專利名稱：從豬膽膏或下腳料中直接提取合成熊去氧膽酸的純化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熊去氧膽酸的純化制備方法，特別是涉及一種從豬膽膏或下腳料中直接提取合成熊去氧膽酸的純化制備方法。
背景技術(shù)：
熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic acid)簡稱UDCA,是熊膽的主要成分,其化學(xué)名稱為(3a ,73)-二輕基-53膽燒酸，是鵝去氧膽酸(Chenode oxycholic acid)的7_輕基差向異構(gòu)體。自從20世紀(jì)80年代，發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸具有有效溶解膽固醇性結(jié)石作用以來，不斷有新的研究顯示熊去氧膽酸在利膽、護肝中具有積極的作用。近年來，國外報道了 UDCA不僅對治療原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、慢性活動性肝炎具有良好療效，還可用與治療慢性肝炎和肝移植后排斥反應(yīng)。目前，在臨床上熊去氧膽酸主要應(yīng)用于治療各種肝膽、消化道疾病。隨著分子生物學(xué)、以及熊去氧膽酸基礎(chǔ)和臨床研究的不斷進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸在促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、治療冠心病等方面也有積極作用。因此，隨著研究的深入，熊去氧膽酸的利用價值越來越被認(rèn)識和受到人們的重視，對熊去氧膽酸的需求量也在逐年升高。參見中國專利CN1468103A、CN1770975A。但是，天然熊膽的來源日益減少。人們一直在努力尋求除以天然熊膽獲取熊去氧膽酸之外的替代方法。早期，熊去氧膽酸是通過從牛、羊膽汁中分離提取的膽酸為起始原料，然后經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)方法生產(chǎn)的。其中，制成鵝去氧膽酸后需經(jīng)氧化還原生成熊去氧膽酸。但是，這一方法步驟多、生產(chǎn)時間長、成本高。上世紀(jì)80年代后，酶學(xué)、微生物發(fā)酵方法發(fā)展起來。用酶學(xué)、微生物發(fā)酵方法將鵝去氧膽酸異構(gòu)化，或通過石膽酸-羥基化生產(chǎn)熊去氧膽酸，但是，這種方法仍然具有步驟多、生產(chǎn)時間長、成本高的缺陷。與此同時，化學(xué)合成方法也有了許多創(chuàng)新和改進(jìn)。起始原料除膽酸外，也選用了豬膽酸，豬去氧膽酸，去氧膽酸或其它留體化合物，如膽固醇，黃體酮和植物留醇等生產(chǎn)熊去氧膽酸。但仍然是步驟更多，時間更長，成本更高，更難有生產(chǎn)實際意義。例如，現(xiàn)有技術(shù)中報道了以雄留烯二酮原料。經(jīng)九步反應(yīng)制備熊去氧膽酸的制備方法。(Helvetica. Chimica Acta. 1984. 67 (2) 612),但其價格較貴,合成中進(jìn)側(cè)鏈的難度大。而現(xiàn)有技術(shù)中報道的全合成方法(J. Org. Chem. 1982. 47 (2). 2331)，共有四十余步反應(yīng)，工藝復(fù)雜，不易掌握。還有報道采用4-孕留烯-3，20-二酮(黃體酮)為起始原料，經(jīng)八步反應(yīng)制備熊去氧膽酸的制備方法，但是原始材料4-孕留烯-3，20-二酮(黃體酮)本身是孕激素的藥物，該起始原料的提取較為繁瑣，且生產(chǎn)熊去氧膽酸的制備工藝也較復(fù)雜。王中麒等(《中國科學(xué)》輯1(7) =680-685 1991)報道了從豬去氧膽酸立體選擇性合成熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的新法。