專利名稱：相思子毒素a鏈突變體的構(gòu)建及作為候選疫苗抗原的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種相思子毒素A鏈突變體的構(gòu)建及作為候選疫苗抗原，尤其涉及一 種與相思子毒素疫苗相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展和生物毒素的開發(fā)利用，毒素在大規(guī)模殺傷性武器中的 重要性已凸現(xiàn)出來，生物毒素及其生物恐怖的威脅與日俱增。相思子毒素是由A、B鏈組成， A鏈為效應鏈，具有RNA N-糖苷酶活性，B鏈為結(jié)合鏈，介導A鏈進入細胞內(nèi)發(fā)揮毒性作用。 不同產(chǎn)地的相思子含有在一級結(jié)構(gòu)上稍有差異的相思子毒素，表現(xiàn)為其毒性大小有差異， 文獻報道的相思子毒素小鼠腹腔LD5tl介于4-20 μ g/kg之間。生產(chǎn)原料相思籽來源廣泛，容 易獲得，在許多公開的專業(yè)刊物和互聯(lián)網(wǎng)上又可輕易得到如何提取制備相思子毒素的詳細 資料，所以，相思子毒素的恐怖威脅不容忽視。針對相思子毒素中毒，目前尚無預防疫苗、特 異性抗毒素和解毒藥。通過分析現(xiàn)有的研究進展和成果，美軍的生防專家認為，疫苗研究是 對抗其中毒的有效預防手段。因此，開展相思子毒素疫苗的研究，具有十分重要的軍事和社
^^ 眉、ο我國學者對相思子毒素生物戰(zhàn)劑的偵檢和醫(yī)學防護等研究領域剛剛起步，針對相 思子毒素的恐怖襲擊尚無配套診斷試劑和有效免疫治療及防護手段，因此迫切需要建立和 發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權(quán)的檢測和防護用品。為了防止敵對勢力和恐怖組織使用相思子毒素 等生物戰(zhàn)劑的襲擊，應盡快建立和完善相思子毒素等生物戰(zhàn)劑的偵檢和醫(yī)學防護系統(tǒng)，保 證及時采取應急措施和對策，將生物恐怖襲擊造成的破壞降低到最低限度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種與相思子毒素疫苗相關蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為mATA，是如下1)或2)中任一所述的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述序列表中的序列2由251個氨基酸殘基組成。所述一個或數(shù)幾個氨基酸殘基 的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。mATA的編碼基因mATA也是本發(fā)明保護的范圍，為如下1) _3)中任一所述的DNA分 子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
上述序列表中的序列1由753個核苷酸組成，編碼區(qū)為序列1自5’末端第1_753 位核苷酸。含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒也是本 發(fā)明保護的范圍。所述重組載體為將所述編碼基因插入載體pET-His的EcoR I和Nhe I識別位點 間得到的重組載體。所述重組菌為將所述重組載體導入宿主菌得到的重組菌。擴增所述編碼基因全長或任一片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍，所述引物對 的一條引物為序列3所示的DNA分子，另一條引物為序列4所示的DNA分子。本發(fā)明的另一個目的是提供一種疫苗，它的活性成分為如下1)-3)中任一一種 1)所述的蛋白質(zhì)；幻所述的重組載體；幻所述的重組菌。所述蛋白質(zhì)在制備疫苗中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；所述編碼基因在制備疫 苗中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；所述重組載體在制備疫苗中的應用也是本發(fā)明保護的 范圍；所述重組菌在制備疫苗中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述疫苗為相思子毒素疫苗，具體為相思子毒素A鏈突變體疫苗。本發(fā)明的實驗證明，經(jīng)過點突變獲得的突變體mATA，是通過重組表達得到的相思 子毒素A鏈突變體蛋白，通過A鏈突變體免疫原的免疫途徑、劑量、次數(shù)、佐劑等多種不同免 疫方案，分析相思子毒素A鏈突變體的免疫保護效果，結(jié)果為該突變體具有低毒性、無血管 滲漏、有良好免疫原性等特點，可以作為候選疫苗抗原。


