專(zhuān)利名稱(chēng)：一種結(jié)核分枝桿菌抗體結(jié)合肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能與結(jié)核病人血清特異性抗體結(jié)合的多 肽，以及該多肽在結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是WHO重點(diǎn)控制的傳染性疾病，目前仍是嚴(yán)重危害人民健康的公共衛(wèi)生問(wèn) 題。據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，全球約有1/3的人口感染結(jié)核菌，現(xiàn)有結(jié)核病人約2000萬(wàn)，每年新 發(fā)病800萬(wàn) 1000萬(wàn)人，每年約有200萬(wàn)人死于結(jié)核病，是其它所有傳染病死亡人數(shù)的總 和。我國(guó)的結(jié)核病疫情極其嚴(yán)峻，現(xiàn)有結(jié)核感染者5億，占全球的1/4，每年有13萬(wàn)人死于 結(jié)核病，為其它各類(lèi)傳染病和寄生蟲(chóng)病死亡人數(shù)總和的2倍。目前結(jié)核病控制存在的最主要問(wèn)題是病人發(fā)現(xiàn)率低，治愈率低。在診斷方面，現(xiàn)有 的檢查方法均存在著一定的局限性，難以達(dá)到快速、準(zhǔn)確的結(jié)核病診斷。因此，加大結(jié)核分 枝桿菌的基礎(chǔ)研究，尋找快速、靈敏、簡(jiǎn)便、實(shí)用的結(jié)核病診斷新方法，提高結(jié)核病人的檢出 率，是目前結(jié)核病研究需要迫切解決的問(wèn)題。血清學(xué)檢查是目前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室三大診斷方法之一，相對(duì)細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)檢 查具有多種優(yōu)點(diǎn)，其方法簡(jiǎn)單、快速，價(jià)格便宜，不需要特殊的大型檢測(cè)設(shè)備，即使基層醫(yī)院 也能夠廣泛開(kāi)展，對(duì)痰涂片陰性的肺結(jié)核，肺外結(jié)核和不易獲得痰標(biāo)本的兒童結(jié)核的診斷 均具有重要價(jià)值，成為了早期發(fā)現(xiàn)與診斷結(jié)核病的理想選擇，但是常規(guī)血清學(xué)檢查仍存在 著敏感性、特異性較低的缺點(diǎn)，限制了臨床應(yīng)用，主要原因是難以得到高敏感性、高特異性 的抗原。研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，利用含有抗原免疫表位的合成肽來(lái)代替整個(gè)抗原蛋白，有助于 減少免疫交叉反應(yīng)，提高特異性。來(lái)自瑞士的研究人員利用高通量的肽芯片技術(shù)，對(duì)來(lái)自 61個(gè)結(jié)核分枝桿菌的蛋白進(jìn)行抗原表位解析，發(fā)現(xiàn)了 12個(gè)肽可以用于區(qū)別結(jié)核和非結(jié)核 病人，為以多肽為基礎(chǔ)建立血清學(xué)檢測(cè)方法提供了思路。然而，采用肽芯片或計(jì)算機(jī)模擬的 方法，只能獲得含有線(xiàn)性表位的多肽，而天然抗原的B細(xì)胞表位主要以構(gòu)象表位為主，單純 使用含有線(xiàn)性表位的多肽，無(wú)法檢測(cè)到與構(gòu)象表位結(jié)合的抗體，影響檢出率。聯(lián)合多種含有 結(jié)核抗原不同線(xiàn)性或構(gòu)象表位的合成肽，有可能為結(jié)核病的血清學(xué)診斷提供更加有效的方 法。噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)是將外源多肽展示于噬菌體顆粒表面的方法，是一種高 效分子進(jìn)化研究的高通量篩選體系，在免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和藥物開(kāi)發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域中得到 了非常廣泛的應(yīng)用。目前，隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)已作為一種非常有效的技術(shù)廣泛用于各種分子(包 括蛋白、多糖、糖脂等)的抗原模擬表位的研究中。