在膽汁中，CDCA異構(gòu)化生成HDCA，也許只有瞬間的過程。但用化學(xué)方法從HDCA轉(zhuǎn)化成CDCA需經(jīng)6-7步的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行了研究。分別用NaBH4、NABH4-NICL、KBH4-K0H、K (S-C4H9) 3BH, Al (I-Pro) 3、NA-NICL, LI-CH30H 作還原劑作了比較。收率為37-85%不等。以LI-CH30H:為最好，熊去氧膽酸的收率75%?，F(xiàn)有技術(shù)中還報道了從雞膽汁接種產(chǎn)氣真桿菌和大腸桿菌，ph9.8_10.2，培養(yǎng)12-23小時，轉(zhuǎn)化率25-45%，雞膽汁中鵝去氧膽酸含量為4-5% (雞膽汁中總膽汁酸含量為8-9% )，轉(zhuǎn)化為熊去氧膽酸的1.25-2. 25%，再提取，收率為1_2%，上述方法生產(chǎn)熊去氧膽酸成本高、產(chǎn)量低，不適于生產(chǎn)。1985年，陸其華就提出從豬膽汁中提取分離豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸生產(chǎn)熊去氧膽酸是一舉三得的最經(jīng)濟最有效的方法(《藥學(xué)通報》20(11) =678-681 1985)。1987年，章大公報道了從豬膽汁中分離純化鵝去氧膽酸的方法(《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展》(4)68-711987)，其中在豬膽汁中直接加入NAOH進(jìn)行水解，以酸化的方式得到豬膽汁酸，然后，用乙酸乙脂加活性炭脫色，分離豬去氧膽酸，再從濾液中 經(jīng)甲脂化、乙酰化等步驟分離鵝膽去氧膽酸，并用乙酸乙脂純化。同年，丁新騰等報道了從豬膽汁提取鵝去氧膽酸及豬膽酸方法(《醫(yī)藥工業(yè)》18(9) :416 1987)，也是采用鮮新豬膽汁中直接加NA0H，酸化得到豬膽汁酸的方式，然后經(jīng)甲脂化，用苯(或甲苯)加成物分離豬去氧膽酸。還有報道根據(jù)加拿大專利CA1041479，以豬膽汁和雞膽汁作比較研究，用乙醚提取鵝去氧膽酸，豬膽汁的收率為1.9g/lL(純度為92% );雞膽汁的收率為0.6g/lL(純度為80% )。1988年，沈季銘等報道了豬膽汁中膽烷酸的分離和鑒定方法(《醫(yī)藥工業(yè)》19 (12) =529-530 1988)，從提取膽紅素后的豬膽汁進(jìn)行皂化，接著將所得的豬去氧膽酸用乙酸乙酯重結(jié)晶，其所剩母液用甲醇-硫酸甲酯化，再用硅膠柱層析，用石油醚-丙酮洗脫。相繼獲得3a-羥基-6-氧代-5膽烷酸甲酯(3.5%)，鵝去氧膽酸甲酯(61.8% )，豬去氧膽酸甲酯7.5%，豬膽酸(2.5%)和微量的3a-羥基-6-氧代-5-膽烷酸甲酯等。還有，中國專利200710000103. 8,200810010076. 7等都是先行制備鵝去氧膽酸，
再制備熊去氧膽酸。在各種家禽和家畜中，提取豬去氧膽酸的下腳料，雖然含有鵝去氧膽酸的量較低，15-35 %，但是商品量卻比較大，近似于所提取豬去氧膽酸的一倍以上，而傳統(tǒng)工藝都是先提純?yōu)轾Z去氧膽酸后，至少86% (見中國專利200810010076-7等)，再合成純化熊去氧膽酸。由此可見，為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，有必要在傳統(tǒng)工藝的基礎(chǔ)上，對熊去氧膽酸制備工藝進(jìn)行改進(jìn)創(chuàng)新。直接提取合成最終產(chǎn)品，并純化為合格的藥用熊去氧膽酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種從豬膽膏或下腳料中直接提取合成熊去氧膽酸的純化制備方法。