圖1為相思子毒素A鏈突變體純化2為相思子毒素A鏈突變體的SDS-PAGE電泳3為BCA法測定蛋白濃度標準曲線圖4為相思子毒素A鏈突變體對人肝癌細胞SMMC-7721的殺傷作用曲線圖5為相思子毒素A鏈突變體對骨髓瘤細胞Sp2/0的殺傷作用曲線圖6為mATA體內(nèi)中和實驗體重變化圖7為mATA體外中和實驗體重變化
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1、突變體mATA的獲得1、突變體mATA的獲得根據(jù)已有的相思子毒素的A鏈基因(rATA)序列(rATA核苷酸序列為序列5， rATA MSSIj^^lJ^j^^lJ 6), Quickchange Lighting Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene 公司，Catalog#210518)進行定點突變獲得突變體 mATA_E164AR167L(質(zhì) 粒)，經(jīng)測序，mATA-E164AR167L含有的基因命名為mATA，其核苷酸序列為序列表中的序列 1，編碼區(qū)為序列表中序列1的自5’末端第1-753位核苷酸序列；mATA編碼的蛋白mATA的氨基酸序列為序列表中的序列2所示的序列。應用Lasergene軟件預測所構(gòu)建的突變體的 抗原性未發(fā)生明顯變化。測序驗證突變結(jié)果，具體如下將序列5的第491位的堿基A突變?yōu)樾蛄?第491位的堿基C，序列5第500位的 堿基G突變?yōu)樾蛄?第500位的堿基T。將序列6的第164位氨基酸谷氨酸(E)突變?yōu)樾蛄?的第164位氨基酸丙氨酸 (A)，序列6的第167位氨基酸精氨酸(R)突變?yōu)樾蛄?的第167位氨基酸亮氨酸(L)。設計引物1. ABRaA Upper :5’ -GGAATTCGAAGATCGCCCGATCAAATTTTCCACCGAAGGTGCCAC-3’(EcoR I)(序列 3)2. ABRaA Lower :5，-GGCTAGCATTCGGCGGATTGCAGACAAACAGCATCAGTGCCAGAACTGC-3’(Nhe I)(序列 4)以上述獲得的突變體質(zhì)粒mATA-E164AR167L作為模板，用引物ABRaA Upper和 ABRaA Lower進行擴增，獲得的PCR產(chǎn)物連接至克隆載體pMDIS-T (寶生物工程(大連)有 限公司，產(chǎn)品目錄號D101B)得到pMD18T-mATA(也可人工合成序列1，連接到pMD18_T得到 pMD18T-mATA。)，再用 EcoR I (NEB 公司，R0101V)和 Nhe I (NEB 公司，R0131V)雙酶切 pMD18T-mATA后回收小片段，與經(jīng)過同樣酶切的表達載體pET-His (孫嗣梅，王景林等.重 組蓖麻毒素A鏈蛋白的可溶性表達、純化與抗原性分析.中國生物工程雜志.2005，25 ) 47-51.公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所獲得。)的載體片 段連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(北京全式金生物技術(shù)有限公司， 產(chǎn)品目錄號D30619)，經(jīng)篩選后的陽性菌，提取質(zhì)粒后測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序 列1插入表達載體pET-His的EcoR I和Nhe I的識別位點間得到的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為 pET-His-mATA，將其對應的陽性菌命名為 BL21 (DE3)pLysS/pET-His-mATA。2.純化 mATA將上述獲得的BL21 (DE3)pLysS/pET-His-mATA按1 100的比例接種于5ml含 Amp (100 μ g/ml)和 Glu (0. 5 % )的 LB 培養(yǎng)基，37 "C，200rpm 培養(yǎng)至 A600 = 0 . 6 時，再按
1 100的比例轉(zhuǎn)接至500ml同樣的LB培養(yǎng)基(并設陰性對照)，同上條件振蕩培養(yǎng)至 A600 = 0 . 6時，誘導組加IPTG至終濃度ImM并補加Amp，然后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，誘導條件改為 30°C，150rpm誘導證后，lOOOOrpm，4°C離心IOmin收集表達菌株的菌體，將全菌沉淀用PBS 洗滌三次，再以裂解緩沖液(0. 02M PB,500mM NaCl，50mM咪唑，pH7. 4)重懸超聲破碎后， lOOOOrpm, 4°C離心lOmin，收集上清液和沉淀，上清液直接加2 X SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液 (H20、甘油、1.5mM pH6.8TriS、10%溴酚藍、β -巰基乙醇)，而沉淀用8M的尿素溶解后加