利用不同長(zhǎng)度或不同構(gòu)象的隨機(jī)肽庫(kù)，以 特異的抗體為靶分子，經(jīng)過(guò)多輪噬菌體篩選后，可獲得特異性強(qiáng)、親和力高的模擬特定抗 原各種表位結(jié)構(gòu)和化學(xué)特征的短肽序列，包括線(xiàn)性表位、構(gòu)象表位。應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩 選獲得的多肽分子作為半抗原不僅可以特異地識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)抗體，從而發(fā)現(xiàn)患者血清中 的抗體，而且這些多肽可以通過(guò)基因合成的方法大量生產(chǎn)，為抗體的特異性檢測(cè)提供快速、靈敏、簡(jiǎn)便、實(shí)用的新方法。噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)在結(jié)核血清學(xué)檢測(cè)方面的應(yīng)用也已有報(bào)道，Barenholz 等在應(yīng)用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)篩選結(jié)核菌糖脂抗原脂阿拉伯糖甘露聚糖模擬短肽的 實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，在血清學(xué)檢測(cè)中該噬菌體展示短肽具有較好的敏感性和特異性，Gevorkian 等研究發(fā)現(xiàn)，抗原決定簇是致免疫應(yīng)答的決定部位，可作為免疫診斷中抗原的替代品。本室 前期利用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)以結(jié)核分枝桿菌兩種特異性抗原CE、MPT64的兔源多抗 為靶分子，篩選獲得了 7肽模擬表位，初步檢測(cè)結(jié)果表明這些表位肽完全可以替代相應(yīng)抗 原用于血清學(xué)檢測(cè)。但應(yīng)用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)直接篩選結(jié)核病人血清特異性抗體結(jié) 合肽的研究目前國(guó)內(nèi)、外尚未見(jiàn)報(bào)道(根據(jù)維普、PubMed等中、英文數(shù)據(jù)庫(kù)檢索)。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述技術(shù)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，本發(fā)明提供一種能與結(jié)核病人血清特異性抗體結(jié) 合的多肽，還公開(kāi)了該多肽在結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。一種能與結(jié)核病人血清特異性抗體結(jié)合的多肽，其氨基酸序列通式為 X1X2X3PPFS,其中P代表脯氨酸，F(xiàn)代表苯丙氨酸，S代表絲氨酸，X1 \代表任意氨基酸。上述與結(jié)核病人血清特異性抗體結(jié)合的多肽，優(yōu)選&為L(zhǎng)或F，&為P或H，X3為 P或F，其中L代表亮氨酸，H代表組氨酸。上述結(jié)核病人血清特異性抗體結(jié)合多肽能在結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)中作為檢測(cè)試劑 的應(yīng)用。本發(fā)明以純化的結(jié)核病人血清IgG為靶蛋白，從噬菌體展示的隨機(jī)線(xiàn)形七肽庫(kù) (New England Biolabs公司)中篩選到與之結(jié)合的短肽。所篩選到的短肽其氨基酸序列為 i^APPFS。本發(fā)明的短肽可通過(guò)本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)如化學(xué)合成等方法制備。


圖1 :SDS-PAGE檢測(cè)純化獲得的結(jié)核病人和健康人IgG。其中1.低分子量蛋白 Marker ；2.純化后結(jié)核病人IgG ；3 純化后健康人IgG。圖2 單噬菌體的ELISA檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1 結(jié)核病人血清特異性抗體結(jié)合肽的篩選及序列分析。實(shí)驗(yàn)材料。1、噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)試劑盒
