專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)小麥三種銹菌的單克隆抗體、免疫熒光方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，特別是涉及檢測(cè)小麥三種銹菌的單克隆抗體、免疫熒 光方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
小麥銹病包括致病菌包括小麥條銹菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)、 小麥葉繡菌(Puccinia triticina f. sp. tritic)禾口小麥禾干繡菌(Puccicinia graminis f. sp. tritici)，是一類(lèi)世界性禾谷類(lèi)作物的重要病害。小麥銹病具有發(fā)生區(qū)域廣、暴發(fā)性 強(qiáng)、流行頻率高、危害損失重等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著我國(guó)小麥的生產(chǎn)安全，而在我國(guó)以小麥條 銹病的發(fā)生最為廣泛，是影響我國(guó)小麥生產(chǎn)安全的首要病害，主要發(fā)生在西北、西南、長(zhǎng)江 中下游和華北等有關(guān)省(市、自治區(qū))，每年發(fā)生面積約6000萬(wàn)畝，經(jīng)大力防治后仍年均減 產(chǎn)小麥10億公斤左右；其次是小麥葉銹病，在西南和長(zhǎng)江流域一帶發(fā)生最重，華北和東北 地區(qū)每年也有較重危害，而小麥葉銹病中，小麥葉銹菌生理小種或致病類(lèi)型以PHT、THT兩 個(gè)小種為主(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，蒲志剛，碩士論文“小麥葉銹菌群體毒性與DNA多態(tài)性關(guān)系分 析及生理小種分子鑒定研究” 2004)；小麥稈銹病過(guò)去主要分布在東南沿海、長(zhǎng)江流域和福 建、廣東、廣西的冬麥區(qū)及東北、內(nèi)蒙古等春麥區(qū)發(fā)生流行(李振岐和曾士邁，2000)，通過(guò) 沿海地區(qū)病菌越冬菌源基地治理和洛夫林系統(tǒng)抗病品種的廣泛種植，近30年來(lái)基本控制 了該病害的流行危害，但在西南、淮北和東北等局部地區(qū)每年仍有不同程度的發(fā)生。病害的早期診斷檢測(cè)是準(zhǔn)確測(cè)報(bào)和有效防控的基礎(chǔ)和前提。長(zhǎng)期以來(lái)，銹病的診 斷主要基于病原菌的生物學(xué)及病害癥狀的特征，其預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)主要基于定期、大規(guī)模的田間 病葉調(diào)查和室內(nèi)病菌小種的活體分離、培養(yǎng)和鑒定。而條銹病和葉銹病的苗期癥狀區(qū)別不 甚明顯，一些基層植保人員常常將二者混淆；在小麥銹病潛育階段，寄主的發(fā)病癥狀不易觀 察，難以界定初侵染的時(shí)期和規(guī)模。這些用于銹病診斷及病情測(cè)報(bào)的傳統(tǒng)方法不僅耗時(shí)費(fèi) 工，且其準(zhǔn)確性和可靠度在很大程度上取決于調(diào)查測(cè)報(bào)人員的經(jīng)驗(yàn)積累與技術(shù)水平，難以 滿足病害的快速、高通量診斷檢測(cè)實(shí)際需求。因此，有必要研發(fā)簡(jiǎn)單易行、靈敏準(zhǔn)確的小麥 銹病快速診斷和檢測(cè)技術(shù)，其于鑒別病害、提高病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的準(zhǔn)確度均具有重要的理論 意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥類(lèi)病害實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)針對(duì)這一生產(chǎn)中面 臨的實(shí)際問(wèn)題，建立了小麥條銹菌和葉銹菌種的特異性分子診斷檢測(cè)技術(shù)(Cao et al., 2007 ；曹麗華等，2007)。然而，該類(lèi)基于PCR擴(kuò)增的病菌核酸檢測(cè)技術(shù)不但需要配置一些特 殊儀器如PCR儀、凝膠電泳裝置等，且對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求較高，難以在眾多基層植 保科技工作者和技術(shù)人員中推廣應(yīng)用。單克隆抗體技術(shù)，是由單細(xì)胞系列產(chǎn)生的同一種抗體蛋白，其僅與抗原分子中的 一個(gè)抗原決定簇結(jié)合，故與抗原性物質(zhì)反應(yīng)時(shí)相對(duì)專(zhuān)一，不受其它物質(zhì)干擾，能區(qū)別物種間 的細(xì)微差異。