2X SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液，最后均在100°C煮沸5min，并短暫離心。吸取20μ 1樣品，進 行SDS-PAGE電泳。經(jīng)15% SDS-PAGE電泳分析，相思子毒素A鏈突變體(mATA)在上清液有特異性的 蛋白表達，蛋白相對分子量約為30kDa，與預期的蛋白大小相符。將上述獲得的上清液進行親和層析，層析柱為Ni Sepharose High performance 親和層析柱(GE Healthcare, 17_5M8_01)，洗脫液為含500mM咪唑洗脫液(由PB、NaCl、咪 唑和水組成，其中PB在洗脫液的終濃度為0. 02M、NaCl在洗脫液的終濃度為500mM、咪唑在洗脫液的終濃度為500mM，PH為7. 4)，洗脫流速為2ml/min，當咪唑濃度為300mM時，收集洗 脫峰即為純化的mATA，結(jié)果如圖1所示。將收集的純化的mATA經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖2，其中M為低分子量蛋白 marker, 1-3均為經(jīng)鎳柱純化后mATA，可以看出，蛋白相對分子量約為30kDa，洗脫蛋白的純 度高于98. 5%0采用同樣的方法將空載體pET-His轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS,得到重組菌 BL21 (DE3)pLySS/pET-HiS，誘導表達得到的蛋白作為對照蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳驗證沒有 目的蛋白表達。采用同樣的方法將序列5所示的DNA分子導入載體pET_His中，再轉(zhuǎn)入大腸桿 菌BL21 (DE3)pLysS得到重組菌BL21 (DE3)pLysS/pET-His-rATA，誘導表達得到的蛋白為 rATA (重組相思子毒素A鏈蛋白(未突變))。實施例2、突變體mATA的生物活性檢測1.突變體蛋白的定量采用BCA法蛋白定量試劑盒(購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司，Lot#20120613) 對實施例1得到的純化的mATA進行定量，實驗重復三次，結(jié)果取平均值。具體步驟試劑盒組成蛋白標準(5mg/mlBSA)、SolutionA、Solution B。(1)使用時將Solution A搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積Solution A加1體 積Solution B (50 1)配制適量BCA工作液，充分混勻。(2)完全溶解蛋白標準品(5mg/mlBSA)，用PBS將其稀釋至1. 5mg/ml, 1. 0mg/ml, 0. 8mg/ml，0. 4mg/ml，0. 2mg/ml 作為標準品。(3)將上述各濃度的標準品及待測樣品分別加到96孔板中。(4)各孔加入200ulBCA工作液，輕輕用加樣槍吹打混勻，37°C放置30_60分鐘。(5)冷卻到室溫后，用酶標儀測定A562。(6)根據(jù)標準曲線計算出待測樣品中的蛋白濃度。結(jié)果如圖3所示，純化的mATA的濃度為1. 46mg/ml (經(jīng)Ni親和層析柱純化以后得 到的目的蛋白)，500ml菌液所得蛋白量為23. 5mg。2、相思子毒素A鏈突變體(mATA)抗原性分析將由實施例1獲得的純化的mATA進行^festern印跡分析將mATA經(jīng)SDS-PAGE電 泳后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素薄膜上，以抗天然abrin兔多克隆抗體(制備方法見后述)為一抗， 以辣根酶標記山羊抗兔IgG(美國Santa Cruz公司，觀-2301)為二抗，以實施例1獲得的 對照蛋白為陰性對照。結(jié)果顯示在30KDa附近有特異顯色帶出現(xiàn)，說明所得到的重組突變體蛋白能被抗 天然abrin兔多克隆抗體所識別，具有良好的抗原性。陰性對照沒有發(fā)生特異性的抗原抗 體反應。將由實施例1獲得的純化后的mATA用包被液進行系列稀釋，然后進行包被， IOOul/孔，以抗天然abrin兔多克隆抗體為一抗，以辣根酶標記山羊抗兔IgG為二抗，進行 ELISA檢測。以天然abrin為陽性對照，實施例1獲得的對照蛋白為陰性對照。實驗重復三 次，結(jié)果取平均值。