噬菌體表面衣殼蛋白III展示的線(xiàn)形7肽庫(kù)(Ph.D. _7TMPhage Display Peptide Library Kit)試劑盒購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司。肽庫(kù)的滴度為2 X IO11 pfu/ ml。受體菌萬(wàn).co/iER2738 基因型為F，IacIq Δ (lacZ)M15 proA+B+ zzf: :Tn 10 (TetR)/ fhuA2 supE thi Δ (lac-proAB) Δ (hsdMS-mcrB) 5 (rk - m k_ McrBC - )。DNA 全自動(dòng) 測(cè)序引物(—96111 sequencing primer) : 5，-CCCTCATAGTTAGCGTA ACG -3， (SEQ IDNO. 1)。2、結(jié)核病人及健康人血清
47例結(jié)核病人血清采集自上海市肺科醫(yī)院結(jié)核科門(mén)診或住院的結(jié)核病人，均為結(jié)核分 枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；37例健康人血清采集自上海市肺科醫(yī)院門(mén)診體檢的健康華東漢族人，均 有卡介苗接種史。所有人選均排除了合并糖尿病、自身免疫性疾病及HIV感染。血清標(biāo)本 采集后分裝，一 70 °C凍存。3、化學(xué)試劑
牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體單抗購(gòu)自瑞典 Pharmacia公司；Protein A/G瓊脂糖柱購(gòu)自上海悅克生物科技有限公司；TMB、Tween-20、 EDTA和PEG-8000購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。4、相關(guān)試劑的配制
項(xiàng)層瓊脂糖LB培養(yǎng)基+ lg/L MgCl2 · 6H20+7g/L瓊脂糖，高壓滅菌；
底層LB平板LB培養(yǎng)基+ 15g/L瓊脂粉，高壓滅菌，鋪平板；
PEG/NaCl 20% (w/v) PEG-8000, 2. 5mol/L NaCl。高壓滅菌，室溫貯存。TBS 緩沖液50mmol/L Tris-HCl (pH 7. 5)，150mmol/L NaCl。高壓滅菌，室溫C: 存。碘化鈉緩沖液10mmol/LTris-HCl (pH 8. 0), Immo 1/L EDTA, 4mol/L Nal。室 溫避光貯存。5、主要儀器
R0TINA38臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)；Thermo MK3酶標(biāo)儀(美國(guó) THERMO公司)；HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；蛋白電泳槽 (BI0-RAD公司)；全自動(dòng)高壓滅菌器(日本Hirayama公司)；全自動(dòng)凝膠成像分析儀(英 國(guó)Syngene公司)；超純水分離系統(tǒng)(英國(guó)USF Elga公司)。1. 1血清標(biāo)本的挑選及IgG的純化
挑選將47例結(jié)核病人和37例健康人血清標(biāo)本分別用本室制備的16KD，CFP32重組蛋 白及前期篩選獲得的CE和MPT64抗原表位肽進(jìn)行檢測(cè)，選取檢測(cè)結(jié)果均為陰性的12例結(jié) 核病人血清標(biāo)本作為本次篩選靶分子，同時(shí)選取兩者檢測(cè)結(jié)果均為陰性的12例健康人血 清標(biāo)本作為反篩靶分子；
純化按照使用說(shuō)明書(shū)，用I^rotein A/G瓊脂糖柱將挑選出的12份結(jié)核患者血清標(biāo)本 各取100 μ 1混合后過(guò)柱，獲得純化后結(jié)核病人IgG，同樣，將12份健康人血清標(biāo)本各取100 μ 1混合過(guò)柱，獲得純化后健康人IgG ；
純化鑒定=SDS-PAGE檢測(cè)純化獲得的結(jié)核病人和健康人IgG，見(jiàn)圖1，經(jīng)分光光度計(jì)計(jì) 算，結(jié)核病人IgG純化后的濃度為1. 2g/L，純化后的純度在90%以上，健康人IgG純化后的 濃度為1. 3g/L，純化后的純度在85%以上。1. 2 純化的結(jié)核病人和健康人IgG對(duì)七肽庫(kù)進(jìn)篩選
a包被結(jié)核病人和健康人IgG分別以100 μ g/ml包被96孔酶標(biāo)板，100 μ 1/孔，4°C 包被過(guò)夜；
b封閉移動(dòng)孔中的包被液，然后用5 mg/ml BSA封閉包被孔300 μ 1/孔，4 °C封閉
2 h ；c洗滌移動(dòng)封閉液，用TBST (0. l%Tween-20)洗6遍；