利用該方法檢測(cè)病原菌具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如易于大量生產(chǎn)、可高通量檢測(cè)、免用 標(biāo)記物，較易實(shí)現(xiàn)病菌的快速、實(shí)時(shí)、實(shí)地檢測(cè)(Ward et al. ,2004 ；Werres & Steffens，1994)，促使其迅速在農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。同時(shí)，該方法涉及的儀器化程 度較低、操作簡(jiǎn)便，特別是對(duì)樣本前處理要求簡(jiǎn)單易于推廣，國(guó)際上許多權(quán)威機(jī)構(gòu)將其列 為優(yōu)先發(fā)展的分析技術(shù)之一。因而，單克隆抗體技術(shù)是實(shí)現(xiàn)田間快速檢測(cè)病原菌的好方 法(Danks & Barker，2000 ;Dewey et al. , 1990 ；Ward et al.，2004)。自上世紀(jì) 80 年代 以來(lái)，單克隆抗體技術(shù)已廣泛應(yīng)用于一些卵菌病原菌的生物學(xué)、分類(lèi)學(xué)及致病性方面的研 究，諸如 Phytophthora cinnamomi (Hardham et al. , 1986 ；Gabor et al. , 1993), Pythium aphanidermatum(Estrada-Garcia et al. ,1989), 及 Aphanomyces invadans(Miles et al. , 2003),且成功石if 發(fā)了水生真菌 Salmonella sp. , Escherichia coli、Listeria monocytoenes(Bokken et al. , 2003 ；Fratamico et al. , 1998 ；Kouboves et al. ,2001 ； Leonard et al.，2004)及幾種細(xì)菌病原菌單克隆抗體檢測(cè)技術(shù)(Ipbal et al.，2000)。丹 麥農(nóng)科院作為我們的合作伙伴，目前已經(jīng)在小麥條銹菌的單克隆抗體研究方面取得了一些 進(jìn)展(Skottrup et al.，2007)，我們實(shí)驗(yàn)室最近已經(jīng)獲得多株小麥葉銹菌的單克隆抗體。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光 素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原 (或抗體)。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡 觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光，可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞， 從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、種類(lèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種可檢測(cè)小麥銹菌的單克隆抗體，并結(jié)合免疫熒光技術(shù)提供能同時(shí) 區(qū)分小麥葉銹菌、稈銹菌、條銹菌的檢測(cè)方法和試劑盒，具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便 快速的優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)小麥三種銹菌的單克隆抗體，其特征在于由保藏號(hào)為CGMCC No. 4414的雜交 瘤細(xì)胞分泌。上述單克隆抗體在檢測(cè)小麥銹病中的應(yīng)用。檢測(cè)小麥三種銹菌的免疫熒光方法，步驟如下(1)制備待測(cè)底片在待測(cè)植株或組織的水浸泡液中按質(zhì)量體積比0. 02g IOOml 的比例加入多聚賴(lài)氨酸，將所得溶液涂于載玻片上，晾干；(2)用PBS洗上述載玻片；(3)在載玻片上加上述單克隆抗體，4°C孵育過(guò)夜；(4)常溫復(fù)溫10分鐘后用PBS洗玻片，然后在載玻片加熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵 育；(5)用甘油緩沖液封片，所述甘油緩沖液的配方為0. 05M碳酸鈉鹽緩沖液，pH8. 0， 50% (ff/V)甘油；(6)鏡檢；步驟(4)中，所述熒光標(biāo)記的二抗為PE_Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG，所述孵育的條件 為37°C，90分鐘。檢測(cè)小麥三種銹菌的試劑盒，特征在于包括免疫熒光檢測(cè)板和熒光標(biāo)記檢測(cè)抗 體，所述免疫熒光檢測(cè)板上包被保藏號(hào)為CGMC No. 3464的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體作為包被抗體，所述熒光標(biāo)記檢測(cè)抗體為上述單克隆抗體。所述熒光為PE_Cy3。本發(fā)明采用小麥葉銹菌生理小種PHT和/或THT的夏孢子作為抗原得到一系列雜 交瘤細(xì)胞株，其中保藏號(hào)CGMCC No. 4414的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體能夠用于特異地 檢測(cè)小麥三種銹菌。