專利名稱：從發(fā)酵液中直接結(jié)晶制備L-精氨酸-α-酮戊二酸鹽的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種精氨酸-酮戊二酸鹽的制備技術(shù)。
背景技術(shù)：
L-精氨酸-α-酮戊二酸鹽，英文名稱為 L-Arginine-alpha-Ketoglutarate，簡(jiǎn)稱 AAKG，白色或淡黃色晶體，易溶于水、HCl和NaOH溶液，微溶于乙醇，不溶于丙酮、
乙醚等。L-精氨酸_ α -酮戊二酸鹽是目前國(guó)際市場(chǎng)上銷量日益增加的一種氨基酸鹽類保 健品，作為功能性營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和護(hù)肝藥物，主要用于體格增強(qiáng)補(bǔ)劑，促進(jìn)肌肉的快速增 長(zhǎng)和恢復(fù)，促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)和能量的吸收，維護(hù)肝功能正常等作用。其主要生理機(jī)制 在于AAKG物能夠在短期內(nèi)促進(jìn)一氧化氮的水平，促進(jìn)和擴(kuò)張肌肉運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)肌肉 的快速增長(zhǎng)和恢復(fù)，增強(qiáng)力量和精力。
AAKG有1 1和2 1 (L-精氨酸α -酮戊二酸)兩種配比的鹽，即單精氨酸酮戊 二酸鹽(MAAKG)和雙精氨酸酮戊二酸鹽(DAAKG)，兩種AAKG理化性質(zhì)接近， 但功能和應(yīng)用領(lǐng)域上也有一定差異。MAAKG主要作用是增加血液的一氧化氮水平， 刺激血管舒張，促進(jìn)訓(xùn)練后的肌肉生長(zhǎng)，作為保健品運(yùn)動(dòng)強(qiáng)壯劑在美國(guó)市場(chǎng)上很受青睞 (http://www.mims.com/)。DAAKG是一種擁有多種生理作用的有機(jī)酸鹽，對(duì)肝硬化 病人給予高劑量的DAAKG，其肝臟脫毒功能得到增強(qiáng)，血漿氨、血清酚濃度得到顯著 降低，其氧化分解作用得到增強(qiáng)。這種作用在治療氨中毒或用于強(qiáng)化肝臟解毒功能的動(dòng) 物模型試驗(yàn)中也得到證明，治療組的存活率相對(duì)于控制組較高，而且較少出現(xiàn)昏迷。法 國(guó)瑞法蘭藥廠的DAAKG護(hù)肝藥物Euligen (商品名優(yōu)力康)，已在藥理分析、毒理學(xué)鑒 定、動(dòng)物肝組織再生、動(dòng)物體內(nèi)解毒等的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了一系列的臨床研究，證明 了 DAAKG在肝臟疾病及其并發(fā)癥，酒精中毒及其并發(fā)癥等方面有顯著療效。早在1977年就有研究報(bào)道，給予肝硬化病人高劑量的精氨酸α-酮戊二酸，能增 強(qiáng)他們的肝臟解毒能力(Muting et al. Munch Med Wochenschr, 1977)。 目前，關(guān)于AAKG 的臨床應(yīng)用和代謝機(jī)制的研究不斷深入。美國(guó)專利USP 2005/0085498 Al介紹，動(dòng)物實(shí) 驗(yàn)表明，補(bǔ)充AAKG可以增長(zhǎng)骨骼肌中精氨酸和谷氨酰胺的水平，同時(shí)起到刺激免疫系 統(tǒng)功能的作用。一項(xiàng)針對(duì)兒童補(bǔ)充AAKG (15g/d)的研究還顯示，AAKG能夠提升合 成生長(zhǎng)素的水平、促進(jìn)包括胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFl)、谷氨酰胺及谷氨酸鹽等氨基酸代 謝作用，補(bǔ)充5個(gè)月后在增長(zhǎng)速率提高顯著。同樣，AAKG能夠促進(jìn)術(shù)后病人的生長(zhǎng)素 和胰島素的分泌，其中間代謝產(chǎn)物谷氨酰胺和脯氨酸也可以促進(jìn)創(chuàng)傷復(fù)愈。