(shí)施例1
將IOOg份的Denmark脫脂乳酪(用絞肉機(jī)粉碎)與50g的無(wú)菌水混合，然后加入 18g 的起動(dòng)細(xì)菌(3 禾中，包括Lactococcus lactis subsp. Lactis、Lactococcus cremoris 禾口 Lactococcus diacetylactis)和0. 34g的氯化鈉，隨后進(jìn)行攪拌。隨后向其中加入0. 6g的 蛋白酶N“AmanoT(由Amano Enzyme Inc.生產(chǎn))，并將混合物在:34°C下振搖，從而進(jìn)行降 解。四十八小時(shí)之后，用檸檬酸調(diào)節(jié)其PH到4. 1，并且向其中加入各自為0. 3g的Umamizyme G (由 Amano Enzyme Inc.生產(chǎn))禾口 Flavourzyme (由 Novozymes Corporation 生產(chǎn))，隨后 在34°C振搖，從而進(jìn)行降解。六天之后，調(diào)節(jié)其pH到7. O并且隨后加入無(wú)菌水，使總量為 200g。通過(guò)在110°C加熱15分鐘使酶失活。通過(guò)離心除去不溶性物質(zhì)，然后將肽通過(guò)HPLC 純化。使用 YMC-Pack R&D ODS 柱(由 YMC Corporation 生產(chǎn)，20x250mm)，通過(guò)從 0. 三 氟乙酸水溶液到含有0. 1 %三氟乙酸的70%乙腈水溶液的線性梯度進(jìn)行洗脫(50min)(流 速7. 5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng):214歷，柱溫:40°C )。HPLC色譜圖如圖1中所示。將從27到31 分鐘洗脫下來(lái)的級(jí)分D分級(jí)，然后通過(guò)同樣的柱色譜法純化，從而分離具有Met-Ala-Pro、 Ile-His-Ala 和 Ile-Gln-Ala 序列的三月太。
實(shí)施例2
使用肽自動(dòng)合成儀合成SEQ ID NO 1到7的每種肽。通過(guò)反相HPLC確認(rèn)如此得 到的每種肽的純度為95%。將這些合成肽的每一種都溶解于0. IM硼酸鹽緩沖液(pH 8. 3) 中。隨后，與0. Iml的酶溶液(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2單位/ml)和0. (Mml的每種樣品溶液 混合，隨后加熱到37°C。向其中加入0. Iml份的底物溶液(馬尿酰基-His-LeiuN-苯甲酰 基-Gly-His-Leu)，隨后充分?jǐn)嚢琛Ｔ谑够旌衔镌?7°C反應(yīng)60分鐘之后，通過(guò)加入0. 13ml 的IN鹽酸終止反應(yīng)。然后，向其中加入0.85ml的乙酸乙酯，隨后振搖1分鐘，然后將混合 物在3，OOOrpm下離心10分鐘?；厥?.7 ml份的上清液，并使用離心蒸發(fā)器除去溶劑(約 30分鐘)。通過(guò)加入0. 5ml的蒸餾水將殘余物溶解，并測(cè)量在228nm波長(zhǎng)的吸光度。
通過(guò)以下數(shù)學(xué)式1計(jì)算ACE抑制活性(％ )。
數(shù)學(xué)式1
ACE 抑制活性(% ) = {(A-B) - (C-D)} / (A-B) xlOO
在這方面，數(shù)學(xué)式中的A為使用酶時(shí)對(duì)照的吸光度，B為沒(méi)有使用酶時(shí)對(duì)照的吸光 度，C為使用酶時(shí)樣品的吸光度，和D為沒(méi)有使用酶時(shí)樣品的吸光度。另外，在對(duì)照中使用 0. IM的硼酸鹽緩沖液代替樣品溶液。
根據(jù)如此得到的ACE抑制活性，計(jì)算每種肽的IC5(I。結(jié)果如以下表中所示。
表 權(quán)利要求
1.包括由SEQID NO :3表示的氨基酸序列的肽。
2.包括其中將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加入到由SEQID NO :3表示的氨基酸序列中的氨基 酸序列并且具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的肽。
3.血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，其包括權(quán)利要求1或2的肽作為活性成分。
4.包括權(quán)利要求1或2的肽的食品或飲品。
5.包括權(quán)利要求1或2的肽作為活性成分的藥用組合物。
6.權(quán)利要求4的食品或飲品或權(quán)利要求5的藥用組合物，其為用于預(yù)防和/或治療由 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶異常引起的疾病的藥劑。
7.權(quán)利要求1或2的肽在生產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2的肽在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶異常引起的疾 病的藥劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，和包含所述肽的食品和飲品和/或藥物。
文檔編號(hào)C07K5/11GK102030818SQ20101054747
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2004年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月1日
發(fā)明者內(nèi)田勝幸, 小田宗宏, 殿內(nèi)秀和, 鈴木匡之 申請(qǐng)人:明治乳業(yè)株式會(huì)社