包括直接預(yù)處理，溴氧化或鉻氧化，去除雜質(zhì)，還原制備熊去氧膽酸酸并使其生成專有復(fù)合物結(jié)晶而進(jìn)一步去除雜質(zhì)，水解而制備合格的藥用熊去氧膽酸。本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供了一種從豬膽膏或下腳料中直接提取合成熊去氧膽酸的純化制備方法。解決了現(xiàn)有工藝的不足，直接得到熊去氧膽酸粗品。進(jìn)而得到熊去氧膽酸專有復(fù)合物結(jié)晶，水解得到藥用級熊去氧膽酸。因而，本發(fā)明工藝簡單，成本低廉，適合應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的制備方法包括下述步驟
取豬膽膏(稱之豬膽膏經(jīng)皂化，提取豬去氧膽酸之后使用)，或下腳料(豬膽膏提取豬去氧膽酸之后為下腳料，含有鵝去氧膽酸較低在15-35%范圍)50-200kg為原料，直接預(yù)處理澄清去除非膽酸類雜質(zhì)。溶于15-20倍堿水，加熱，加入1+1天然澄清劑(山東藥圣生物科技有限公司生產(chǎn))，1° /萬-10° /萬，以母液計算。2-4小時，母液澄清，降溫，壓濾、去除非膽酸類雜質(zhì)，蛋白質(zhì)，粘液質(zhì)，外來雜質(zhì)、砂土、重金屬離子，有機殘留等，得澄清母液。降溫調(diào)ph3-4.將上述預(yù)處理的下腳料為原料，溶解于5-15倍量甲醇降溫0-10°C，加入1-3克分子比的溴液，反應(yīng)6-10h之后，加入碳酸鈉5-10%水洗去除薄層層析中鵝去氧膽酸之下的雜質(zhì)膽酸。在堿性醇液中上強堿或弱堿性吸附樹脂去除未水洗干凈的溴酸鹽，次溴酸鹽等雜質(zhì)。得7-酮基石膽酸，含有少量C3、C7-雙酮化合物?；蛘?，用常規(guī)的鉻酸鹽氧化法氧化，之后，上強酸或弱酸性吸附樹脂去除未水洗干 凈的重金屬離子。得7-酮基石膽酸，含有少量C3、C7-雙酮化合物。取上述7-酮基石膽酸，加入金屬鉀鈉或雷尼鎳等，還原，用含氯甲烷或乙烷等有機溶劑去除薄層層析中熊去氧膽酸之上雜質(zhì)膽酸，制備得到熊去氧膽酸粗品。到上述粗品，在有機溶劑中，加入3-6克分子比的六四基二硅烷基胺基鈉鹽，回流
2-10小時，降溫結(jié)晶得到熊去氧膽酸專有復(fù)合物，而進(jìn)一步去除其它雜質(zhì)，水解得到合格的藥用級熊去氧膽酸，含量> 99. 5%。本發(fā)明更好的方法步驟如下直接取提取豬去氧膽酸的豬膽膏或下腳料100公斤加水20倍，加熱，加入1+1天然澄清劑5/萬，4小時，澄清；將上述預(yù)處理的原料，溶于10倍甲醇，(TC加入2克分子比的溴液，反應(yīng)10h。加入碳酸鈉水10%，水洗。上大孔弱堿性吸附樹脂，得7-酮基石膽酸，含有少量C3、C7-雙酮化合物?；蛘?，用常規(guī)鉻酸鹽氧化后，上大孔弱酸性吸附樹脂，得7-酮基石膽酸，含有少量C3、C7-雙酮化合物。取上述7-酮基石膽酸加入金屬鉀、鈉或雷尼鎳等還原，含氯甲烷或乙烷洗滌去除薄層層析中熊去氧膽酸之上雜質(zhì)膽酸，制備得到熊去氧膽酸粗品。到上述粗品，在有機溶劑中，加入3克分子比的六四基二硅烷基胺基鈉鹽，回流2小時，降溫結(jié)晶得到熊去氧膽酸專有復(fù)合物，而進(jìn)一步去除其它雜質(zhì)，水解得到合格的藥用級熊去氧膽酸，含量>99.5%。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明用低含量的豬膽酸或下腳料直接提取合成了熊去氧膽酸粗品，并制備熊去氧膽酸的專有復(fù)合物，而進(jìn)一步去除其它雜質(zhì)。水解得到藥用級熊去氧膽酸。省卻鵝去氧膽酸的進(jìn)一步精制，簡化了工藝，降低了成本，去除了影響產(chǎn)品質(zhì)量的其雜質(zhì)，特別是重金屬離子和溴酸根離子。達(dá)到美國藥典33版和英國藥典2010版標(biāo)準(zhǔn)。


