專利名稱：在結(jié)腸癌組織中高表達的標記物hccr-1蛋白及結(jié)腸癌預后標志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在結(jié)腸癌組織中高表達的標記蛋白及結(jié) 腸癌預后標志物，其中所述標志物包括HCCR-I蛋白。
背景技術(shù)：
大腸癌在我國的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，提高大腸癌長期生存率的關(guān) 鍵是準確地判斷預后并選擇合適的治療方法。結(jié)腸癌的預后與Dukes分期、分化程度及組 織類型等因素密切相關(guān)。結(jié)腸癌預后監(jiān)測中常用的腫瘤標志物包括ras、p53、bcl-2基因 等，這些基因的突變或過表達對患者預后情況的判斷和治療方案的選擇均有重要意義。然 而由于腫瘤的轉(zhuǎn)移涉及很多復雜步驟，因此僅采用上述因素進行預后評估仍不準確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是解決采用現(xiàn)有結(jié)腸癌預后監(jiān)測中常用的腫瘤標志物進行預后評估 仍不準確的問題，提供一種新的在結(jié)腸癌組織中高表達的標記物HCCR-I蛋白及結(jié)腸癌預 后標志物。本發(fā)明首先提供了一種在結(jié)腸癌組織中高表達的標記物HCCR-I蛋白，該蛋白是 編碼為序列表SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成的蛋白。所述的標記物還可以是以上所限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或 幾個氨基酸且具有在結(jié)腸癌組織中高表達活性的蛋白及其片段。其次，本發(fā)明還提供了一種結(jié)腸癌預后標志物，該標志物包含以上所述的在結(jié)腸 癌組織中高表達的標記物HCCR-I蛋白。此外，所述的標志物還包括選自但不限于EGFR、VEGF, C0X-2基因型或蛋白的一種 或多種藥劑。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果
HCCR-I與腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移與侵襲密切相關(guān)，使用HCCR-I作為聯(lián)合診斷的指標之一，可 以提高診斷敏感性，減少漏診率，作為預后指標及判斷結(jié)腸癌病情發(fā)展的參考。


圖1是結(jié)腸癌、癌旁及正常組織中HCCR-I mRNA的含量示意圖，其中，
M =Marker ；1 正常組織；2 癌旁組織；3，4，5 結(jié)腸癌組織；A β-actin引物擴增結(jié) 果；B =HCCR-I引物擴增結(jié)果。 圖2是HCCR-I在結(jié)腸癌、癌旁、正常組織中的表達， 1,2 正常組織；3，4 癌旁組織；5，6，7 結(jié)腸癌組織。圖3是HCCR-I在正常結(jié)腸組織(左)及結(jié)腸癌組織(右)中的表達(DAB，X400)。
具體實施方式
實施例1、HCCR-I蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達的測定 其中，HCCR-I抗體于北京博奧森公司購買。本發(fā)明使用RT-PCR、Western blot及免疫組化對HCCR-I在基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達水 平上進行了檢測分析。通過HCCR-I的表達與結(jié)腸癌Dukes分期、分化程度和組織類型的相 關(guān)性證實HCCR-I作為結(jié)腸癌的預后因子的價值。為了解HCCR-I在結(jié)腸癌組織中的表達情況，本發(fā)明根據(jù)引物設(shè)計原 貝丨J，利用Primer premier 5. 0軟件設(shè)計引物，序列如下。HCCR-I上游引物 5，-AATGTACCTGTTTCCCAG-3，；下游引物5，-CAGGACCACGTTGTGCAG-3，。陽性對照 β-actin 上游引物5，-GTGGG GCGCC CCAGG CACCA-3，；下游引物5，-CTTCC TTAAT GTCAC GCACG ATTTC-3’。TRIzoI法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度后，使用相同量的RNA 作RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果，如圖1所示。通過對瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進行分析， HCCR-I的mRNA在結(jié)腸癌組織中含量明顯高于癌旁組織和正常組織。圖1顯示了測定結(jié)腸癌、癌旁及正常組織中HCCR-I mRNA的含量。所測組織為人 正常組織和癌組織。使用TRIzoI法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度后，使用 相同量的RNA作RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。圖1結(jié)果表明，HCCR-I的mRNA在結(jié)腸 癌組織中含量明顯高于癌旁組織和正常組織。