在一項(xiàng)針對(duì) AAKG抗分解代謝的研究中，具有高分解代謝和代謝增進(jìn)的14名多發(fā)性創(chuàng)傷病人參與了 實(shí)驗(yàn)，受試組每天給予AAKG 20g，顯示出在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化、胰島素、生長(zhǎng)素以及谷氨酰 胺、脯氨酸、精氨酸等自由氨基酸的血液水平方面同樣得到顯著的最高。另外針對(duì)健康 男性的研究表明，每天給予IOg的AAKG劑量，其胰島素水平升高20 30%，而單獨(dú)補(bǔ)充精氨酸或α-酮戊二酸的研究組別中未觀察到這種升高。體外細(xì)胞培養(yǎng)表明，AAKG 能夠顯著誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞的增長(zhǎng)，這種細(xì)胞與肌纖維細(xì)胞相似，其作用有顯著的量效 關(guān)系，而相應(yīng)的精氨酸或α _酮戊二酸沒有這種特性(USP 2005/0085498 Al)。此外，AAKG在水溶液中，可解離形成精氨酸和α-酮戊二酸，因而也可以作 為α-酮戊二酸或者精氨酸的供體，在某種情況下，作為精氨酸或α-酮戊二酸的替代品 進(jìn)行應(yīng)用。精氨酸是人體內(nèi)不可缺乏的條件性必需氨基酸和合成蛋白質(zhì)、肌酸的重要原 料，是生物體尿素循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，也是一氧化氮的前導(dǎo)物。而α-酮戊二酸 對(duì)蛋白質(zhì)的代謝有著很強(qiáng)的調(diào)控作用，并是推動(dòng)三羧酸循環(huán)的重要物質(zhì)和產(chǎn)能載體。(美 國(guó)專利 USP 7645742; USP 6905707 ； USP 7,645,742)
在AAKG的生產(chǎn)上，主要有三種方式一是直接混合法，即按照摩爾比分稱取L-精 氨酸、α-酮戊二酸，以1:1或者2:1進(jìn)行混合。這種產(chǎn)品是精氨酸和酮戊二酸的簡(jiǎn)單混 合，二者之間沒有鹽鍵結(jié)合，產(chǎn)品質(zhì)量受原料的品質(zhì)、混合的均勻度影響較大，一般藥 品或食品生產(chǎn)不采用該法；二是溶解_凍干法，分別配制一定濃度的L-精氨酸、α -酮 戊二酸溶液，按照一定的摩爾比進(jìn)行混合，再將溶液進(jìn)行冷凍干燥成為AAKG，該法中 兩種物質(zhì)形成穩(wěn)定的有機(jī)酸鹽，但凍干過程能耗大，一般只適合于AAKG注射劑生產(chǎn)； 中國(guó)專利 200710063477.4, 200710063478.9, 200710063479.3 均涉及了上述兩種方法。三是 結(jié)晶法，是在溶液混合后，對(duì)溶液進(jìn)行濃縮或加入有機(jī)溶劑，降低AAKG的溶解度，析 出AAKG結(jié)晶，經(jīng)洗滌干燥后獲得AAKG產(chǎn)品，該法制備的產(chǎn)品純度高，產(chǎn)品質(zhì)量能夠 保證，但過程復(fù)雜，成本也偏高(CN 101591271A)。上述三種方法制備AAKG所需的L-精氨酸和α -酮戊二酸，都必須達(dá)到原料藥 的指標(biāo)要求，尤其是前兩種方法，制備過程不能夠去除原料帶入的雜質(zhì)，因而對(duì)產(chǎn)品的 質(zhì)控提出較高的要求。而結(jié)晶方法的生產(chǎn)過程，成為制備AAKG的優(yōu)選方法。CN101591271A描述了 L-精氨酸α -酮戊二酸鹽結(jié)晶制備方法，采用市購(gòu)L-精 氨酸和α-酮戊二酸原料配制溶液混合結(jié)晶制備，眾所周知目前市場(chǎng)銷售的L-精氨酸是 從毛發(fā)(一般為豬毛、人發(fā))酸水解提取分離而得，α-酮戊二酸是石油基原料化學(xué)合 成產(chǎn)品。這兩種原料來源都存在有生物安全的疑慮。L-精氨酸和α-酮戊二酸，又如 CN101011372A所描述的，由市售化學(xué)合成品、毛發(fā)提取物原料來源的α -酮戊二酸-精 氨酸鹽制劑作為原料藥，但藥物原料不一定適宜于保健食品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為克服上述AAKG產(chǎn)品及其制備工藝的缺點(diǎn)，提供了一種從 發(fā)酵來源的L-精氨酸、α-酮戊二酸原料制備AAKG的方法，并且是直接用發(fā)酵液中的 L-精氨酸與發(fā)酵液中的α-酮戊二酸作為制備AAKG的原料，而不是用其提取精制的結(jié) 晶制品。