專利名稱：一種重組人干擾素β1a的分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程重組蛋白純化領域，尤其涉及一種采用陰離子交換層析技術 對重組人干擾素β Ia進行分離純化的方法。
背景技術：
人干擾素β (IFN-β)是具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節(jié)作用的重要細胞因子，主 要由成纖維細胞和某些上皮細胞產生，普通的干擾素誘生劑，例如病毒、雙鏈RNA和一些微 生物均能夠誘導IFN-β的產生。自然IFN-β是一種糖蛋白(糖分約占20%)，相對分子 質量約20000，由166個氨基酸組成，有21個氨基酸組成的信號肽，在S-M之間切開。在分 子的第17位、31位、141位為Cys，在31位和141位之間形成的二硫鍵對其生物學活性的發(fā) 揮是必需的。hIFN-β基因長777bp，位于染色體9p22，與IFN-α基因簇鄰近。人白細胞干 擾素與成纖維細胞干擾素之間在核苷酸水平上有45%的同源性，在氨基酸水平上有 的同源性。IFN-a與IFN-β基因均無內含子。IFN-α與I FN-β結合于同一受體，但后 者與受體的親和力大于前者。美國FDA已于1993批準IFN-β Ib (大腸桿菌表達)和1996年批準IFN-β la (CH0 細胞表達)用于治療多發(fā)性硬化癥(MS)。目前，IFN-β是能夠控制MS反復發(fā)作的唯一藥 物。據(jù)估計，我國MS患者至少有數(shù)十萬人，迄今尚無特效藥。CHO細胞與大腸桿菌表達的 IFN-β Ia相比，具有較高的抗病毒比活性，較小的副作用以及較長的半衰期。目前報道的純化方法使用CM陽離子層析，緩沖液ρΗ在7. 2 5. 0之間變換，蛋白 極易變形，活性損失大，操作繁瑣，工藝放大難度大。亟需建立一種適合大規(guī)模生產且生產成本低的重組人干擾素β la(rhIFN-^ la) 分離純化方法，以滿足大量患者的需求。

發(fā)明內容
為解決上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種工藝穩(wěn)定、容易放大、適合大規(guī) 模生產且生產成本低的重組人干擾素β Ia分離純化方法。為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案為一種重組人干擾素β Ia的分離純化方法，包括以下步驟1)對樣品進行藍膠層析，收集重組人干擾素β Ia活性峰；2)對藍膠層析產物進行超濾脫鹽；3)對超濾脫鹽產物進行Q-kpharose Fast Flow陰離子交換層析，用ρΗ 8. 3 8. 7的20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后先用上述緩沖液洗脫至基線，再用 PH8. 3 8. 7含NaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液進行洗脫，收集重組人干擾素β Ia活性 峰；4)對陰離子交換層析產物進行S-200分子篩層析，得到重組人干擾素β la。所述的步驟1)中的樣品為灌流培養(yǎng)細胞收集液，用Tris-HCl緩沖液超濾濃縮獲得。所述的超濾濃縮的截留分子量為5K，用pH8. 3 8. 7的20mmol/L Tris-HC 1緩沖液濃 縮至原體積的1/4 1/6。所述的步驟1)具體為用pH8. 3 8. 7的20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡Blue Sepharose 6Fast Flow層析柱，上樣后，先用上述緩沖液淋洗至基線，再用pH8. 3 8. 7、含 2mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，洗脫至基線后，而后再用pH8. 3 8. 7、含 2mol/L NaCl和60%乙二醇的20mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，收集重組人干擾素β Ia活 性峰。所述的步驟2)具體為用ρΗ8. 3 8. 7的20mmo 1/L Tris-HCl緩沖液進行超濾 脫鹽，其截留分子量為5K，超濾脫鹽至電導率低于1 μ S/cm。所述的步驟3)中的洗脫為梯度洗脫，洗脫緩沖液中NaCl終濃度為lmol/L。所述的步驟4)具體為用pH8. 3 8. 7的20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡 Sephacryl S200柱，上樣后，用上述緩沖液洗脫，收集重組人干擾素β Ia活性峰。