如圖1-5所示本發(fā)明基于上述單克隆的特性，結(jié)合免疫熒光檢測(cè)技術(shù)，提供了檢測(cè)小麥銹菌的 免疫熒光方法，實(shí)現(xiàn)在熒光顯微鏡下對(duì)三種銹菌的區(qū)分。本發(fā)明為了使小麥銹菌檢測(cè)途徑更為便捷，基于上述單克隆抗體及熒光免疫方法 還提供了試劑盒。試劑盒的原理為Elisa反應(yīng)，采用保藏號(hào)為CGMCC No. 3464的雜交瘤細(xì) 胞株分泌的單克隆抗體作為包被抗體包被在檢測(cè)板上，本發(fā)明的單克隆抗體為檢測(cè)抗體， 并被熒光標(biāo)記稱(chēng)熒光標(biāo)記檢測(cè)抗體，檢測(cè)時(shí)，在檢測(cè)板上滴加待測(cè)菌懸液，然后加入試劑盒 所帶的熒光檢測(cè)抗體進(jìn)行孵育反應(yīng)。只需在熒光顯微鏡下觀察即可得出檢測(cè)結(jié)論。非常便 捷、高效、低成本。雜交瘤細(xì)胞株LPT-2。分類(lèi)命名對(duì)小麥葉銹菌的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。保藏號(hào)CGMCCNo. 4414。保藏日期2010年12月6日。保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。


圖1，葉銹菌由于被其特異性單克隆抗體所捕獲在載破片上，經(jīng)過(guò)PE_Cy3標(biāo)記的 二抗孵育后鏡檢顯示明黃色，400倍放大。圖2-3分別為稈銹菌和條銹菌，由于均未與葉銹菌的單克隆抗體相結(jié)合，與二抗 孵育顯示信號(hào)分別為暗黃色及綠色，400倍放大。圖4為三種銹菌的混合檢測(cè)，可利用這三種顏色差異可直觀分辨出葉銹菌和其他 銹菌，200倍放大。圖5為檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)，該單克隆抗體的檢測(cè)靈敏度可達(dá)2ng/ml，200倍放大。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料小麥葉銹菌小種PHT、THT及其夏孢子，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā) 放。小麥品種鄭麥5389，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放試劑=PBS:0. 01Μ，ρΗ7· 4(配方:8g NaCl,0. 2g KCl、1. 44g Na2HP04,0. 24g KH2P04, 溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，最后加蒸餾水定容至1L)PBS-T (含有 0. O5 % 的吐溫 2O 的 PBS)甘油緩沖液0. 05M碳酸鹽緩沖液pH8. 0,50% (ff/V)甘油實(shí)施例1 小麥葉銹菌的擴(kuò)繁本發(fā)明根據(jù)目前中國(guó)小麥銹菌發(fā)生流行狀況，選擇小麥葉銹菌的主要流行小種PHT、THT為實(shí)驗(yàn)材料，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的高溫室進(jìn)行鑒定與大量擴(kuò)繁。具體步驟如下1.種植小麥葉銹菌的感病品種鄭麥5389，等到第2片新葉長(zhǎng)出的時(shí)候，進(jìn)行PHT、 THT的接種。2.接種前用裝有清水的小型噴壺把小麥葉片噴濕，操作人員的雙手經(jīng)酒精消毒 后，蘸取清水輕輕抹去葉面的蠟紙層，手蘸葉銹菌夏孢子，涂抹在小麥葉片上，來(lái)回多抹幾 次抹勻。3.抹過(guò)銹菌后，實(shí)驗(yàn)員的雙手先用70%的酒精沖洗，再用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗干 凈。4.然后輕輕的把接種好的小麥苗子放入接種用的預(yù)先沖洗干凈的鋁質(zhì)圓桶里，均 勻的噴上水霧，看見(jiàn)有葉片表面有細(xì)霧即可，切忌噴水過(guò)多。5.加蓋塑料薄膜，黑暗條件下16°C下培養(yǎng)M小時(shí)。6.取出接種的小麥苗，室溫培養(yǎng)(20 25°C)，待接種后的小麥葉銹菌出現(xiàn)褪綠斑 時(shí)，要剪去新葉，罩上已經(jīng)高溫滅菌的干凈玻璃罩。7.采集菌種時(shí)，把花盆放在臺(tái)子上，用手平托玻璃罩，用細(xì)的鐵條輕輕敲擊，使夏 孢子落入罩內(nèi)，再敲擊罩子，使孢子粉在罩子內(nèi)呈一條線，傾倒入寫(xiě)好標(biāo)簽的小試管里。實(shí)施例2 小麥葉銹菌免疫小鼠1.收集新鮮擴(kuò)繁的2種小麥葉銹菌孢子，經(jīng)顯微鏡計(jì)數(shù)后，稱(chēng)量小麥葉銹菌PHT與 THT夏孢子各0. 15mg(5X105個(gè)孢子/mg)，加入675 μ 1生理鹽水與675 μ 1弗氏完全佐劑 (美國(guó)sigma公司，貨號(hào)F5881)，放入注射筒中，將2個(gè)注射筒接起來(lái)，來(lái)回推動(dòng)混勻得到乳 化抗原。