本發(fā)明，所需原料L-精氨酸和α-酮戊二酸是以植物來源的淀粉葡萄糖為碳 源，用非轉(zhuǎn)基因的野生型微生物進(jìn)行代謝發(fā)酵而得到的發(fā)酵產(chǎn)物，簡(jiǎn)稱發(fā)酵液，將發(fā)酵 液中的α-酮戊二酸與發(fā)酵液中的L-精氨酸按一定比例混合、螯合成鹽，利用通用的 化工分離技術(shù)單元和設(shè)備，直接結(jié)晶制備L-精氨酸-α-酮戊二酸鹽，制備的工藝包括 發(fā)酵液預(yù)處理、螯合、濃縮、結(jié)晶、溶解脫色、重結(jié)晶和晶體干燥等技術(shù)單元，L-精氨
5酸發(fā)酵液預(yù)處理，去除菌體和大分子雜質(zhì)，加入同步進(jìn)行凈化處理的一定量的α-酮戊 二酸發(fā)酵濾液進(jìn)行混合，即螯合，經(jīng)真空蒸發(fā)濃縮，再采用降溫結(jié)晶方式獲得L-精氨酸 α-酮戊二酸鹽的粗品，粗品經(jīng)溶解脫色，并進(jìn)行有機(jī)溶劑重結(jié)晶，最終經(jīng)干燥獲得高純 度的L-精氨酸α -酮戊二酸鹽。本發(fā)明，所述的發(fā)酵液預(yù)處理技術(shù)單元，是將L-精氨酸發(fā)酵液，或α-酮戊二 酸發(fā)酵液分別按照公知的方法進(jìn)行絮凝、過濾或離心，除去菌體和較大固體粒子，獲得 澄清濾液的過程。所述的絮凝操作是采用硫酸鋁、CaCl2、聚丙烯酰胺、殼聚糖等絮凝劑 或其他無機(jī)鋁鹽、鐵鹽、鈣鹽、高分子絮凝劑。所述過濾操作，是采用板框過濾、真空 過濾或帶式過濾等設(shè)備進(jìn)行過濾，尤其適合規(guī)?；苽涔に嚕凰龅碾x心操作是采用離 心分離設(shè)備進(jìn)行固液分離，尤其適合小試制備過程。本發(fā)明，所述的螯合技術(shù)單元，是根據(jù)濾液中L-精氨酸的含量，加入一定量的 α-酮戊二酸發(fā)酵液，或α-酮戊二酸溶液進(jìn)行反應(yīng)的過程。α-酮戊二酸的加入摩爾含 量，是體系中L-精氨酸摩爾量的0.3 1.5倍。本發(fā)明，所述的濃縮技術(shù)單元，是對(duì)含有L-精氨酸、α-酮戊二酸的溶液進(jìn)行 濃縮的過程，使AAKG達(dá)到過飽和狀態(tài)。優(yōu)選的濃縮設(shè)備是真空濃縮、二效濃縮或多效 濃縮裝備，溶液濃縮到L-精氨酸原溶液體積的15% 50%。本發(fā)明，所述的結(jié)晶技術(shù)單元，是將濃縮液放置在溫度_5°C 15°C下進(jìn)行結(jié) 晶，或使用結(jié)晶鍋，通過冷卻液進(jìn)行溶液冷卻，結(jié)晶過程控制在4 50 h。結(jié)束后采用 過濾或離心收集晶體。本發(fā)明，所述的溶解脫色技術(shù)單元，是將上述晶體重新溶解在2 5倍重量份 的去離子水中，攪拌使其充分溶解后，加入顆?；钚蕴歼M(jìn)行脫色。活性碳加入量相當(dāng)于 AAKG晶體質(zhì)量的0.5% 3.0%，攪拌并將溶液加熱至40 90°C，并維持20 60分鐘， 再通過板框過濾，收集AAKG濾液。本發(fā)明，所述的重結(jié)晶技術(shù)單元，是在上述AAKG濾液中，緩慢加入溶液體積 的1 4倍的親水性有機(jī)溶劑，室溫或冰箱靜置8 50 h進(jìn)行重結(jié)晶，采用過濾收集晶 體，并以少量的冷的新鮮溶劑洗滌2 3次。所述的親水性有機(jī)溶劑，包括乙醇、甲醇、 丙酮、異丙醇、甘油、乙腈等，其中優(yōu)選的溶劑為乙醇或丙酮。本發(fā)明，所述的晶體干燥技術(shù)單元，是采用真空干燥、熱風(fēng)循環(huán)烘箱或氣流干 燥等設(shè)備進(jìn)行晶體干燥，其干燥溫度50°C 150°C。本發(fā)明，所述發(fā)酵液預(yù)處理、螯合、濃縮、結(jié)晶、溶解脫色、重結(jié)晶、晶體干 燥等技術(shù)單元，可適當(dāng)進(jìn)行增加、減少、調(diào)整或組合。