d健康人IgG結(jié)合用TBST稀釋原代噬菌體庫(kù)，加入健康人IgG包被孔100 μ 1，室溫 輕輕搖動(dòng)孵育60 min ；
e結(jié)核病人IgG結(jié)合吸取與健康人IgG未結(jié)合的噬菌體上清，加入結(jié)核病人IgG包被 孔，室溫輕輕搖動(dòng)孵育60 min ；
f健康人IgG包被孔清洗按照上述清洗方法，用TBST清洗健康人IgG包被孔10遍； g非特異性洗脫健康人IgG結(jié)合噬菌體用100 μ 1/孔洗脫緩沖液(1 mg/ml BSA、0· 2 mol/L Glycine-HCl, pH 2. 2)室溫輕搖 10 15 min 洗脫；
h中和吸出洗脫液，加入含有15 μ 1 Tris-HCl (1 mol/L, pH 9. 1)中和緩沖液的離 心管中，使洗脫液近中性；
i結(jié)核病人IgG包被孔清洗移動(dòng)未結(jié)合的噬菌體肽庫(kù)，按照上述清洗方法，用TBST洗 10遍；
j非特異性洗脫結(jié)核病人IgG結(jié)合噬菌體并中和用100 μ 1/孔洗脫緩沖液室溫輕搖 10 15 min洗脫，加入中和緩沖液中和；
k滴度測(cè)定和噬菌體的擴(kuò)增取出10 μ 1中和液用LB培養(yǎng)基按10 — 1 10 — 4稀 釋?zhuān)M(jìn)行噬菌體滴度的測(cè)定，剩余的擴(kuò)增、純化后重復(fù)步驟進(jìn)行下一輪篩選。注為了得到高親和力的特異性結(jié)合噬菌體，在下一輪次中增加洗滌液TBST中 Tween-20的濃度(可從0. 1%增加到0. 5%)。1. 3噬菌體的擴(kuò)增和純化
挑取宿主菌ER2738單菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜菌按1 :100接種于20ml LB培養(yǎng)基中，加入待擴(kuò)增的噬菌體，37°C振搖培養(yǎng) 4. 5h ；
將菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，40C、10000r/m離心IOmin ；上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，再 次離心，將上清的80%轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，混勻，4°C沉淀過(guò)夜。 然后4°C、10000r/m離心15min，棄上清；
沉淀重懸于1 ml TBS中，然后移至1.5ml離心管中，4°C、10000r/m離心5min，使殘余
細(xì)胞沉淀。上清移至另一 1.5ml離心管中，再加入1/6體積的PEG/ NaCl，混勻后于4°C沉淀 Ih0 然后 40C、10000r/m 離心 IOmin ；
沉淀重懸于含0.02% NaN3的100 μ 1 TBS中，4°C、10000r/m離心1 min。取上清， 4°C貯存?zhèn)溆谩?. 4噬菌體滴度的測(cè)定
挑取宿主菌ER2738單菌落，接種于LB培養(yǎng)中，37。C劇烈搖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 (0D600 ^ 0. 5)；
37°C預(yù)溫LB平板；
頂層瓊脂在微波爐中融化后分裝到無(wú)菌試管，每管:3ml，保溫于50°C水浴鍋中； 用LB培養(yǎng)基將洗脫的噬菌體按10倍梯度系列稀釋?zhuān)?br> 取10 μ 1不同梯度的噬菌體稀釋液分別加入200 μ 1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ER2738菌液中，渦 旋混勻，室溫孵育5min ；將上述混合液加入3ml頂層瓊脂中迅速渦旋后，立即在37°C預(yù)熱的LB平板上鋪板，放 置冷卻后，培養(yǎng)箱中37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜；
計(jì)算噬菌斑數(shù)在平板中選100個(gè)噬菌斑左右者進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)即得每10 μ 1 原液所含噬菌體的個(gè)數(shù)，通常以pfu/μ 1或pfu/ml表示。一般情況下，淘洗下來(lái)的噬菌體以IO1 - IO4倍稀釋?zhuān)瑪U(kuò)增后的噬菌體以IO8 - IO11 倍稀釋。1. 5噬菌體單鏈DNA的制備、序列測(cè)定
將ER2738過(guò)夜菌按1 :100接種于LB培養(yǎng)基中，Iml/管分裝于培養(yǎng)試管中，挑取噬菌 斑加入其中，37°C振搖培養(yǎng)4. 5-5h ；
