專利名稱：人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165b與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備屬于長(zhǎng)效重組融 合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域涉及DNA重組技術(shù)，藥物蛋白與HSA的融合使得藥物成為長(zhǎng)效藥物。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelium growth factor，VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì) 胞的特異絲裂原，1989年由!^errara等在牛垂體濾泡星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離純化 出來的，具有細(xì)胞質(zhì)的鈣聚集作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管生成，增加血管通透 性，血管保護(hù)等生物學(xué)作用。人的VEGF基因位于染色體的6p21. 3，編碼VEGF的基因長(zhǎng)141Λ，由8個(gè)外顯子和 7個(gè)內(nèi)含子交替組成，分子量35 45kD。VEGF根據(jù)VEGFmRNA剪接方式不同分為多個(gè)變構(gòu) 體，有 VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189 和 VEGF206。VEGF165 以同源二聚體的 形式存在，糖基化的VEGF165 二聚體相對(duì)分子質(zhì)量約為45000，非糖基化的相對(duì)分子質(zhì)量約 為43000。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(VEGF16Q是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的腫瘤血管形成促進(jìn)劑之 一，具有促血管形成和增加血管通透性的雙重功能，在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。近來又發(fā)現(xiàn)一種內(nèi)源性剪接變構(gòu)體，即VEGF165b.其與VEGF165區(qū)別僅在于編碼 的末端六個(gè)氨基酸的差異。多存在于正常細(xì)胞、組織及血液循環(huán)中，尤其在具有高水壓傳導(dǎo) 性的組織如脈絡(luò)叢以及腎小囊足細(xì)胞中(目前所檢測(cè)的有前列腺癌及腎細(xì)胞癌)表達(dá)水平 卻很低，VEGFie^3能抑制VEGF165介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和在血管中遷移和血管舒張前的遷 移，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，將有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。在腫瘤的治療上，已有很多抗血管生成的藥物問世，包括反義寡核苷酸，可溶 性VEGF受體類似物，小分子VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑如STO416、SU11248, PTK787/ 3(222584等，但效果不是十分有效，并且其單克隆抗體常有免疫原性，而那些人工合成的小 分子物質(zhì)常存在不可預(yù)知的副作用，因此，VEGF165b作為內(nèi)源性抑制劑剪接變構(gòu)體在臨床 應(yīng)用上顯示出美好前景。由于hVEGF16^分子量非常小，體內(nèi)代謝速度相當(dāng)快，因此為了達(dá)到治療效果，需 要頻繁大劑量用藥。昂貴的價(jià)格和頻頻用藥造成的不便將嚴(yán)重限制了此種藥物的應(yīng)用。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是血漿中的主要蛋白成分，它除了具 有維持血漿滲透壓功能以外，還能擔(dān)當(dāng)許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體，從而調(diào)節(jié)激素活 性，所載物質(zhì)的毒性，以及藥物的利用度。成熟的HSA有585個(gè)氨基酸殘基組成，含有17對(duì) 二硫鍵，分子量約為66. 5KDa，如此大的分子量減小了它在內(nèi)循環(huán)時(shí)經(jīng)腎排泄的量，再正常 情況下，不易被腎小球慮過，血漿半衰期在20天左右。同時(shí)，HSA在人體內(nèi)沒有酶學(xué)和免疫 學(xué)活性，是一種理想的生物活性蛋白載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)內(nèi)容是提供hVEGF16^與HSA生理特性于一體的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子16 與人血清白蛋白的融合蛋白，該融合蛋白在保持了人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 生理 特性的基礎(chǔ)上，增加了作用位點(diǎn)，延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期，改善了溶解度，具有優(yōu)良的藥學(xué)特性。該融合蛋白的基因序列及氨基酸序列如前所述。本發(fā)明的技術(shù)方案在前期的研究中本實(shí)驗(yàn)室保藏了重組質(zhì)粒PIC9K_hVEGF165 以及pBluescript-HSA質(zhì)粒。pBluescript-HSA質(zhì)粒上只有一個(gè)Bsu3611酶切位點(diǎn)在HSA末 端，設(shè)計(jì)含有HSA Bsu361I酶切位點(diǎn)及下游表達(dá)區(qū)序列的hVEGF16^上游引物和含有NotI 酶切位點(diǎn)以及hVEGF16^3與hVEGF165不同的6個(gè)末端氨基酸對(duì)應(yīng)的堿基的下游引物，擴(kuò)增 得到hVEGF16^3基因，然后通過限制性雙酶切置入HSA下游，獲得HSA-hVEGF16^融合基 因，中間不含任何連接肽序列。將該融合基因插入到克隆載體，轉(zhuǎn)化到宿主系統(tǒng)，融合基因 就會(huì)整合到宿主的染色體中進(jìn)行表達(dá)。