本發(fā)明制備AAKG的原料L-精氨酸、α-酮戊二酸，都是發(fā)酵來源產(chǎn)品， 以植物來源的淀粉葡萄糖為碳源，用非轉(zhuǎn)基因微生物(自行篩選改良的野生菌，CN 03112896.3； CN 200310106298.6)進(jìn)行代謝發(fā)酵，得到的發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-精氨酸或α -酮 戊二酸純度高、質(zhì)量穩(wěn)定。更重要的是，非毛發(fā)來源氨基酸、非石油基原料化學(xué)合成來 源的α-酮戊二酸制備的AAKG，用于保健食品等，不存在有生物安全和食品安全的疑慮。 本發(fā)明直接用發(fā)酵液中的L-精氨酸與發(fā)酵液中α-酮戊二酸作為AAKG的原 料L-精氨酸、α-酮戊二酸，而不是用其結(jié)晶制品。這可以避免與發(fā)酵法精制精氨酸或α-酮戊二酸的后提取有較多的重復(fù)操作。從發(fā)酵液中提取L-精氨酸或α-酮戊二酸一 般都需要采用絮凝、過濾、樹脂吸附、洗脫、濃縮、結(jié)晶、干燥等步驟進(jìn)行制備。本發(fā) 明直接用發(fā)酵液按一定比例混合(螯合)、濃縮結(jié)晶制備，能夠?qū)-精氨酸或α-酮戊 二酸的生產(chǎn)過程、AAKG的制備過程進(jìn)行銜接和改進(jìn)，能夠有縮短生產(chǎn)環(huán)節(jié)、降低生產(chǎn) 成本、提高質(zhì)控水平等良好效果。本發(fā)明提供的直接從發(fā)酵液制備AAKG結(jié)晶的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，還具有 如下顯著的優(yōu)點(diǎn)(1)直接從L-精氨酸發(fā)酵液和α-酮戊二酸發(fā)酵液進(jìn)行制備，將 AAKG的生產(chǎn)有機(jī)整合到發(fā)酵產(chǎn)物的后提取過程，因而整體流程縮短，生產(chǎn)成本顯著降 低；(2)去除了發(fā)酵精氨酸和發(fā)酵α-酮戊二酸制備過程中的精制步驟，減少了能耗物 耗和廢水生成量；(3)工藝具有較大的靈活性，通過參數(shù)的適當(dāng)調(diào)整，可實(shí)現(xiàn)兩種或 多種配比的AAKG生產(chǎn)；(4)產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，采用低溫結(jié)晶、有機(jī)溶劑重結(jié)晶工 藝，并利用活性碳進(jìn)行脫色，能夠有效保證AAKG的純度。


圖1為實(shí)施例L-精氨酸α -酮戊二酸鹽HPLC分析圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種以植物來源的淀粉葡萄糖為碳源，用非轉(zhuǎn)基因菌株進(jìn)行微生 物代謝發(fā)酵(分別參考專利CN 03112896.3方法和專利CN 200310106298.6方法)，得到 含L-精氨酸或含α-酮戊二酸的代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，并從其發(fā)酵液中直接制備L-精氨 酸-α-酮戊二酸鹽結(jié)晶的工藝，主要由發(fā)酵液預(yù)處理、螯合、濃縮、結(jié)晶、溶解脫色、 重結(jié)晶、晶體干燥等技術(shù)單元構(gòu)成?，F(xiàn)從技術(shù)優(yōu)化、提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低技術(shù)成本角 度，對(duì)發(fā)明內(nèi)容提出的技術(shù)參數(shù)進(jìn)行說明。發(fā)酵液預(yù)處理單元目的是去除除去菌體和較大固體粒子，通過添加絮凝劑，能 夠進(jìn)一步降低發(fā)酵液中大分子物質(zhì)的含量，CaCl2絮凝一般可以達(dá)到良好的絮凝效果。在 規(guī)?；苽涔に囍?，過濾操作可以選擇板框過濾、真空過濾或帶式過濾等設(shè)備，在小試 工藝中，可以采用離心機(jī)進(jìn)行固液分離。酸化之前，應(yīng)分別測(cè)定兩種發(fā)酵濾液中L-精氨酸和α-酮戊二酸的含量，通常 情況下，發(fā)酵液中L-精氨酸含量在4% 6% (質(zhì)量體積百分比，后同)，α-酮戊二酸 含量在3% 4%。