在蛋白表達水平上，本發(fā)明使用Western blot方法檢測HCCR-I在結(jié)腸癌組織中 的表達情況，使用蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑(cocktail，Roche公司)以5g/L比例提取組 織蛋白并測定濃度，以100 g/L作聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后轉(zhuǎn)膜，封閉，加入HCCR-I抗體 4 °C溫育過夜，TBST清洗3次后，加入HRP標記羊抗兔二抗，室溫溫育2 h，之后使用ECL發(fā) 光液進行反應(yīng)，暗室曝光。使用β-actin抗體作為陽性對照。如圖2所示，Western blot 結(jié)果表明，HCCR-I蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達，癌旁組織低表達，正常組織基本無表達。圖2顯示了 Western blot檢測HCCR-I在結(jié)腸癌、癌旁、正常組織中的蛋白表達情 況。從左至右編號依次為1，2 正常組織；3，4 癌旁組織；5，6，7 結(jié)腸癌組織，使用HCCR-I 抗體檢測HCCR-I的表達情況，同時使用β-actin抗體作為陽性對照。從圖2可以看出，在 β -actin抗體檢測結(jié)果基本相同情況下，HCCR-I抗體檢測結(jié)果，結(jié)腸癌組織信號明顯強于 癌旁組織，而正常組織則無信號。因此，使用Western blot檢測得出，HCCR-I蛋白在結(jié)腸 癌組織中高表達，癌旁組織低表達，正常組織基本無表達。免疫組化采用SABC-POD法切片常規(guī)脫蠟，3%H202室溫靜置10 min以滅活內(nèi)源性 過氧化物酶，使用PH=6. O的0. 01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液熱修復抗原，5% BSA室溫封閉20 min，l 300稀釋度加入HCCR抗體，4 °C過夜，加入Bio-羊抗兔IgG室溫溫育30 min，加 入SABC-POD工作液室溫溫育30 min,上述各步驟間均以PBS緩沖液洗滌15 min。之后DAB 染色，逐級脫水、透明、封片。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。分析了 84例結(jié)腸癌組 織、癌旁組織及正常組織中HCCR-I的表達情況，HCCR-I在組織中為胞質(zhì)表達，如圖3所示。 其中癌組織表達陽性率為81% (68/84)，而癌旁組織表達陽性率為38% (32/84)，正常組織 表達陽性率為13%(2/15)，HCCR-1在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng) 計學意義(x2=15. 129，Ρ<0· 01)。本發(fā)明將HCCR-I的免疫組化檢測結(jié)果與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系作分析，如表1所示。HCCR-I在結(jié)腸癌組織中的表達與年齡、性別、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小無關(guān)，而 與Duke’ s分期、分化程度和組織類型有關(guān)。
表 權(quán)利要求
1.一種在結(jié)腸癌組織中高表達的標記物HCCR-I蛋白，是編碼為序列表SEQ ID N0:1所 示的氨基酸序列組成的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標記物，其特征在于是權(quán)利要求1所限定的氨基酸序列中 經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有在結(jié)腸癌組織中高表達活性的蛋白及其片 段。
3.一種結(jié)腸癌預后標志物，其特征在于該標志物是包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述 的標記物的組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的標志物，其特征在于所述的標志物還包括EGFR、VEGF,C0X-2 基因型或蛋白的一種或多種藥劑。
全文摘要
一種在結(jié)腸癌組織中高表達的標記物HCCR-1蛋白及結(jié)腸癌預后標志物。解決采用現(xiàn)有結(jié)腸癌預后監(jiān)測中常用的腫瘤標志物進行預后評估仍不準確的問題。本發(fā)明提供的在結(jié)腸癌組織中高表達的標記蛋白HCCR-1蛋白，是編碼為序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成的蛋白。該標記蛋白還可以是以上所限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有在結(jié)腸癌組織中高表達活性的蛋白及其片段。本發(fā)明還提供了一種結(jié)腸癌預后標志物，該標志物包括以上所述的在結(jié)腸癌組織中高表達的標記蛋白HCCR-1蛋白，以及該標志物還可以包括選自但不限于EGFR、VEGF、COX-2基因型或蛋白的一種或多種藥劑。
文檔編號C07K14/415GK102050872SQ20101056811
公開日2011年5月11日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者唐濤, 朱思偉, 王弋嘉 申請人:天津市人民醫(yī)院