將500 μ 1擴(kuò)增后的噬菌體液體，10000r/m離心1 Omin，取上清重復(fù)離心一次； 上清移至另一離心管中，加入200μ IPEG/NaCI，混勻，室溫放置IOmin ； 10000r/m離心1 Omin，棄上清，再短暫離心，吸盡上清；
用100 μ 1碘化物緩沖液充分重懸沉淀，加入250 μ 1乙醇，室溫培養(yǎng)10 min0 4 °C、 10000r/m離心10 min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀，用30 μ 1 TE溶解沉淀，送公司進(jìn)行 測(cè)序并翻譯為氨基酸序列，(用Μ13反向一 96位遠(yuǎn)端引物測(cè)序)采用DNASTAR軟件對(duì)短肽 序列進(jìn)行比較。1.6噬菌體克隆與抗體結(jié)合活性的ELISA檢測(cè)
包被結(jié)核病人和健康人IgG以100 μ g/ml包被96孔酶標(biāo)板，另設(shè)只加入包被液的空 白對(duì)照，100 μ 1/孔，4°C包被過(guò)夜；
封閉移動(dòng)孔中的包被液，然后用5 mg/ml BSA封閉包被孔和空白對(duì)照孔300 μ 1/孔， 4 V封閉2 h ；
洗滌移動(dòng)封閉液，用TBST (0. l%Tween-20)洗6遍；
結(jié)合用TBST稀釋各單噬菌體及第1輪淘選后噬菌體(陰性對(duì)照)至滴度為l(fpfU/ μ 1，100 μ /孔分別加入至包被孔和空白對(duì)照孔中，37°C Ih ； 洗滌移動(dòng)結(jié)合液，TBST洗板6次；
酶標(biāo)抗體結(jié)合在各反應(yīng)孔中加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體抗體，100 μ 1/孔，37°C 1 h ；
洗滌移動(dòng)反應(yīng)液，TBST洗板6次；
顯色加入TMB底物顯色，2 mol/L H2S04終止反應(yīng)；
讀數(shù)分光光度計(jì)讀OD45tl。結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)施例2 陽(yáng)性單噬菌體對(duì)血清標(biāo)本的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)材料。血清標(biāo)本47份活動(dòng)性肺結(jié)核患者(痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性)和37份 有卡介苗接種史的健康人血清標(biāo)本均為上海市肺科醫(yī)院血清標(biāo)本庫(kù)保存。主要試劑HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司 相關(guān)試劑的配制
包被液17. 5 mmol/LNa2C03、32. 5 mmol/L NaHC03、15 mmol/LMgC12 · 6H20, pH 9. 6 PBS 緩沖液0. 02mol/L Na2HP04, 0. 02mol/L NaH2P04. 酶工作液3% BSA, PBS緩沖液儀器設(shè)備
R0TINA38臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)；Thermo MK3酶標(biāo)儀(美國(guó) THERMO公司)；HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；全自動(dòng)高壓滅 菌器(日本Hirayama公司)；全自動(dòng)凝膠成像分析儀(英國(guó)Syngene公司)；超純水分離 系統(tǒng)(英國(guó)USF Elga公司)
2.1陽(yáng)性單噬菌體的制備同1.3 2. 2噬菌體滴度測(cè)定同1.4 2. 3血清標(biāo)本的ELISA檢測(cè)
包被陽(yáng)性單噬菌體用包被液稀釋至1 X 108pfu/ μ 1，100 μ 1/孔包被96孔酶標(biāo)板，4°C 包被過(guò)夜；
封閉移去孔中的包被液，PBST (0. 05%Tween-20)洗板3次，用1. 5%脫脂奶粉封閉包 被孔300 μ 1/孔，37 0C封閉Ih;
洗滌移動(dòng)封閉液，用PBST洗3遍；
結(jié)合用PBST稀釋活動(dòng)性肺結(jié)核患者或有卡介苗接種史健康人血清至1:400， 100 μ 1/ 孔，37°C 2h ；
洗滌移動(dòng)結(jié)合液，PBST洗板3次；
酶標(biāo)抗體結(jié)合在各反應(yīng)孔中加入用酶工作液1:10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 抗體，100 μ 1/孔，37°C 1 h ；