應(yīng)根據(jù)制備目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行優(yōu)化，制備MAAKG時(shí)，加入的α-酮戊二酸 摩爾量，應(yīng)為L(zhǎng)-精氨酸的摩爾量的0.8 1.5，優(yōu)化的范圍在0.95 1.05。制備DAAKG 時(shí)，加入的α-酮戊二酸摩爾量，應(yīng)為L(zhǎng)-精氨酸的摩爾量的0.2 0.8，優(yōu)化的范圍在 0.35 0.55。對(duì)含有L-精氨酸、α-酮戊二酸的混合溶液進(jìn)行濃縮，使AAKG達(dá)到過飽和狀 態(tài)，理想的濃縮設(shè)備應(yīng)該選擇真空濃縮方式，多效真空濃縮裝置更適合較大規(guī)模的制備 過程，小試制備適宜采用薄膜濃縮或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。以混合之前的L-精氨酸和α-酮戊二 酸原溶液體積為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)濃縮到該體積的15% 50%，適宜的濃縮體積是20% 25%， 濃縮量較大，結(jié)晶回收率較高，但純度較低；濃縮量較小，則晶體析出量較少，結(jié)晶操 作時(shí)間需要適度延長(zhǎng)，但析出的晶體純度一般較高。
此外，螯合操作還可以調(diào)整到濃縮操作后進(jìn)行，但應(yīng)避免在濃縮完成后，因加 入α-酮戊二酸溶液而使體系體積變多。結(jié)晶的適宜溫度在_5°C 15°C，優(yōu)選溫度為5°C 10°C。在大生產(chǎn)中采用結(jié)晶 鍋操作，通過冷卻液進(jìn)行體系降溫時(shí)，應(yīng)控制降溫速率，優(yōu)選的降溫速率在2°C 5°C/ ho 結(jié)晶時(shí)間控制在4 50 h，優(yōu)選的時(shí)間是20 30h。晶體重新溶解在2 5倍質(zhì)量體積的去離子水中，優(yōu)選為3倍體積水；加入顆 ?；钚蕴嫉牧浚瑧?yīng)根據(jù)晶體純度適度調(diào)整，優(yōu)選的加入量為0.5% 1.5%，適宜的脫色溫 度60°C 90°C，維持30 60min較為適宜，再通過板框過濾，收集濾液，在小批量生產(chǎn) 中，可以選擇離心或真空抽濾獲得AAKG濾液。重結(jié)晶采用有機(jī)溶劑體系進(jìn)行，優(yōu)選的溶劑為乙醇或丙酮，優(yōu)選的加入體積為 2倍，重結(jié)晶時(shí)間8 30 h，晶體析出后，過濾獲得晶體，并以少量的冷的新鮮溶劑洗 滌2 3次，一般為50%以上的乙醇或丙酮，洗滌溶劑應(yīng)先行預(yù)冷至結(jié)晶溫度(5°C IO0C)，以降低對(duì)AAKG的溶解度。重結(jié)晶操作也可以不使用有機(jī)溶劑，直接在水相中進(jìn)行重結(jié)晶，也可以使 AAKG的純度適當(dāng)提高，可以根據(jù)產(chǎn)品的質(zhì)量指標(biāo)要求確定。采用水相進(jìn)行重結(jié)晶，晶 體溶解使用2倍質(zhì)量體積水，可適度加熱提高溶解速度。一般采用真空干燥進(jìn)行晶體干燥，溫度60°C 90°C，優(yōu)選為70°C 75°C，大規(guī) 模生產(chǎn)可以采用其氣流干燥設(shè)備。本發(fā)明內(nèi)容未對(duì)母液處理和溶劑回收進(jìn)行規(guī)定，具體實(shí)施階段可采用本領(lǐng)域通 用的或改進(jìn)的措施，以提高產(chǎn)率，減少排放。為進(jìn)一步闡述本發(fā)明的工藝思想，現(xiàn)通過具體實(shí)施案例予以說明。實(shí)施案例一單精氨酸酮戊二酸MAAKG的制備