所述的步驟4)收集得到重組人干擾素β Ia活性峰用0. 22 μ m過濾器過濾并無菌 收集。本發(fā)明中重組人干擾素β la(rhIFN-^ la)的分離純化方法特點是①重組人干 擾素i3 1a(rhIFN_i3 1a)產品純度高，由已有工藝的95%以上提高到99%以上。②重組人 干擾素β la(rhIFN-i3 la)產品活性回收率高，由已有工藝的30 %提高至40 %以上。③ 重組人干擾素β la(rhIFN-i3 la)產品生物學比活性由已有工藝的2 X 108IU/mg提高到 2.5X108IU/mg以上。④純化工藝中緩沖液pH始終保持一致，工藝過程不跨越目的蛋白等 電點，有利于蛋白保持穩(wěn)定。⑤工藝過程步驟少，操作簡便，不需特殊試劑，易放大。


圖1是本發(fā)明分離純化方法中藍膠層析的色譜圖；圖2是本發(fā)明分離純化方法中QFF陰離子交換層析的色譜圖；圖3是本發(fā)明分離純化方法中S-200分子篩層析的色譜圖；圖4是本發(fā)明分離純化方法中各純化步驟得到的產物的SDS電泳圖。
具體實施例方式下面將通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，但下述的實例僅僅是本發(fā)明其中的例 子而已，并不代表本發(fā)明所限定的權利范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通 常按照常規(guī)條件或按制造廠商建議的條件。本發(fā)明所述的Q-kpharose Fast Flow，簡稱QFF，其是一種強陰離子交換色譜柱， 可從美國GE Healthcare公司購得。實施例通過細胞培養(yǎng)罐連續(xù)灌流培養(yǎng)含重組人干擾素β la(rhIFN-^ la)的無血清培養(yǎng) 液，經以下純化方法進行純化1.超濾濃縮用截留分子量為漲的濾膜超濾，用pH8. 5的20mmol/L Tris-HCl緩沖液濃縮至原 體積的1/5。
2. Blue Sepharose 6Fast Flow 層析(藍膠層析)2. 1 平衡以 40ml/min 的流速用 20mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 5)緩沖液平衡 Blue Sepharose 6Fast Flow層析柱，直至流出液pH為8. 5。2. 2上樣以40ml/min流速，將過濾后的細胞收集液上樣。2. 3淋洗用20mmol/L Tris-HCl (pH8. 5)緩沖液以30ml/min的流速淋洗至基線。2. 4 第一步洗脫用含 2mol/L NaCl 的 20mmol/LTris-HCl (pH8. 5)緩沖液以 40ml/ min的流速洗脫。2. 5 第二步洗脫用含 2mol/L NaCl 和 60% 乙二醇的 20mmol/LTris-HCl (ρΗ8· 5) 緩沖液以30ml/min的流速洗脫并收集重組人干擾素β la(rhIFN-^ la)活性峰。藍膠層析 的色譜圖如圖1所示，峰4為重組人干擾素β Ia的活性峰。3.超濾脫鹽用截留分子量為漲的濾膜超濾，用ρΗ8. 5的20mmol/L Tris-HCl緩沖液超濾更換 緩沖液至電導率為0. 5 μ S/cm。4. Q-Sepharose Fast Flow 層析(QFF 陰離子交換層析)4. 1平衡20mmol/L Tris-HCl (pH8. 5)緩沖液平衡柱床平衡流速為30ml/min，淋 洗5倍柱體積。4. 2上樣以30ml/min的流速將藍膠層析得到的樣品上樣于QFF層析柱。4. 3淋洗上樣完畢后，用20mmol/L Tris-HCl (pH8. 5)緩沖液淋洗2倍柱體積至基線。4. 4 洗脫用含 lmol/L NaCl 的 20mmol/LTris-HCl (pH8. 5)梯度洗脫，收集重組人 干擾素β la(rhIFN-^ la)活性峰至250ml鹽水瓶中。QFF陰離子交換層析的色譜圖如圖2 所示，峰2為重組人干擾素β Ia的活性峰。5. S-200分子篩層析5. 1平衡用20mmol/LTris-HCl (pH8. 5)緩沖液以8ml/min的流速平衡2倍柱體 積。5. 2上樣上樣流速為8ml/min，上樣量應不超過柱體積的5%。5. 3洗脫用20mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 5)緩沖液以8ml/min的流速洗脫。從活 性峰開始出現(xiàn)收集至峰下行至基線時停止收集。用0.22 μ m的一次性過濾器，無菌過濾 重組人干擾素β la(rhIFN-^ la)產品至無菌鹽水瓶中，即為最終純化的重組人干擾素 β la(rhIFN-^ la)產品原液。S-200分子篩層析的色譜圖如圖3所示，峰1為重組人干擾 素β Ia的活性峰。對各純化步驟得到的產物測定比活力并計算回收率，結果如表1所示。表 權利要求