如此一來，我們制備的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 與人血清白蛋白的融合蛋白，包 括與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 至少85%序列同源的二聯(lián)體的第一區(qū)和與人血清白蛋白至 少85%序列同源的第二區(qū)；所述的與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 至少85%序列同源的二聯(lián) 體的第一區(qū)位于融合蛋白的C末端，與人血清白蛋白至少85%序列同源的第二區(qū)位于融合 蛋白的N末端，中間不加任何連接肽；或所述的與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 至少85%序列 同源的二聯(lián)體的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，與人血清白蛋白至少85%序列同源的第二 區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。優(yōu)選的是所述的融合蛋白包括與人血清 白蛋白至少95%序列同源的第一區(qū)和與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 至少95%序列同源的第 二區(qū)。所述的融合蛋白包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子16 氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述兩區(qū)的功能等同物。所述的功能等同 物是在不改變所述的融合蛋白特性的前提下，對(duì)融合蛋白的個(gè)別氨基酸的殘基的取代、缺 失或加入得到的多肽。本發(fā)明hVEGF16^3和HSA之間不加任何連接肽，可以避免因連接肽的加入而帶來 的融合蛋白穩(wěn)定性和免疫源性方面的問題。本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供表達(dá)該融合蛋白編碼區(qū)的宿主和攜帶該融合蛋白編 碼區(qū)的重組表達(dá)載體。表達(dá)融合蛋白的宿主可以是細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。表達(dá)出來的融合蛋 白可以存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，也可以從宿主細(xì)胞中分泌出來；分泌所用的信號(hào)肽可以是天然 的人血清白蛋白的信號(hào)肽，也可以是釀酒酵母阿爾法交配因子的信號(hào)肽，或者這兩種信號(hào) 肽的類似物；目的基因可以被整合到宿主的染色體中，也可以插入到質(zhì)粒中。本發(fā)明優(yōu)選的 宿主系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選的酵母表達(dá)系統(tǒng)是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選的畢赤酵母表 達(dá)系統(tǒng)是GS115和X33。這種表達(dá)系統(tǒng)除了具備原核表達(dá)系統(tǒng)的易操作、生長(zhǎng)迅速、營(yíng)養(yǎng)要 求簡(jiǎn)單、易工業(yè)放大的特點(diǎn)外，還具有真核細(xì)胞的蛋白后修飾系統(tǒng)，有利于大量生產(chǎn)高質(zhì)量 的重組蛋白。與宿主對(duì)應(yīng)的表達(dá)載體大多可以購(gòu)買商品化的，如畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)應(yīng)的載 體，分泌型的有 PPIC9K、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6，胞內(nèi)型有 pPIC3K、pPICZ、pHWOlO、 pGAPZ.pGAPZa等。優(yōu)選的是畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，它是酵母整合載體，帶有組氨酸缺陷型的選擇性標(biāo)記基因HIS4、AOXl啟動(dòng)子、MFa分泌信號(hào)肽和G418抗性基因等元 件。AOXl (醇氧化酶操縱子)5’序列、3’序列用于方便編碼基因整合至酵母基因組和控制 編碼基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)化帶有融合cDNA的表達(dá)載體到宿主細(xì)胞中，可以用鋰鹽法、PEG法、原生質(zhì)體 法、電穿孔法或化學(xué)轉(zhuǎn)化等方法。轉(zhuǎn)化之后，可以用多種方法鑒定是否成功，如提取基因組 DNA進(jìn)行PCR鑒定，或者對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白進(jìn)行HSA抗體和hVEGF16^多抗檢測(cè)。生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白可以通過培養(yǎng)帶有本發(fā)明構(gòu)件的DNA的宿主系統(tǒng)來進(jìn)行， 具體的培養(yǎng)方法可以用搖瓶或生物反應(yīng)器。培養(yǎng)分為兩個(gè)階段宿主系統(tǒng)生長(zhǎng)階段和融合 蛋白合成階段。之后可以用各種蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞培養(yǎng)物中 分離純化融合蛋白，包括鹽析、沉淀、超濾、層析、制備電泳等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。


圖 1 重組質(zhì)粒 pPIC9K-HSA-hVEGF165b 物理圖譜圖2 重組質(zhì)粒pPIC9K-HSA-VEGF165b的酶切鑒定1 :DNA Ladder Marker D ；2 pPIC9K-HSA-hVEGF 165b 經(jīng) EcoRI/NotI 雙酶切；3 未 經(jīng)酶切的 pPIC9K-HSA-hVEGF165b 質(zhì)粒 圖3 :融合蛋白的SDS-PAGE分析M 為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 :pPIC9K空質(zhì)粒重組菌表達(dá)結(jié)果；2_9為GS115/ pPIC9K-HSA-hVEGF165b 的發(fā)酵液上消圖4 超濾前后樣品的SDS-PAGE分析M 為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 超濾前；2 超濾后圖5 =Blue-Sepharose層析純化過程的SDS-PAGE分析M 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 上樣流穿液；2 :2M高鹽洗脫收集液；3_5 :1M精氨酸洗 脫收集液具體實(shí)施方法一、實(shí)驗(yàn)材料JM109 空菌、DH5 α /pPIC9K、畢赤酵母 GSl 15 (his4Mut+)、PIC9K_hVEGF165b 以 及pBluescript-HSA質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；pyrobest DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Ladder Marker等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限 公司代為合成；所有測(cè)序服務(wù)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。