在5 L精氨酸發(fā)酵液中加入CaCl2粉末25g，攪拌使之充分溶解，靜置2h，再通過大 容量離心機(jī)(SOOOr/min，10 min)分批離心，收集濾液得4.6 L。經(jīng)測(cè)定其中L-精氨 酸含量為45.0 g/L，計(jì)算出溶液中共含有L-精氨酸1.19 moL按類似的方法將α -酮戊 二酸發(fā)酵濾清液進(jìn)行預(yù)處理，并計(jì)算mol量。按照mol比L-精氨酸α -酮戊二酸=1 1計(jì)算，攪拌情況下，緩慢添加α -酮 戊二酸發(fā)酵濾清液到L-精氨酸發(fā)酵濾清液中，使之完全混合。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行混合 液濃縮，水浴溫度65°C，獲得濃縮液1200 mL，為混合前L-精氨酸和α -酮戊二酸發(fā)酵 濾清液的26.1%。放入5°C冰柜，靜置20h，溶液中有大量晶體析出。通過真空抽濾，收集粗品結(jié)晶物272.3 g (干重)，計(jì)算回收率為71.5%，通過 HPLC測(cè)定，粗品純度為92.0% (不含結(jié)晶水，下同)，L-精氨酸α-酮戊二酸摩爾 比為 1 1.11。取粗品270 g溶解在500mL去離子水中(粗品質(zhì)量體積的2.5倍水)，按照粗品 質(zhì)量的0.5%加入粉末活性炭(100目)，攪拌脫色，并升溫至701保持401^11。然后真 空抽濾，去除活性炭。待濾液冷卻至室溫后，緩慢加入3倍體積的乙醇，室內(nèi)放置50 h進(jìn)行重結(jié)晶。 真空抽濾收集晶體，并以85% (體積百分比)乙醇10 15 mL淋洗結(jié)晶3次，繼續(xù)抽干 20 min 30 min。轉(zhuǎn)移結(jié)晶物至表面皿，置入真空干燥箱，70°C干燥48h。
干燥后重結(jié)晶產(chǎn)品質(zhì)量239.6g，HPLC測(cè)定的產(chǎn)品純度為99.2%，其中L-精氨 酸α -酮戊二酸摩爾比為1:1.06。重結(jié)晶收率達(dá)到88.0%，AAKG總收率為62.9%。實(shí)施案例二雙精氨酸酮戊二酸DAAKG的制備
在5 L精氨酸發(fā)酵液中加入1.0%殼聚糖鹽酸(1.0%)溶液25mL，攪拌并靜置1.0 h，真空抽濾，收集濾液得4.2 L。經(jīng)測(cè)定其中L-精氨酸含量為52.0 g/L，計(jì)算出溶液中 共含有L-精氨酸1.25 moL α -酮戊二酸發(fā)酵按同樣方法獲取發(fā)酵濾液。取含91.6 g α-酮戊二酸的發(fā)酵濾液(按照L_精氨酸α -酮戊二酸=1 0.5摩 爾比添加)，攪拌情況下，緩慢加入到L-精氨酸發(fā)酵液中，使之完全混合。采用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀進(jìn)行混合液濃縮，水浴溫度65°C，獲得濃縮液1680 mL，相對(duì)于混合前L-精氨酸和 α-酮戊二酸發(fā)酵濾清液的40%。放入0°C冰箱，靜置48h，溶液中有晶體析出。真空抽濾收集粗品結(jié)晶物，折合干重為190.3 g (干重)，計(jì)算回收率為61.4%， 通過HPLC測(cè)定，粗品純度為88.6%, L-精氨酸α -酮戊二酸摩爾比為1.92 1。取粗品185 g溶解在370 mL去離子水中(粗品質(zhì)量體積的2.0倍水)，按照粗品 質(zhì)量的0.5%加入粉末活性炭(100目)，攪拌脫色，并升溫至70°C保持40min。然后真 空抽濾，去除活性炭，濾液350 mL。待濾液冷卻至室溫后，緩慢加入1400 mL丙酮(濾液體積的4倍)，0°C冰箱下 放置8h，待結(jié)晶析出后，真空抽濾收集晶體，并以0°C冷丙酮10 15 mL淋洗結(jié)晶3 次，繼續(xù)抽干20min 30min。轉(zhuǎn)移結(jié)晶物至表面皿，置入真空干燥箱，70°C干燥24h 為DAAKG產(chǎn)品。重結(jié)晶產(chǎn)品質(zhì)量165.1g，HPLC測(cè)定的產(chǎn)品純度為98.7%，其中L-精氨酸 α -酮戊二酸摩爾比為1.99 1。重結(jié)晶收率達(dá)到86.7%，AAKG總收率為53.3%。實(shí)施案例三中試規(guī)模下的AAKG制備技術(shù)