附圖I、豬膽膏、下腳料原料薄層層析示意圖。硅膠G板30*100，展開劑氯仿甲醇冰乙酸=40 : 2 : I。顯色劑20%磷鑰酸乙醇(下同)。I、為豬膽膏，2、為鵝去氧膽酸對照品，3、為下腳料。A、為鵝去氧膽酸以上膽酸類雜質(zhì)，B、為鵝去氧膽酸，C、為鵝去氧膽酸以下膽酸類雜質(zhì)。附圖2、豬膽膏，下腳料氧化畢薄層層析示意圖。I為豬膽膏的氧化物，2為鵝去氧膽酸對照品，3為下腳料的氧化物，D為7-酮基膽石酸。附圖3、豬膽膏下腳料還原畢(熊去氧膽酸)薄層層析示意圖。I、為豬膽膏還原熊去氧膽酸，2、為熊去氧膽酸對照品，3、為下腳料還原熊去氧膽酸。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，其目的在于更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，而非限制本發(fā)明的保護范圍。實施例一、取豬膽膏200公斤、皂化、提取豬去氧膽酸(熔點175°C )之后，下腳料合有30%鵝去氧膽酸。直接預(yù)處理，加20倍堿水，溫度95°C，ph9/10，加入1+1天然澄清劑(III-B，山東藥圣生物科技有限公司生產(chǎn))5/萬(以母液計算)。4小時攪拌，直至澄清，降溫，壓濾，得澄清母液，調(diào)ph3-4。得預(yù)處理原料，加入10倍量甲醇，溶解降溫(TC，加入溴液25公斤，攪拌，8小時，然后，加入碳酸鈉10%堿水溶解洗滌去除薄層層析中鵝去氧膽酸以下雜質(zhì)膽酸。在乙醇溶液中上大孔弱堿性吸附樹脂，去除溴酸根，次溴酸根等，得7-酮基石膽酸，含有少量的C3、C7-雙酮化合物。用金屬鈉還原，用二氯乙烷洗滌得熊去氧膽酸粗品86kg。將粗品86公斤溶于10倍量有機溶劑，加入3克分子比(51. 6kg)六甲基二硅烷基胺基鈉鹽，回流5小時，降溫結(jié)晶，得熊去氧膽酸專有復(fù)合物，水解得到藥用級熊去氧膽酸54. 2kg，含量99. 6%，其它指標(biāo)符合美國藥典33版。實施例2取提取過豬去氧膽酸的下腳料200公斤，含有鵝去氧膽酸15 %，直接預(yù)處理，加18倍堿水，溫度95°C，Ph9/10，加1+1天然澄清劑(III -B,山東藥圣生物科技有限公司生產(chǎn))，10/萬，4小時，攪拌，直至澄清，降溫，壓濾，得澄清母液，調(diào)PH3-4，得預(yù)處理原料。用鉻鹽法氧化得7-酮基石膽酸，含少量C3C7-雙酮化合物。在乙醇溶液中上大孔弱酸性吸附樹脂，去除鉻等重金屬離子了。用雷尼鎳還原，二氯甲烷洗滌得熊去氧膽酸粗品。將粗品62公斤溶于10倍量有機溶劑，加入3克分子比(37kg)六甲基二硅烷基胺基鈉鹽，回流5小時，降溫結(jié)晶，得熊去氧膽酸專有復(fù)合物，水解得到藥用級熊去氧膽酸26kg，含量99. 5%，其它指標(biāo)符合美國藥典33版。
權(quán)利要求
1.一種從豬膽膏或下腳料中直接提取合成熊去氧膽酸的純化制備方法，其特征在于包括下述步驟 取豬膽膏，皂化，提取豬去氧膽酸后的下腳料50-200公斤一鵝去氧膽酸含量較低，為15-35% -直接預(yù)處理。溶于15-20倍堿水，加熱，加入1+1天然澄清劑，1° /萬-10° /萬，2-4小時，母液澄清，去除非膽酸類雜質(zhì)。母液降溫，調(diào)PH3-4。
將上述預(yù)處理的下腳料為原料，溶解于5-15倍量甲醇降溫0-10°，加入1-3克分子比的溴液，反應(yīng)6-10h之后，加入碳酸鈉5-10%水洗去除薄層層析中鵝去氧膽酸之下的雜質(zhì)膽酸類。在堿性醇液中上強堿或弱堿性吸附樹脂去除未水洗干凈的溴酸鹽次溴酸鹽等雜質(zhì)。得7-酮基石膽酸，含有少量C3、C7-雙酮化合物。或者，用常規(guī)的鉻酸鹽氧化法氧化，之后，上強酸或弱酸性吸附樹脂去除未水洗干凈的重金屬離子。得7-酮基石膽酸，含有少量C3、C7-雙酮化合物。