洗滌移動(dòng)反應(yīng)液，PBST洗板6次；
顯色加入TMB底物顯色，2 mol/L H2S04終止反應(yīng)；
讀數(shù)分光光度計(jì)讀OD45tl ；
結(jié)果判定以健康人血清檢測(cè)值的平均值為陰性對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果與陰性對(duì)照比值> 2.1，判定為陽(yáng)性。比較不同陽(yáng)性單噬菌體對(duì)血清標(biāo)本的檢出率。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1陽(yáng)性單噬菌體檢測(cè)血清ELISA結(jié)果分析
.................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................實(shí)施例3 抗體結(jié)合肽在結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)中應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)材料。血清標(biāo)本47份活動(dòng)性肺結(jié)核患者(痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性)和37份 有卡介苗接種史的健康人血清標(biāo)本均為上海市肺科醫(yī)院血清標(biāo)本庫(kù)保存。3. 1多肽合成根據(jù)單噬菌體的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果，選擇檢測(cè)結(jié)果較好的單噬菌體 T18展示的多肽(命名為T(mén)P18)，多肽序列為L(zhǎng)PPPPPFS，委托公司進(jìn)行體外合成。3. 2多肽溶解取一部分多肽干粉，準(zhǔn)確稱(chēng)量后，用超純水溶解為10mg/ml的溶液， 4°C保存。3. 3包被濃度判斷將多肽濃度倍比稀釋至0. 5 μ g/ml 32 μ g/ml (0· 5，1，2，4，8，16，32)，分別包被96孔酶標(biāo)板，4°C包被過(guò)夜，ELISA檢測(cè)與血清中抗體結(jié)合活性。結(jié)果取4 μ g/ml作為最佳包被濃度。3. 4血清學(xué)檢測(cè)
多肽用包被液稀釋至4 μ g/ml, 100 μ 1/孔包被96孔酶標(biāo)板，4°C包被過(guò)夜，ELISA檢 測(cè)過(guò)程及結(jié)果判定方法同2. 3。結(jié)果見(jiàn)表2。多肽對(duì)血清標(biāo)本的檢出具有較高敏感性和特 異性。表2 TP18多肽ELISA檢測(cè)血清結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分枝桿菌抗體結(jié)合肽，其特征在于其氨基酸序列通式為=X1X2X3PPFS,其中 P代表脯氨酸，F(xiàn)代表苯丙氨酸，S代表絲氨酸，X1 1、代表任意氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌抗體結(jié)合肽，其特征在于^C1為L(zhǎng)或F，&為P 或H，&為P或F，其中L代表亮氨酸，H代表組氨酸。
3.如權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌抗體結(jié)合肽作為結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)中檢測(cè)試劑 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌抗體結(jié)合肽及其應(yīng)用。其氨基酸序列通式為X1X2X3PPFS，其中P代表脯氨酸，F(xiàn)代表苯丙氨酸，S代表絲氨酸，X1～X3代表任意氨基酸。優(yōu)選X1為L(zhǎng)或F，X2為P或H，X3為P或F，其中L代表亮氨酸，H代表組氨酸。上述結(jié)核病人血清特異性抗體結(jié)合多肽能在結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)中作為檢測(cè)試劑予以應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102120758SQ20101059954
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者劉忠華, 楊華, 楊煥森, 秦蓮花, 胡忠義 申請(qǐng)人:上海市肺科醫(yī)院