結(jié)果如下與陽性對照(純化的天然abrin)相比，2ug/ml以上濃度純化的mATA包 被孔均為強陽性，說明突變體蛋白mATA能與以抗天然abrin兔多克隆抗體發(fā)生特異性的抗 原抗體反應，進一步驗證了所獲得突變體的正確性。陰性對照沒有發(fā)生特異性的抗原抗體 反應。天然abrin，其genbank號為X76720，也可以通過如下方法獲得相思籽(云南相 思子(Abrus precatorius L.)，購自中國科學院昆明植物研究所)勻漿、抽濾、浸提、飽和硫 酸銨沉淀、粗提、親和層析、凝膠過濾，得到純化的天然abrin。(參考文獻聶聰?shù)?相思子 毒素抗原和抗體制備.中國國境衛(wèi)生檢疫雜志.2009. 32 ) :281-284)。抗天然abrin兔多克隆抗體制備方法用含1 %甲醛的磷酸鹽緩沖液對天然abrin 減毒處理制備類毒素，以類毒素為免疫抗原分4次免疫新西蘭純種大耳白兔，耳緣靜脈采 血，以天然abrin為抗原，用間接ELISA測定效價，效價達到1 IO6后心臟采血。兔血清經(jīng) 濾膜濾過，加醋酸緩沖液稀釋，在酸性條件下，正辛酸沉淀非IgG蛋白，離心取上清液，在中 性條件下置冰浴中飽和硫酸銨，以體積分數(shù)為45%飽和度沉淀IgG蛋白，收集沉淀蛋白，透 析、離心、取上清液，經(jīng)濾膜濾過，按說明書經(jīng)HiTrapTM rProtein A FF親和柱純化抗體。3、突變體蛋白的活性分析通過MTS法測定突變體蛋白mATA對人肝癌細胞SMMC-7721 (北京興奧康生物科技 有限公司，AK169711)和骨髓瘤細胞Sp2/0(上海信然生物技術(shù)有限公司，GS-183)的殺傷作 用，具體如下(1)將人肝癌細胞SMMC-7721 (或骨髓瘤細胞Sp2/0)計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞數(shù)至105/ml， 制備IOml細胞懸液，加入96孔板，100 μ 1/孔，即細胞數(shù)為IO4/孔。空白孔不加細胞懸液。(2) 5% C02 , 37°C條件下培養(yǎng) 24h。(3)每孔加入100 μ 1用含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學 制品(北京)有限公司，SH30809.01B)10倍系列稀釋的由實施例1獲得的純化的mATA。陰 性對照孔不加毒素。(4) 5% C02 , 37°C條件下培養(yǎng) 72h。(5)吸除培養(yǎng)液，PBS洗板三遍，加入100 μ 1無血清培養(yǎng)基，20 μ 1 MTS (CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Sigma 公司，G3580)，37°C條件下 培養(yǎng)池。(6)微孔板式酶標儀上測定A490值。(7)計算細胞存活率細胞存活率(％ )=(試驗組A490/陰性對照組A490) X 100%。以實施例1獲得的rATA和天然abrin作為對照。實驗重復三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖4和圖5所示，圖4為相思子毒素A鏈突變體對人肝癌細胞SMMC-7721 的殺傷作用曲線，圖5為相思子毒素A鏈突變體對骨髓瘤細胞Sp2/0的殺傷作用曲線。相思子毒素A鏈突變體對人肝癌細胞SMMC-7721的殺傷作用結(jié)果具體為mATA IC50 約為 1. 5 X IO^7M,天然 abrin IC50 約為 1Χ1(Γ"Μ，rATA IC50 約為 5Χ1(Γ"Μ。相思子毒素A鏈突變體對骨髓瘤細胞Sp2/0的殺傷作用結(jié)果具體為mATA IC50 約為 1. 2 X IO^7M,天然 abrin IC50 約為 1Χ1(Γ"Μ，rATA IC50 約為6Χ1(Γ"Μ?？梢钥闯?，突變體蛋白(mATA)較之未突變前其IC5tl明顯升高，說明其毒性明顯減 弱，達到預期的突變目的。4、突變體蛋白免疫原性分析(1)免疫接種實驗動物采用BALB/c小鼠，雌性，5-6周齡，體重約18-20克(軍 事醫(yī)學科學院實驗動物中心，SCXK-(軍)2007-004)，每組用20只小鼠。對免疫組小鼠進 行初次免疫，即將PBS稀釋的由實施例1得到的純化的mATAO50 μ g/ml，每只小鼠100 μ 1) 與等量鋁佐劑Lnject Alum (Thermo Scientific公司，77161)充分混合后，每只小鼠注射 200 μ 1 (分別采用皮下和肌肉兩種免疫方式)，一周后尾靜脈取血，37°C孵育池后，6000r/ min離心15min留取血清備用。初免兩周后，再進行兩次加強免疫，間隔兩周，每次免疫后一 周均按前述方法取血留血清進行間接ELISA法檢測效價。免疫鼠血清效價采用間接ELISA法測定，具體方法如下將定量后的純化的mATA 用包被液稀釋至5ug/ml，4°C過夜包被酶聯(lián)板；次日倒掉包被液，以洗滌液洗板3次，2min/ 次；然后加封閉液封閉Ih ;lh后再洗板3次，加入免疫鼠血清(一抗，用稀釋液按照1 10， 1 IO2,1 IO3,1 IO4,1 IO5,1 IO6,1 IO7,1 IO8 稀釋)，作用 Ih ； Ih 后先洗板， 再加入辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(美國santa Cruz公司，觀_230幻(二抗，用稀釋液按 1 5000稀釋)，作用Ih后；依次加入顯色液A、B，顯色5min后加終止液QMH2SO4)，在酶 聯(lián)儀檢測0D450。