L-精氨酸發(fā)酵液5 Μ3，精氨酸含量為48 g/L。加入CaCl2粉末25 kg，攪拌使之充 分溶解，靜置2h，采用板框過濾設(shè)備(過濾面積約25.0 m2)進(jìn)行過濾，并對(duì)濾渣進(jìn)行洗 滌。收集澄清濾液4350 L。用于與精氨酸成鹽反應(yīng)的α-酮戊二酸也采用發(fā)酵液，其預(yù)處理過程與L-精氨 酸相似，澄清濾液中α-酮戊二酸含量為39.2 g/L。以生產(chǎn)MAAKG為例，按照L-精氨酸α -酮戊二酸=1 1摩爾比添加，將 α-酮戊二酸發(fā)酵濾清液加入到L-精氨酸濾清液中，攪拌均勻，混合發(fā)酵液共8.82 Μ3。采用二效真空濃縮設(shè)備，濃縮至1500 L，濃縮液量為原L-精氨酸濾液和α-酮 戊二酸濾液混合液體積的34.5%。使用結(jié)晶鍋對(duì)上述濃縮液進(jìn)行結(jié)晶，通入冷卻水，當(dāng)濾液溫度冷至30°C時(shí)，控 制冷卻速率，以每小時(shí)2°C速率緩慢降溫至5°C，結(jié)晶鍋攪拌速率10 15r/min，養(yǎng)晶時(shí) 間10h。采用板框過濾，分離粗晶體。粗晶體折合干重342.7Kg，粗品純度為88.6%， 其回收率為79.1%。粗品復(fù)溶于600 L去離子水中，加入粉末活性炭(100目)1500 g，攪拌并升溫 至70°C脫色60min，板框過濾去除活性炭，濾液裝入結(jié)晶罐，通冷凝水冷卻至室溫，緩 慢加入1800 L 96% (ν/ν)乙醇。通冷卻水降溫至15°C，靜置12 h待結(jié)晶析出。真空 抽濾，并以96% (ν/ν)乙醇洗滌結(jié)晶，真空下抽干，結(jié)晶物于50°C干燥。獲得重結(jié)晶AAKG 222.4 kg。上述工藝為MAAKG的制備工藝，產(chǎn)品總收率約為57.3%，產(chǎn)品純度>99.0%。 若母液經(jīng)處理回用，實(shí)際收率在70%以上。實(shí)施案例四α-酮戊二酸加入量對(duì)結(jié)晶產(chǎn)品純度和產(chǎn)率的影響
為研究α-酮戊二酸加入量對(duì)結(jié)晶產(chǎn)品純度和產(chǎn)率的影響，分別取IOOmL L-精氨 酸濾液，加入不同量的α-酮戊二酸，按“實(shí)施案例一”中濃縮和結(jié)晶方法操作，通過 HPLC測(cè)定，各批次MAAKG純度及產(chǎn)率如下。表1 α -酮戊二酸加入比例對(duì)結(jié)晶產(chǎn)率和純度的影響
權(quán)利要求
1.一種從發(fā)酵液中直接結(jié)晶制備L-精氨酸_ α “酮戊二酸鹽的工藝，其特征在于 所需原料L-精氨酸和α-酮戊二酸是以植物來源的淀粉葡萄糖為碳源，用非轉(zhuǎn)基因的 野生型微生物進(jìn)行代謝發(fā)酵而得到的發(fā)酵產(chǎn)物，簡(jiǎn)稱發(fā)酵液，制備的工藝包括發(fā)酵液預(yù) 處理、螯合、濃縮、結(jié)晶、溶解脫色、重結(jié)晶和晶體干燥，L-精氨酸發(fā)酵液預(yù)處理，去 除菌體和大分子雜質(zhì)，加入同步進(jìn)行凈化處理的一定量的α-酮戊二酸發(fā)酵濾液進(jìn)行混 合，即螯合，經(jīng)真空蒸發(fā)濃縮，再采用降溫結(jié)晶方式獲得L-精氨酸α-酮戊二酸鹽的 粗品，粗品經(jīng)溶解脫色，并進(jìn)行有機(jī)溶劑重結(jié)晶，最終經(jīng)干燥獲得高純度的L-精氨酸 α-酮戊二酸鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中直接結(jié)晶制備L-精氨酸_α -酮戊二酸鹽的工 藝，其特征在于所述的發(fā)酵液預(yù)處理工藝是將L-精氨酸發(fā)酵液和α-酮戊二酸發(fā)酵液 分別進(jìn)行絮凝、過濾或離心，除去菌體和較大固體粒子，獲得L-精氨酸和α _酮戊二酸 澄清發(fā)酵濾液的過程，所述的絮凝操作是采用硫酸鋁、氯化鈣、聚丙烯酰胺、殼聚糖等 絮凝劑或其他商品化的無機(jī)鋁鹽、鐵鹽、鈣鹽、高分子絮凝劑；所述的過濾操作，是采 用板框過濾、真空過濾或帶式過濾等設(shè)備進(jìn)行過濾，尤其適合規(guī)?；苽涔に?；所述的 離心操作是采用離心分離設(shè)備進(jìn)行固液分離，尤其適合小試制備過程。