取上述7-酮基石膽酸，加入金屬鉀鈉或雷尼鎳等，還原，用含氯甲烷或乙烷等有機溶劑去除薄層層析中熊去氧膽酸之上雜質(zhì)膽酸，制備得到熊去氧膽酸粗品。
在有機溶劑中加入I : 3-6克分子比的六甲基二硅烷基胺基鈉鹽，回流，2-10小時，降溫結(jié)晶得到熊去氧膽酸的專有復(fù)合物，水解得到藥用級熊去氧膽酸。含量> 99. 5%。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的從豬膽膏或下腳料中直接提取合成鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸的制備方法，其特征在于包括以下步驟 直接取提取豬去氧膽酸之后的豬膽膏或下腳料100公斤加水20倍，加熱，加入1+1天然澄清劑5/萬，4小時，澄清； 將上述預(yù)處理的原料，溶于10倍甲醇，(TC加入等克分子比的溴液反應(yīng)10h。加入碳酸鈉水10%水洗。上大孔弱堿性吸附樹脂，得7-酮基石膽酸，含有少量C3、C7-雙酮化合物?；蛘?，用常規(guī)鉻酸鹽氧化后，上大孔弱酸性吸附樹脂，得7-酮基石膽酸，含有少量C3、C7-雙酮化合物。
取上述7-酮基石膽酸，加入硼氫化鈉、鉀等，還原，用含氯甲烷或乙烷水洗滌去除薄層層析中鵝去氧膽酸之上的雜質(zhì)膽酸，制備得到鵝去氧膽酸。
取上述7-酮基石膽酸加入金屬鉀、鈉或雷尼鎳等還原，用含氯甲烷或乙烷洗滌去除薄層層析中熊去氧膽酸之上雜質(zhì)膽酸，制備得到熊去氧膽酸粗品。
取上述熊去氧膽酸粗品，在有機溶劑中，加入3克分子比的六甲基二硅烷基胺基鈉鹽，回流5小時，降溫，結(jié)晶，得熊去氧膽酸的專有復(fù)合物。水解得藥用級熊去氧膽酸，含量99.5%。其它質(zhì)量指標(biāo)附合美國藥典33版。
3.根據(jù)權(quán)利要求I.2所述的從豬膽膏或下腳料中直接提取合成去氧膽酸的純化制備方法，其特征在于預(yù)處理澄清工藝是去除非膽酸類雜質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、機械雜質(zhì)、砂土、重金屬離子、有機殘留、農(nóng)藥殘留等。
4.根據(jù)權(quán)利要求I.2所述的從豬膽膏或下腳料中直接提取合成熊去氧膽酸的純化制備方法，其特征在于氧化工藝是去除薄層層析中鵝去氧膽酸之下膽酸類雜質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I.2所述的從豬膽膏或下腳料中直接提取合成熊去氧膽酸的純化制備方法，其特征在于還原工藝是去除薄層層析中鵝去氧膽酸或熊去氧膽酸之上的膽酸類雜質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I.2所述從豬膽膏或下腳料中直接提取合成熊去氧膽酸的純化制備方法，其特征在于熊去氧膽酸粗品，在有機溶劑中，加入了 3-6克分子比的六甲基二硅烷基胺基鈉鹽，回流2-10小時，降溫，結(jié)晶得到熊去氧膽酸的專有復(fù)合物。水解得藥用級熊去氧膽酸，含量> 99。5 %，其它質(zhì)量指標(biāo)附合美國藥典33版。全文摘要
本發(fā)明提供一種從豬膽膏或下腳料中直接提取合成熊去氧膽酸的純化制備方法。用低含量15-35％的豬膽膏或下腳料，經(jīng)過預(yù)處理去除非膽酸類雜質(zhì)；溴氧化或鉻氧化，去除薄層層析中鵝去氧膽酸以下膽酸類雜質(zhì)；常規(guī)還原去除薄層層析中熊去氧膽酸以上膽酸類雜質(zhì)；制備熊去氧膽酸專有復(fù)合物結(jié)晶，水解得到藥用級熊去氧膽酸。
文檔編號C07J9/00GK102702294SQ201010604579
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者于露, 葉亮, 吳紫夢, 吳茂芝, 周平宏, 曹汝成, 曹雪松, 畢一天, 畢小升, 畢思賓 申請人:畢思賓