2.取4 8周齡雌性Balb/C小鼠，取200 μ 1乳化抗原以皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn) 行免疫。3周后，夏孢子懸液與弗氏不完全佐劑混合乳化，3周后，以弗氏不完全佐劑(美國(guó) sigma公司，貨號(hào)F5506)代替弗氏完全佐劑與菌液混合乳化，按照相同劑量及方式進(jìn)行免 疫，后續(xù)免疫均按照此方案進(jìn)行。第3次加強(qiáng)免疫后，每次免疫后的第10天進(jìn)行小鼠眼下 部位采血，采用間接ELISA法測(cè)定血清的效價(jià)與特異性。3.測(cè)定血清效價(jià)時(shí)，須預(yù)先準(zhǔn)備預(yù)包被有PHT、THT夏孢子的酶標(biāo)板孔，具體操作 如下(1)將步驟1中的夏孢子懸液，以100μ 1每孔加入酶標(biāo)板孔，放置于37°C恒溫箱 中孵育16h，取出后以PBS-T (含有0. 05%的吐溫20)洗板3次，再向每孔加入200 μ 1含有
的脫脂奶粉的PBS于37°C封閉池后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2)將梯度稀釋的抗血清100 μ 1加入酶標(biāo)板孔，放置于37°C孵育lh，而后加入用 PBS稀釋1000倍的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37°C孵育Ih后取出洗板。(3)加入100 μ 1的單組份顯色底物(丹麥Kem-en-tec司，貨號(hào)4800H)，37°C孵育 IOmin0(4)以0. 2M的硫酸溶液中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm吸光度值。表1為其中一 次的測(cè)定數(shù)據(jù)。表1血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果示例
權(quán)利要求
1.檢測(cè)小麥三種銹菌的單克隆抗體，其特征在于由保藏號(hào)為CGMCCNo. 4414的雜交瘤 細(xì)胞分泌。
2.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在檢測(cè)小麥銹病中的應(yīng)用。
3.檢測(cè)小麥三種銹菌的免疫熒光方法，步驟如下(1)制備待測(cè)底片在待測(cè)植株或組織的水浸泡液中按質(zhì)量體積比為0.02g IOOml 的比例加入多聚賴(lài)氨酸，將所得溶液涂于載玻片上，晾干；(2)用PBS洗上述載玻片；(3)在載玻片上加權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，4°C孵育過(guò)夜；(4)常溫復(fù)溫10分鐘后用PBS洗玻片，然后在載玻片加熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育；(5)用甘油緩沖液封片，所述甘油緩沖液的配方為0.05M碳酸鈉鹽緩沖液，pH8. 0,50% (W/V)甘油；(6)鏡檢。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫熒光方法，步驟(4)中，所述熒光標(biāo)記的二抗為PE-Cy3 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，所述孵育的條件為37°C，90分鐘。
5.檢測(cè)小麥三種銹菌的試劑盒，特征在于包括免疫熒光檢測(cè)板和熒光標(biāo)記檢測(cè)抗體， 所述免疫熒光檢測(cè)板上包被保藏號(hào)為CGMC No. 3464的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體作 為包被抗體，所述熒光標(biāo)記檢測(cè)抗體為權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，所述熒光為PE-Cy3。
全文摘要
本發(fā)明“檢測(cè)小麥三種銹菌的單克隆抗體、免疫熒光方法及試劑盒”，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明主要提供用于檢測(cè)小麥三種銹菌的單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏號(hào)為CGMCC No..4414的雜交瘤細(xì)胞株分泌，能夠同時(shí)鑒別檢測(cè)小麥葉銹菌、稈銹菌、條銹菌。還提供了基于該單克隆抗體與免疫熒光技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)方法及試劑盒。具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K16/16GK102101887SQ201010591010
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者劉博 , 劉太國(guó), 陳萬(wàn)權(quán), 高利 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所