以 PBS 溶液(0. 01mol/L, ρΗ7· 2，每 IL 溶液含 Nei2HPO4 · 12H20 2. 86g, NaH2PO4 · 2H200. 312g，NaCl 8. 5g)進行注射作為對照。實驗重復三次，結(jié)果取平均值。mATA三免以后血清效價達到1 106。PBS溶液對照組三免以后ELISA檢測為陰性，無特異性抗體產(chǎn)生。(2)免疫小鼠血清的體內(nèi)中和作用改良寇氏法測定天然abrin小鼠LD50 0 BALB/c小鼠，雌性，20g/只，分為5組，每 組8只，其中一組注射PBS作為陰性對照，其余各組分別經(jīng)腹腔注射0. 1 μ g/ml,0. 2 μ g/ ml，0· 4 μ g/ml，0· 8 μ g/ml的天然abrin，觀察7天，記錄各組死亡率分別為0,0,0,87. 5%, 100%，應用公式 log LD50 = Xm-i ( Σ Ρ_0. 5)，計算出 LD5tl 為 7. 7μ g/kg。其中 最大劑 量組劑量的對數(shù)P:各組死亡率i:組間劑量比的對數(shù)η:每組動物數(shù)。20只ELISA抗體效價達1 IO6的免疫后小鼠，分成四組，每組5只，PBS免疫小 鼠為對照組。1-4組分別注Λ ILD50,4LD50,8LD50, IOLD50的純化的天然abrin (純化的天然 abrin對小鼠的腹腔注射LD5tl為7. 7 μ g/kg，小鼠的體重按22g/只計算)，注射體積用 PBS (0. 01mol/L, pH7. 2)稀釋為0. 5ml/只，注射后觀察10天，每天記錄小鼠體重變化和死
亡情況。攻毒后一周尾靜脈取血，采用上述的間接ELISA法測定抗體效價變化，結(jié)果如下 攻毒后一周，測定抗體效價，1-4組血清效價比攻毒前升高，均由1 IO6達到1 107。攻毒后10天，記錄小鼠體重，具體結(jié)果如下表1和圖6所示表1 mATA體內(nèi)中和實驗體重變化
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權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下1)或幻中任一所述的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)-3)中任一 所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表 達盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所 述編碼基因插入載體pET-His的多克隆位點間得到的重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權(quán)利要求4或5所述 重組載體導入宿主菌得到的重組菌。
7.擴增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或任一片段的引物對，所述引物對的一條引 物為序列3所示的DNA分子，另一條引物為序列4所示的DNA分子。
8.一種疫苗，它的活性成分為如下1)-3)中任一一種1)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)；2) 權(quán)利要求4或5所述的重組載體；幻權(quán)利要求4或6所述的重組菌。
9.權(quán)利要求1中所述蛋白質(zhì)在制備疫苗中的應用；權(quán)利要求2或3所述編碼基因在制 備疫苗中的應用；權(quán)利要求4或5所述重組載體在制備疫苗中的應用；權(quán)利要求4或6所述 重組菌在制備疫苗中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于所述疫苗為相思子毒素A鏈突變體疫
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與相思子毒素疫苗相關蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為mATA，是如下1)或2)中任一所述的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，經(jīng)過點突變獲得的突變體mATA，是通過重組表達得到的相思子毒素A鏈突變體蛋白，經(jīng)過檢測，其具有低毒性、無血管滲漏、有良好免疫原性等特點，可以作為候選疫苗抗原。
文檔編號C07K14/415GK102060920SQ20101055296
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者康琳, 王景林, 韓艷輝, 高姍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所