1.一種重組人干擾素β Ia的分離純化方法，包括以下步驟1)對樣品進行藍膠層析，收集重組人干擾素βIa活性峰；2)對藍膠層析產物進行超濾脫鹽；3)對超濾脫鹽產物進行Q-kpharoseFast Flow陰離子交換層析，用pH 8. 3 8. 7 的20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后先用上述緩沖液洗脫至基線，再用pH8. 3 8. 7含NaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液進行洗脫，收集重組人干擾素β Ia活性峰；4)對陰離子交換層析產物進行S-200分子篩層析，得到重組人干擾素βla。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組人干擾素βIa的分離純化方法，其特征在于，步驟1)中 的所述樣品為灌流培養(yǎng)細胞收集液，用Tris-HCl緩沖液超濾濃縮獲得。
3.根據(jù)權利要求2所述的重組人干擾素βIa的分離純化方法，其特征在于，所述的超 濾濃縮的截留分子量為5Κ，用ρΗ8. 3 8. 7的20mmol/L Tris-HCl緩沖液濃縮至原體積的 1/4 1/6。
4.根據(jù)權利要求1所述的重組人干擾素βIa的分離純化方法，其特征在于，步驟1)具 體為用 ρΗ8· 3 8. 7 的 20mmol/L Tris-HCl 緩沖液平衡 Blue Sepharose 6Fast Flow 層 析柱，上樣后，先用上述緩沖液淋洗至基線，再用PH8. 3 8. 7、含2mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，洗脫至基線后，而后再用pH8. 3 8. 7、含2mol/L NaCl和60%乙二 醇的20mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，收集重組人干擾素β Ia活性峰。
5.根據(jù)權利要求1所述的重組人干擾素βIa的分離純化方法，其特征在于，步驟2)具 體為用ΡΗ8. 3 8. 7的20mmol/L Tris-HCl緩沖液進行超濾脫鹽，截留分子量為5K，超濾 脫鹽至電導率低于lyS/cm。
6.根據(jù)權利要求1所述的重組人干擾素βIa的分離純化方法，其特征在于，步驟3)中 的洗脫為梯度洗脫，洗脫緩沖液中NaCl終濃度為lmol/L。
7.根據(jù)權利要求1所述的重組人干擾素βIa的分離純化方法，其特征在于，步驟4)具 體為用ρΗ8· 3 8. 7的20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡Sephacryl S200柱，上樣后，用上 述緩沖液洗脫，收集重組人干擾素β Ia活性峰。
8.根據(jù)權利要求1所述的重組人干擾素βIa的分離純化方法，其特征在于，步驟4)收 集得到重組人干擾素β Ia活性峰用0. 22 μ m過濾器過濾并無菌收集。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人干擾素β1a的分離純化方法，其包括以下步驟1)對樣品進行藍膠層析，收集重組人干擾素β1a活性峰；2)對藍膠層析產物進行超濾脫鹽；3)對超濾脫鹽產物進行Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，用pH8.3～8.7的20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后先用上述緩沖液洗脫至基線，再用pH8.3～8.7含NaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液進行洗脫，收集重組人干擾素β1a活性峰；4)對陰離子交換層析產物進行S-200分子篩層析，得到重組人干擾素β1a。采用該純化方法目標蛋白不易失活，純化得到的目的蛋白純度和生物學比活性高。
文檔編號C07K14/565GK102140128SQ20101059437
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權日2010年12月17日
發(fā)明者于玉根, 張靜, 陳紅霞 申請人:深圳新鵬生物工程有限公司