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中直接結(jié)晶制備L-精氨酸_α -酮戊二酸鹽的 工藝，其特征在于所述的螯合工藝，是根據(jù)濾液中L-精氨酸的含量，加入一定量的 α -酮戊二酸發(fā)酵濾液，或α -酮戊二酸溶液進(jìn)行螯合反應(yīng)的過程，α -酮戊二酸的加入 摩爾含量，是體系中L-精氨酸摩爾量的0.3 1.5倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中直接結(jié)晶制備L-精氨酸_α -酮戊二酸鹽的工 藝，其特征在于所述的濃縮工藝，是對(duì)含有L-精氨酸和α -酮戊二酸的螯合溶液進(jìn)行 濃縮的過程，使AAKG達(dá)到過飽和狀態(tài)，優(yōu)選的濃縮設(shè)備是真空濃縮、二效濃縮或三效 濃縮裝備，溶液濃縮到L-精氨酸和α -酮戊二酸原溶液混合液體積的15% 50%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中直接結(jié)晶制備L-精氨酸_α -酮戊二酸鹽的工 藝，其特征在于所述的結(jié)晶工藝，是將濃縮液放置在溫度_5°C 15°C下進(jìn)行結(jié)晶，或 使用結(jié)晶鍋，通過冷卻液進(jìn)行溶液冷卻，結(jié)晶過程控制在4 50 h，結(jié)束后采用過濾或離 心收集晶體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中直接結(jié)晶制備L-精氨酸_α -酮戊二酸鹽的工 藝，其特征在于所述的溶解脫色工藝，是將上述晶體重新溶解在2 5倍重量份的去離 子水中，攪拌使其充分溶解后，加入顆?；钚蕴歼M(jìn)行脫色，活性碳加入量相當(dāng)于AAKG 晶體質(zhì)量的0.5% 3.0%，攪拌并將溶液加熱至40 90°C，并維持20 60分鐘，再通 過板框過濾，收集AAKG濾液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中直接結(jié)晶制備L-精氨酸_α -酮戊二酸鹽的工 藝，其特征在于所述的重結(jié)晶工藝，是在上述AAKG濾液中，緩慢加入溶液體積的 1 4倍的親水性有機(jī)溶劑，室溫或降溫進(jìn)行重結(jié)晶8 50 h，過濾收集晶體，并以少量 溶劑洗滌2 3次，所述的親水性有機(jī)溶劑，包括乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇、甘油和乙 腈，其中優(yōu)選的溶劑為乙醇或丙酮。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中直接結(jié)晶制備L-精氨酸-α-酮戊二酸鹽的工 藝，其特征在于所述的晶體干燥工藝，是采用真空干燥、熱風(fēng)循環(huán)烘箱或氣流干燥設(shè)備進(jìn)行晶體干燥， 其干燥溫度50°C 150°C。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從發(fā)酵來源的L-精氨酸、α-酮戊二酸原料制備AAKG的方法，并且是直接用發(fā)酵液中的L-精氨酸與發(fā)酵液中α-酮戊二酸作為AAKG的原料，而不是用其提取精制的結(jié)晶制品。從發(fā)酵液中直接結(jié)晶制備L-精氨酸-α-酮戊二酸鹽(AAKG)的工藝，主要由發(fā)酵液預(yù)處理、螯合、濃縮、結(jié)晶、溶解脫色、重結(jié)晶、干燥等技術(shù)單元構(gòu)成。L-精氨酸發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理，加入一定量的α-酮戊二酸發(fā)酵濾液進(jìn)行螯合，經(jīng)真空蒸發(fā)濃縮，再采用降溫結(jié)晶獲得粗品，粗品經(jīng)有機(jī)溶劑重結(jié)晶獲得高純度的產(chǎn)品。本發(fā)明具有產(chǎn)品純度高、流程短、質(zhì)控容易、減排效果顯著等優(yōu)點(diǎn)。AAKG主要用于體格增強(qiáng)補(bǔ)劑，促進(jìn)肌肉的快速增長(zhǎng)和恢復(fù)，促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)和能量的吸收，維護(hù)肝功能正常等作用。
文檔編號(hào)C07C277/08GK102020593SQ201010565020
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者史勁松, 孫志浩, 方佳茂, 李少平, 許正宏, 陳偉濱 申請(qǐng)人:廣東環(huán)西生物科技股份有限公司