二、實(shí)驗(yàn)方法實(shí)施例1 :pPIC9K-HSA-VEGF16^3畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。以PIC9K-hVEGF165b為模板，通過PCR擴(kuò)增出hVEGF165b基因，引物如下上游引物5‘ -GCCCTTAGGCTTAGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3 ‘(劃線為Bsu361I酶切位點(diǎn))下游引物5‘ -GTAGCGGCCGCTTAGTCTTTCCTGGTGAGAGATCTGCAAGTACGTTCGTTTAACTC AAG-3‘(劃線為NotI酶切位點(diǎn))
用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，同收500bp左右的片斷，用Bsu361I、 NotI對(duì)同收片斷和pBluescript-HSA質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接再轉(zhuǎn)化到新鮮制作的JM109感 受態(tài)細(xì)胞。挑選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗(yàn)證。陽性重組子提取質(zhì)粒再通過EcoRI/NotI雙酶 切獲得片斷插入到PPIC9K對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，獲得正確的pPIC9K-HSA-VEGF16^3畢赤酵母表 達(dá)質(zhì)粒(圖1)，并通過EcoRI/NotI雙酶切(圖幻及測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)施例2 重組酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及融合蛋白的表達(dá)；活化并過夜培養(yǎng)JM109/pPIC9K-HSA-hVEGF16^3，提取的質(zhì)粒，經(jīng)Mil線性化，電 擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，轉(zhuǎn)化物涂布與含0. 25mg/ml G418的MD平板上，30°C培養(yǎng)72小 時(shí)，挑取所有的長(zhǎng)出的菌落到含0. 5mg/ml G418的YPD平板上，30°C培養(yǎng)2_3天。挑取 長(zhǎng)勢(shì)好的菌落到20ml液體YPD培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，提取GS115全基因組DNA，PCR 鑒定出陽性重組子，并把它保存在含20%甘油的YPD中，凍存于-80°C，命名為GS115/ pPIC9K-HSA-hVEGF165b。將GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF16^ 接種到裝有 30ml BMGY (IOOmM 磷酸鉀，PH 6. 0 ； 1. 34% YNB ；4X Kr5%生物素；3%甘油)的250ml三角瓶中，215rpm，30°C培養(yǎng)24-36小時(shí)， 冷凍沉降菌體，棄去上清，加入25ml BMMY(100mM磷酸鉀，PH 6. 0 ；1. 34% YNB ；4Χ1(Γ5%生 物素；2.5%甲醇)。每對(duì)小時(shí)補(bǔ)加一次甲醇，誘導(dǎo)3天。SDS-PAGE檢測(cè)重組融合蛋白的表 達(dá)情況采用5%濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳，考馬斯亮監(jiān)R-250染色(圖 3)。挑選表達(dá)量較高的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，收集離心得上清，上清液經(jīng)IOkDa分子截留量的膜超 濾濃縮(圖4)，再經(jīng)Blue-S印harose層析分離，IM精氨酸洗脫獲得較純的HSA-hVEGF16^ 融合蛋白(圖5)。
權(quán)利要求
1. hVEGF165b與人血清白蛋白的融合蛋白的基因序列和蛋白質(zhì)序列，如下 (1)基因序列GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGA TTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATG AGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG ACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTG ATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGG AACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAAC TTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAG CTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAG ATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAA AACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTA AGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGC TGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAAT TTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAG TTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATC CTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAG TCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTG AAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGC CCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTG CCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTAGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCA AGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGA TTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAA GACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACT CGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATCTCTCACCAGGAAAGAC (2)氨基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLF⑶K LCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECC QAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCC AAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVL NQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDE GLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRS LTRKD
2.人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法，其特征是 hVEGF16^3與人血清白蛋白融合基因，中間不加任何連接肽對(duì)應(yīng)的核苷酸序列；得到的 HSA-hVEGF165b融合基因插入到克隆載體，轉(zhuǎn)化到宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，融合基因被整合到 宿主的染色體中。
3.權(quán)力要求1和2所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 與人血清白蛋白的融合蛋白，其 特征是包括與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子至少85%序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少 85%序列同源的第二區(qū)；所述的與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 至少85%序列同源的的第一 區(qū)位于融合蛋白的C末端，與人血清白蛋白至少85%序列同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N 末端，中間不加任何連接肽；或所述的與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 至少85%序列同源的第 一區(qū)位于融合蛋白的N末端，與人血清白蛋白至少85%序列同源的第二區(qū)位于融合蛋白的 C末端，中間不加任何連接肽。
4.權(quán)力要求1、2和3所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包括與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 至少95%序列同源的第一區(qū)和 與人血清白蛋白至少95%序列同源的第二區(qū)。
5.權(quán)力要求1、2和3所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 與人血清白蛋白的融合蛋白，其 特征是所述的融合蛋白包括與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 氨基酸殘基序列相同的第一區(qū) 和與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述兩區(qū)的功能等同物。
6.權(quán)力要求5所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征 是所述的功能等同物是在不改變所述的融合蛋白特性的前提下，對(duì)融合蛋白的個(gè)別氨基 酸的殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
7.權(quán)力要求1、2和3所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 與人血清白蛋白的融合蛋白，其 特征是提供攜帶編碼融合蛋白的基因序列的重組表達(dá)載體，pPIC9K-HSA-hVEGF16^3。
8.權(quán)力要求1、2和3所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 與人血清白蛋白的融合蛋白，其 特征是表達(dá)融合蛋白的宿主優(yōu)選是酵母，酵母中優(yōu)選畢赤酵母，畢赤酵母中優(yōu)選是GS115， X-33。
9.權(quán)力要求1、2和3所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子16 與人血清白蛋白的融合蛋白在 替代hVEGF16^3中的應(yīng)用。
全文摘要
人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165b(hVEGF165b)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白及其制備技術(shù)的發(fā)明屬于長(zhǎng)效重組融合蛋白技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的融合蛋白包括與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165b至少85％序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區(qū)。利用限制性酶切連接的方法將hVEGF165b與HSA拼接，中間不加入任何連接肽。該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯?，進(jìn)行個(gè)別氨基酸殘基的取代、缺失或加入，它們?cè)诒Ａ袅薶VEGF165b活性的基礎(chǔ)上，可望顯著延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期，是藥學(xué)領(lǐng)域中，能夠替代hVEGF165b的，有良好前景的藥用融合蛋白。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102121024SQ20101058016
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者張大成, 戴慧云, 朱瑞宇, 臧嫻, 辛鑫, 金堅(jiān), 陳蘊(yùn), 雷楗勇 申請(qǐng)人:江南大學(xué)